КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2003 года по МПК C12N5/08 A61K35/12 C12N5/08 C12R1/91 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей или органов. Такие клетки способны сохранять при соответствующих условиях культивирования свои физиологические функции. Умение культивировать клетки in vitro в достаточном количестве дает возможность использовать их в клинической практике.

Известно, что только несколько типов клеток нормальных тканей успешно размножаются in vitro; в основном это клетки, происходящие из соединительных тканей. К их числу относятся фибробласты, миобласты, клетки эндотелия, выстилающие камеры сердца, лимфатические и кровеносные сосуды, а также мезотелиальные клетки, выстилающие брюшную и плевральную полости.

Известно, что культивированные трансплантаты используются в различных случаях:
для лечения обширных ожогов III степени;
для регенерации эпидермиса;
для регенерации ротового эпителия;
для коррекции врожденных дефектов пениса;
для создания эпителиальной выстилки полости яичек сосцевидного отростка;
для лечения хронических кожных язв;
для репарации мочевого тракта;
для лечения диабета;
для восстановления функций печени;
для лечения мышечных заболеваний и др. (ж. "Инновации", 2000, 1-2, с. 94-96).

Известны биосовместимые синтетические внеклеточные матрицы для тканевой инженерии (РЖ Медицина, реф. 5913, МПК F 23 G 5/00, 1999, 10). Тканевая инженерия может заменить пересадку органов и тканей, которых нет в достаточном для всех нуждающихся количестве. Трансплантация клеток с использованием биодеградируемых синтетических внеклеточных матриксов создает возможность формирования полностью натуральных новых тканей и таким образом замещает потерю или недостаток функций органов и тканей. Синтетические внеклеточные матриксы служат в качестве "лесов" для организации новой ткани.

Известен способ регенерации тканей зубов и ротовой полости (пат. США 5585829, С 12 N 5/00; С 12 N 5/02) путем культивирования ex vivo живых клеток на матриксе для использования в медицине для тестирования in vitro токсичности и биосовместимости материалов.

Известен способ культивирования клеток для тканевой терапии, необходимых для восстановления функций поврежденного органа или ткани, клетки для культивирования выделяются из организма пациента или донора. После культивирования имплантату придается необходимая форма, и он пересаживается больному. Для улучшения реваскуляции имплантата используются различные стимуляторы роста пролонгированного действия (РЖ "Биотехнология", реф. 00.01-ОЧР1.353, 2000, 1) - (ПРОТОТИП).

Недостатками известных технических решений являются:
недостаточная интеграция живых клеток в организме реципиента;
большие сроки культивирования;
использование дорогостоящих материалов: среды роста, стимуляторов и т.п.

Целью изобретения является создание биопротезов, содержащих живые клеточные элементы, которые хорошо интегрируются в организме реципиента; сокращение сроков культивирования, расширение номенклатуры исходных материалов для создания биопротезов для терапевтического лечения при помощи трансплантатов дефектов кожи, хряща, кровеносных сосудов, ткани головного мозга, кишечника, кости, мочевого пузыря, мочеточника, мочеиспускательного канала, печени, сердца и др.

Для решения поставленной задачи предлагается клеточная культура для заместительной терапии, отличающаяся тем, что в качестве культуры клеток она содержит штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека, например штамм ЛЭЧ-4(81).

Культура представляет собой морфологически однородную популяцию клеток с ограниченным сроком жизни, определенного тканевого происхождения, сохраняющую стабильный кариотип (2n не менее 75% клеток), свободную от посторонних агентов, онкогенно безопасную, культивируемую на искусственных питательных средах в стандартных бутылках для кровезаменителей.

Препарат выпускается в виде монослойной культуры в виде взвеси для немедленного использования и в виде клеток на синтетической подложке типа "Фолидерм", "Биоколл", "Полипор" и т.п.

Монослойная культура имеет вид морфологически однородного слоя клеток, прикрепленных к стеклу и покрытых прозрачной питательной средой красно-оранжевого цвета.

Культуральная взвесь представляет собой мутную жидкость красновато-оранжевого цвета, содержащую 500-600 тыс. клеток в 1 мл.

Препарат в виде клеток на синтетической подложке представляет собой пленочное синтетическое покрытие для ран общей площадью 60-80 см², на поверхности которого выращены клетки с плотностью 80-100 тыс. на 1 см², размещенное в стандартном флаконе для кровезаменителей объемом 250 мл. Покрытие и клетки находятся в прозрачной культуральной среде.

Работу с препаратом проводят в стерильных условиях. До вскрытия бутылок с клетками обращают внимание на их целостность и концентрацию ионов в среде (рН). В случае имеющихся трещин или изменения рН среды ниже 7,0 культуру в работу не берут.

Культура клеток в виде монослоя используется для получения взвеси клеток. Перед работой горло бутылки обжигают спиртовым факелом, вскрывают стерильно у огня и сливают содержащую среду. В бутылку вносят по 10-15 мл 0,02%-ного раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина (в соотношении 1: 1) и оставляют для контакта с клетками на 2-3 мин. Растворы сливают, а клетки заливают стерильными буферными растворами Эрла, Хенкса или стерильным изотоническим физиологическим раствором в количестве 50 мл, затем встряхивают до образования гомогенной взвеси.

Взвесь центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, супернатант сливают, а осадок разводят указанными буферными растворами до концентрации 40±10 тыс. клеток, после чего наносят на специально подготовленную рану.

Из флакона с пленочным покрытием сливают культуральную жидкость, заливают стерильным раствором Эрла или Хенкса (или стерильным изотоническим физиологическим раствором) на 5-10 мин. После обработки пленочное покрытие наносят на подготовленную рану поверхностью с клетками к ране.

Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) разработан Екатеринбургским научно-исследовательским институтом вирусных инфекций (А.С. СССР 1147748), он зарегистрирован в качестве оригинального и сохраняется в низкотемпературном банке-музее заявителя.

Аллофибробласты выращены в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ.

Использование культивированных фибробластов в заместительной терапии не требует дорогостоящих питательных сред, стимуляторов роста, что снижает их себестоимость более чем в 20 раз; фибробласты легко поддаются пассированию, при котором они частично утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости; применение культуры фибробластов открывает возможность использования для изготовления трансплантатов аллоклеток и создания клеточных банков; сокращаются сроки получения трансплантатов, готовых к использованию в клинике, с 3 недель до 2-3 суток.

Клеточные культуры могут использоваться в системе лечения ожоговых больных, а также больных с травмами опорно-двигательного аппарата, при восстановлении и коррекции функций поврежденных тканей и органов.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей или органов, способных сохранить при соответствующих условиях культивирования физиологические функции. Этим требованиям отвечает известный штамм ЛЭЧ-4(81) - штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека, который используют для заместительной терапии. Клеточную культуру используют в виде взвеси или в виде клеток на синтетической подложке для лечения ожоговых больных, больных с травмами опорно-двигательного аппарата, при восстановлении и коррекции функций поврежденных тканей и органов. Применение ЛЭЧ-4(81) в медицине обеспечивает создание биопротезов, которые хорошо интегрируются в организме реципиента, и снижение их себестоимости.

Применение штамма диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81) в качестве клеточной культуры для заместительной терапии.