СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ В КУЛЬТУРЕ Российский патент 2006 года по МПК C12N5/16 

Изобретение относится к области медицины, в частности к морфологическим исследованиям культивируемых клеток, а именно к способам стимуляции роста фибробластов в культуре.

В настоящее время актуальным является вопрос формирования у обожженных полноценной структуры, а также восстановления функций кожи путем создания in vitro сложных структур и композиций из различных видов клеток, переносимых на раневые поверхности.

Процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов у таких больных происходят лучше в присутствии трансплантированных фибробластов. Клетки для трансплантации получают из донорского материала: кожи абортусов в возрасте 8-11 недель и кожи взрослых доноров обоего пола без ограничения возраста. Фрагменты кожи измельчают до размера 0,5 мм и после обработки 0,25% раствором трипсина помещают в культуральные пластиковые флаконы ″CORNING″ и ″COSTAR″ объемом 50 мл, в которые затем добавляют ростовую среду ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Флаконы плотно закрывают пробкой и интубируют в термостате при 37°C. После того как вырастающие из кусочков кожи клетки покрывают всю свободную поверхность дна флакона, их снимают при помощи 0,25% раствора трипсина и пересевают в соотношении 1:2.

Но с увеличением возраста донора уменьшаются пролиферативные потенции клеток, что проявляется в задержке выхода первичных клеток из эксплантата, длительном времени удвоения клеток культуры, необходимости увеличения посадочной дозы при пересеве. То же происходит и с увеличением ″возраста″ клеток культуры. Кроме того, большую трудность представляет получение фибробластов из кожи ожеговых больных при необходимости пересадки им аутологичных клеток.

В этих случаях производят активизацию пролиферации клеток в культуре, в том числе фибробластов, путем применения фактора роста фибробластов, эпидермального фактора роста, фактора роста кератиноцитов, инсулина, прогестерона, гидрокортизона и некоторых других (Р. Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. Москва. ″Мир″, 1983, с.18-23).

Данный способ принят за прототип.

При всех неоспоримых преимуществах и достоинствах известного способа следует отметить высокую стоимость реактивов и, как следствие, высокие экономические затраты, связанные со сложным технологическим процессом выращивания фибробластов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности стимуляции роста фибробластов в культуре путем удешевления процесса стимуляции, снижения экономических затрат и повышения плотности фибробластов за единицу времени.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе стимуляции роста фибробластов в культуре, основанном на использовании факторов воздействия, на первичную культуру фибробластов непрерывно в течение 5 минут воздействуют электромагнитным излучением с частотой импульсов 73±3,0 Гц и с амплитудой импульсов не менее 50 В.

Способ стимуляции роста фибробластов в культуре осуществляют следующим образом.

На монослой медленно растущей первичной культуры фибробластов воздействуют в непрерывном режиме в течение 5 минут электромагнитным излучением с частотой импульсов 73±3,0 Гц и с амплитудой импульсов не менее 50 В.

Под действием электромагнитного излучения часть клеток гибнет, слущивается и разрушается, в результате в культуральную среду выходят биологически активные вещества, содержащиеся в цитоплазме, которые активируют пролиферацию прикрепленных фибробластов. Из таблицы видно, что время удвоения клеток в облученной культуре уменьшается в 1,5 раза, а плотность клеток, достигаемая за одинаковое время, достоверно увеличивается по сравнению с контролем; при этом трансформации клеток не происходит. Клетки в культуре до 20-30 пассажа сохраняли характерные для нормальных фибробластов форму, размеры, структуру цитоплазмы, ядерно-цитоплазменные отношения.

Кол-во случаевИсходная плотность клеток, кл/0,1 мм²ВоздействиеПлотность клеток через 48 ч,
кл/0,1 ммПлотность через 96 ч, кл/0,1 мм²Контроль2065,3±1,2-88,4±2,1132,3±1,9Опыт2063,2±0,9-119,7±2,3206,2±2,7

Использование данного способа способствует повышению увеличения плотности фибробластов за единицу времени без использования дорогостоящих реактивов. Возможно использование данного способа для стимуляции роста других механоцитов в культуре, таких как остеобласты, стромальные клетки костного мозга, иммуннокомпетентных органов (лимфоузлы, селезенка, тимус), хондробласты, всех клеток сухожильной и жировой тканей, миофибробластов и гладкомышечных клеток.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к морфологическим исследованиям культивируемых клеток, и может быть использовано для стимуляции роста фибробластов в культуре. На первичную культуру фибробластов непрерывно в течение 5 минут воздействуют электромагнитным излучением с частотой импульсов 73±3,0 Гц и с амплитудой импульсов не менее 50 В. Изобретение позволяет повысить эффективность роста и увеличить плотность фибробластов в культуре. 1 табл.

Способ стимуляции роста фибробластов в культуре, основанный на использовании факторов воздействия, отличающийся тем, что на первичную культуру фибробластов непрерывно, в течение 5 мин воздействуют электромагнитным излучением с частотой импульсов (73±3,0) Гц и с амплитудой импульсов не менее 50 В.