СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СТИМУЛЯЦИИ КОЛЛАГЕНОГЕНЕЗА БИОПЛАСТИЧЕСКИМИ МАТЕРИАЛАМИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/68 C12N5/08 A61K35/36 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинико-диагностическим исследованиям количественной оценки стимуляции коллагеногенеза биопластическими материалами.

Известно, что для восстановления поврежденных участков кости, реконструкции ее анатомической целостности широко используют в настоящее время биоимплантаты - пластические материалы биологического (брефоостеоматрикс, костная ткань, твердая мозговая оболочка) и неорганического происхождения (гидроксиапатит).

Преимуществом биоимплантатов являются их остеоиндуктивные свойства. В ряде экспериментальных моделей на животных показано, что их введение животным вызывает стимуляцию процессов регенерации костной ткани.

Так как основным белком соединительной, в том числе и костной ткани, является коллаген, то стимуляция регенераторных процессов, с точки зрения функционального подхода, проявляется в стимуляции способности клеток соединительной ткани и костной ткани синтезировать коллаген.

Известен способ количественной оценки стимуляции коллагеногенеза в эксперименте на животных, осуществляемый следующим образом. Группе подопытных животных - белых беспородных половозрелых крыс - вводили аллогенный гидроксиапатит, крысам второй группы трансплантировали стерильный аллогенный деминерализованный костный матрикс (ДКМ), крысам третьей группы осуществляли одновременную трансплантацию ДКМ и гидроксиапатита, крысам четвертой группы трансплантировали ДКМ и производили инъекции аллогенного гидроксиапатита. При этом подопытных животных содержали в виварии в течение двух месяцев.

Далее забивали животных и производили у них забор крови. В плазме забранной у животных крови определяли концентрацию свободного и белковосвязанного оксипролина.

В крови животных второй и четвертой групп происходило увеличение концентрации белковосвязанного оксипролина, а более выраженное увеличение концентрации белковосвязанного оксипролина наблюдалось у четвертой группе по сравнению с контрольной группой животных (Власов М.Ю. Влияние внутримышечных инъекций гидроксиапатита на обмен коллагена. Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. №4(26), Самара, 2002, с.157-161).

Данный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатком известного способа является то обстоятельство, что с точки зрения биоэтики неправомерно производить забой подопытных животных, подвергаемых данным экспериментальным исследованиям, если можно этого избежать. При этом приобретение лабораторных животных и их содержание в виварии является дорогостоящим. Кроме этого, биоимплантат, полученный из человеческой ткани и вводимый лабораторному животному, является для последнего ксеногенным.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание предлагаемого изобретения, является упрощение и удешевление проведения способа путем биохимического определения белковосвязанного оксипролина без использования лабораторных животных.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе количественной оценки стимуляции коллагеногенеза биопластическими материалами, основанном на определении концентрации белковосвязанного оксипролина, помещают биопластический материал, например брефоостеоматрикс, в культуральную жидкость в культуру дермальных фибробластов, культивируют фибробласты вместе с биопластическим материалом в течение 4 суток, после чего производят забор культуральной жидкости, определяют в ней концентрацию белковосвязанного оксипролина, далее по большей или меньшей степени увеличения концентрации белковосвязанного оксипролина в забранной культуральной жидкости судят о степени стимуляции коллагеногенеза исследуемым биопластическим материалом.

В качестве биопластического материала также может быть использована костная ткань, полученная из кости взрослого человека, или твердая мозговая оболочка.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследование проводят на первичной культуре дермальных фибробластов человека 4-8 пассажа. Фибробласты после пересева выращивают в культуральном флаконе площадью 25 см² в 5 мл культуральной жидкости в течение 2 суток до образования монослоя.

Затем, после смены культуральной жидкости на свежую на слой фибробластов помещают образец биопластического материала (например, брефоостеоматрикса) размером 10×10×3 мм и культивируют фибробласты вместе с брефоостеоматриксом в течение 4 суток. Одновременно такой же образец исследуемого биопластического материала помещают в другой культуральный флакон с культуральной жидкостью, но не содержащий фибробластов, на тот же срок. Данная проба служит контролем. После этого производят забор культуральной жидкости из опытного и контрольного флакона и определяют в ней концентрацию белковосвязанного оксипролина по известному методу: (Крель А.А., Фурцева Л.Н. Методы определения оксипролина в биологических жидкостях и их применение в клинической практике // Вопр. мед. химии. 1968. №6. С.635-640).

При увеличении концентрации белковосвязанного оксипролина в культуральной жидкости по сравнению с контрольной пробой делают вывод о способности исследуемого биопластического материала стимулировать регенерацию костной ткани. При этом чем более выражено увеличение концентрации белковосвязанного оксипролина в культуральной жидкости, тем более выражена способность исследуемого биопластического материала стимулировать регенерацию костной ткани.

В проведенных исследованиях наиболее значительное усиление образования белковосвязанного оксипролина вызывал брефоостеоматрикс, меньше - костная ткань, полученная из кости взрослого человека, еще в меньшей степени - твердая мозговая оболочка.

Изобретение относится к области медицины. Сущность способа: помещают биопластический материал в культуральную жидкость с культурой дермальных фибробластов и культивируют фибробласты вместе с биопластическим материалом в течение 4 суток, после чего производят забор культуральной жидкости и определяют в ней концентрацию белковосвязанного оксипролина. О степени стимуляции коллагеногенеза исследуемым биопластическим материалом судят по большей или меньшей степени увеличения концентрации белковосвязанного оксипролина в забранной культуральной жидкости по сравнению с контрольной пробой. В качестве контрольной пробы используют культуральную жидкость, в которой в течение 4 суток находился исследуемый биопластический материал, но отсутствовали фибробласты. Способ прост в исполнении, позволяет количественно оценить стимуляцию коллагеногенеза биопластическими материалами без использования лабораторных животных.

Способ количественной оценки стимуляции коллагеногенеза биопластическими материалами, основанный на определении концентрации белковосвязанного оксипролина, отличающийся тем, что помещают биопластический материал в культуральную жидкость с культурой дермальных фибробластов и культивируют фибробласты вместе с биопластическим материалом в течение 4 суток, после чего производят забор культуральной жидкости, определяют в ней концентрацию белковосвязанного оксипролина, далее по большей или меньшей степени увеличения концентрации белковосвязанного оксипролина в забранной культуральной жидкости по сравнению с контрольной пробой, которая представляет собой культуральную жидкость, в которой в течение 4 суток находился исследуемый биопластический материал, но отсутствовали фибробласты, судят о степени стимуляции коллагеногенеза исследуемым биопластическим материалом.