Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного Российский патент 2019 года по МПК A61K35/51 C12N5/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии выделения, культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины.

Известен способ получения фибробластов из пуповины новорожденного, полученной при нормальных родах женщин на 39-40 недели гестации [1]. Недостатками способа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс по получению суспензии клеток из донорского материала.

Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного, полученного при нормальных родах на 39-40 недели гестации [2]. После отмывки донорского материала от крови и слизи, разрезают пупочный канатик ручным способом на фрагменты, повторно промывают их раствором Хенкса, измельчают фрагменты гомогенизатором до однородной массы; проводят ферментативную обработку, используя 0,075% коллагеназу I типа и коллагеназу IV типа (соотношение концентраций ферментов 1:1 в объемной пропорции 1:5) в течение 8-10 часов при 37° и периодически помешивая содержимое пробирок; пропускают в новую центрифужную пробирку полученный субстрат через двойное сито для клеток; центрифугируют в течение 8 минут при 1000 об./мин; получают осадок фибробластоподобных клеток, который ресуспендируют в культуральной среде с добавлением основного фактора роста фибробластов; подсчитывают общее количество полученных клеток в камере Горяева, вносят клетки в чашки Петри в посевной дозе 8-15×10³/см²; при достижении 70-80% конфлюентности монослоя, клетки пересевают, культивируют до 4-6 пассажа, при этом клетки сохраняют свой диплоидный кариотип и высокую пролиферативную активность. Данный способ взят за прототип.

Недостатками прототипа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс получения суспензии клеток с использованием ручного труда; применение в процессе обработки пупочного канатика ферментов нескольких типов; недостаточная инактивация ферментов при отмывке; расчет посевной дозы, исходя от общего числа полученных клеток, а не от жизнеспособных.

Целью изобретения является создание способа получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного.

Эта цель достигается тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения, пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в CO₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Забор пуповины у обследованных женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения проводят для того, чтобы исключить контаминацию донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях. Лабораторный миксер применяют в процессе измельчения донорского материала для того, чтобы исключить трудоемкий ручной процесс по измельчению пуповины. 0,2% коллагеназу из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» применяют в процессе ферментативной обработки пуповины потому, что она обладает высокой коллагенолитической активностью (до 750 ЕД/мг по Мандлу) и не уступает по своему действию нескольким ферментам.

Термошейкер в процессе ферментативной обработки тканей применяют для того, чтобы она проходила при постоянном равномерном перемешивании среды и лучшем взаимодействии тканей с коллагеназой, создавая при этом оптимальные условия для выхода клеток. Кроме того, использование термошейкера исключает ручной труд по перемешиванию среды. Холодовое центрифугирование позволяет поддержтвать заданную температуру и не оказывает повреждающего воздействия на клетки. Подсчет полученных клеток в камере Горяева проводят для того, чтобы рассчитать посевную дозу жизнеспособных клеток для внесения их в культуральный флакон.

Кондиционированную среду используют при пересевах в процессе культивирования добавляя ее к свежей потому, что она содержит физиологически активные продукты жизнедеятельности культивируемых в ней клеток, данная среда оптимизирует процессы пролиферации клеток на ранних этапах культивирования, обеспечивает накопление клеток в необходимом количестве.

Способ осуществляется следующим образом. Забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают на фрагменты при помощи лабораторного миксера. Измельченную ткань переносят в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость утилизируют. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего. Высевают клетки в дозе 1×105 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой. Эту среду центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую аналогичную среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Способ иллюстрируется клиническим примером. У здоровых женщин после рождения детей путем кесарева сечения забирали фрагменты пуповин (7-10 см). Получение и культивирование фибробластоподобных клеток из донорского материала было выполнено по разработанному способу. Характеристика полученных линий фибробластоподобных клеток приведена в таблице 1. Клеток имели высокий индекс адгезии (88±0,2% - 90,5±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,5±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 89,5 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденных может использоваться в специализированных лабораториях культур клеток для получении клеточных продуктов для регенераторной медицины:, в исследовательских целях для тестирования in vitro.

Информационные источники

1. Патент RU 22308957. от 27.10.2007 «Способ получения препарата для мезотерапии и препарат, полученный этим способом» Ярыгин К.Н.

2. Патент RU 2384618 от 27.03.2008 «Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного» Сабурина И.Н, Исаев А.А., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Кошелева Н.В., Мелихова B.C., Приходько А.В.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного. Для этого проводят забор пуповины у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи. Удаляют кровеносные сосуды. Оставшуюся ткань измельчают, переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1 и центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге в течение 20 минут. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде и подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток. Высевают клетки в культуральный флакон. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе и смену среды проводят каждые 5 суток культивирования. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. Изобретение позволяет получать фибробластоподобные клетки без риска контаминации условно-патогенной флорой. 1 табл.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного, включающий забор и подготовку пуповины; ее механическое измельчение; ферментативную обработку; выделение суспензии клеток в результате процессов фильтрования и центрифугирования, отличающийся тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения; пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.