СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕСТОЗА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к акушерству.

Известен способ доклинической диагностики гестоза на сроках 13-14 недель беременности, основанный на определении антифосфолипидных антител в сыворотке крови [патент RU 2135999 C1, G 01 N 33/53, выдан в 1999]. При этом определяют уровень Ig M и Ig G к кардиолипину, фосфатидилсерину и фосфатидилхолину. При увеличении уровня хотя бы одного из антител в 1,5 раза и более относительно нормы диагностируют развитие гестоза.

Недостатком данного способа является его низкая специфичность, так как повышение уровней антифосфолипидных антител наблюдается и при других видах патологии.

Другой известный способ прогнозирования развития гестоза основан на определении устойчивости эритроцитов к перекисному гемолизу, инициированному двухвалентным железом и гемолизатом аутокрови [патент RU 2191384 С2, G 01 N 33/52, выдан в 2002]. При этом за 2-4 недели до появления клинических признаков гестоза время устойчивости эритроцитов составляет менее 150 с; при показателе более 150 с гестоз у беременных не развивается. Этот способ также недостаточно точен, так как на устойчивость эритроцитов к гемолизу влияют и ряд других нарушений.

Наиболее близким к предлагаемому способу прогнозирования гестоза, начиная с 20 недель беременности, является определение содержания В-лимфоцитов, несущих на своей поверхности структуры, реагирующие с трофобластическим бета1-гликопротеином [патент RU 2077722 C1, G 01 N 33/50, выдан в 1997]. При величине показателя 18% и более прогнозируется развитие гестоза у беременных женщин.

Недостатком данного способа является сравнительно невысокая точность, связанная с его недостаточно высокой специфичностью.

Задачей изобретения является повышение точности прогнозирования развития гестоза у беременных женщин за счет более высокой специфичности способа.

Поставленная задача достигается путем определения концентрации антител к нейроспецифической енолазе (NSE) и глиофибриллярно-кислому протеину (GFAP) (анти-NSE-антител и анти-GFAP-антител) в сыворотке крови беременных, и при уровне анти-NSE-антител более 0,6 мкг/мл или анти-GFAP-антител более 0,9 мкг/мл прогнозируют развитие гестоза.

Способ основан на патогенетическом факторе развития гестоза, который обусловлен развитием острого эндотелиоза вследствие проникновения нейроспецифических белков мозга плода в материнский кровоток, выработки нейроспецифических антител и образования иммунных комплексов, повреждающих эндотелий.

Способ практически осуществляют следующим образом.

У беременной производят забор периферической венозной крови в объеме 2 мл, затем в сыворотке крови определяют уровень антител к NSE и GFAP методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

При проведении ИФА в ячейки полистирольных планшетов вносили по 50 мкл растворов NSE и GFAP в каждую лунку (в концентрации 5 мкг/мл), приготовленных на карбонатном буфере с рН 9,6. Планшеты активировались в течение 12 часов при 4°С (за это время происходит адсорбция антигенов на поверхности полистирольной твердой фазы дна и стенок ячеек). Затем проводили отмывку ячеек раствором PBS (в 1 л раствора: 8,0 г NaCl, 0,2 г КН₂PO₄, 2,9 г Na₂HPO₄, 0,2 г KCl и 0,5 мл Твина-20, рН 7,4) - 3-кратно по 3 минуты. Для исключения неспецифических реакций в каждую ячейку вносили по 200 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (1% BSA в PBS) и инкубировали при 37°С 1 час. После чего ячейки вновь отмывались описанным выше способом.

После промывки в ячейки вносили по 50 мкл исследуемых сывороток (разведенных 1:10 в PBS); в отдельные ряды ячеек вносили стандартные пробы с известной концентрацией моноклональных антител к NSE и GFAP (в виде 7-точечной калибровки со ступенчатым разведением в PBS). Инкубацию осуществляли при 37°С 1 час. За это время происходит связывание антител исследуемых сывороток с адсорбированными антигенами. Несвязавшиеся белки отмывали тем же отмывочным буфером. В ячейки вносили разведенный конъюгат фермента по 50 мкл (конъюгат к Ig G человека разводили PBS в соотношении 1:4000), инкубировали 1 час при 37°С и вновь промывали 5-кратно по 3 минуты. В качестве субстрата для проявления ферментативной активности пероксидазы использовали ортофенилендиамин. Субстрат для пероксидазы готовили непосредственно перед внесением и вносили в лунки по 50 мкл (4 мг ортофенилендиамина, 10 мл субстратного буфера, 4 мкл Н₂О₂). Реакция развивалась 10-15 минут и характеризовалась появлением желтой окраски различной интенсивности в лунках, содержащих калибровку и исследуемые образцы. Затем реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение оптической плотности растворов в каждой ячейке планшетов производили с помощью плашечного ридера "TECAN" (Австрия) при длине волны 492 нм. Построение калибровочного графика и конечный расчет концентрации анти-NSE- и анти-GFAP-антител производили по стандартной для ИФА технологии.

При физиологической беременности (контрольная группа относительно здоровые беременные) антитела к NSE и GFAP не определяются либо их уровень не превышает 0,6 мкг/мл и 0,9 мкг/мл соответственно. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица.
Концентрация аити-NSE-антител и анти-GFAP-антител в сыворотке крови беременных женщин. N (кол-во наблюдений)Анти-NSE-аититела, мкг/млАнти-GFAP-антитела, мкг/млЖенщины с физиологическим течением беременности300-0,6000-0,900Беременные, у которых прогнозировался и развился гестоз290,610-2,7100,910-3,203Беременные, у которых прогнозировался и не развился гестоз10,6150,904

Пример 1. Беременная Г., 35 лет. Настоящая беременность 2-я. Первая беременность закончилась своевременными родами в сроке 39 недель и рождением доношенного ребенка с массой тела 4000 г, ростом 53 см, оценкой по шкале Апгар 8/8 баллов. При первой беременности в третьем триместре диагностирован гестоз легкой степени (нефропатия I степени). Проводилось общепринятое лечение. При настоящей беременности женщина отнесена в группу риска по развитию гестоза. Настоящая беременность протекает без осложнений. В сроке 23-24 недели объективно: АД - 110/70 мм рт.ст., отеки и белок в моче отсутствуют, прибавка массы тела 300 г за неделю. Биохимический анализ крови в пределах нормы. Жалоб при осмотре не предъявляет.

По данным УЗИ: беременность 23-24 недели, матка в нормальном тонусе, состояние плода соответствует гестационному сроку.

Поставлен диагноз: беременность 23-24 недели, группа риска по развитию гестоза.

Проведено исследование периферической крови в сроке 24 недели на наличие нейроспецифических антител. Концентрация антител к нейроспецифической енолазе составила 2,2 мкг/мл, к глиофибриллярно-кислому протеину - 2,8 мкг/мл, что позволяет прогнозировать развитие гестоза.

При обследовании в сроке 29-30 недель у беременной Г. отмечены повышение АД до 130/90-140/90 мм рт.ст., отеки голеней, патологическая прибавка массы тела до 400 г за 1 неделю, появление белка в моче 0,66 г/л. Беременная Г. госпитализирована в стационар с диагнозом гестоз легкой степени. Была проведена патогенетическая терапия. Беременность закончилась родами в сроке 38 недель и рождением доношенной гипотрофичной девочки массой 2700 г, ростом 50 см, оценкой по шкале Апгар 7/8 баллов.

Пример 2. Беременная Л., 31 год. Из соматического анамнеза - нарушение жирового обмена II степени, нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу. Гинекологический анамнез не отягощен. Настоящая беременность первая. При осмотре жалоб не предъявляет.

Объективно в сроке 22-23 недели: АД 120/80 мм рт.ст., белка в моче нет, отеков нет, прибавка массы тела за неделю составляет 250 г. По данным УЗИ - беременность 22-23 недели, состояние плода соответствует гестационному сроку.

Поставлен диагноз: беременность 22-23 недели, нарушение жирового обмена II степени, нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу, группа риска по развитию гестоза.

Концентрация антител к нейроспецифической енолазе - 1,3 мкг/мл, к глиофибриллярно-кислому протеину - 1,4 мкг/мл, что позволяет прогнозировать развитие гестоза.

При обследовании в сроке 34 недели у беременной Л. объективно: АД 130/90, отеки голеней, кистей рук, белок в моче - 0,99 г/л, патологическая прибавка веса - 370 г за 1 неделю.

Беременная Л. госпитализирована в стационар с диагнозом гестоз легкой степени. Проведено патогенетическое лечение. Беременность закончилась родами в сроке 40 недель и рождением доношенной девочки массой 3200 г, ростом 50 см, оценкой по Апгар 7/8 баллов.

Пример 3. Беременная У., 30 лет. Из соматического анамнеза - нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу, гепатит А. Настоящая беременность 2-я. Первая беременность закончилась медицинским абортом в 8 недель, без осложнений.

Объективно в сроке 21-22 недели: АД 100/60 мм рт.ст. Анализ мочи - в норме. Отеков нет. Прибавка массы тела соответствует норме. По данным УЗИ - беременность 21-22 недели, плод соответствует гестационному сроку.

Поставлен диагноз: беременность 21-22 недели, нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу, группа риска по развитию гестоза.

Концентрация антител к нейроспецифической енолазе - 0,66 мкг/мл, к глиофибриллярно-кислому протеину - 0,98 мкг/мл, что указывает на возможность развития гестоза.

При обследовании в сроке 30 недель беременности: АД 120/90 мм рт.ст. Отеки голеней, кистей рук, лица, следы белка в моче, патологическая прибавка массы тела - 410 г за неделю, гипопротеинемия (общий белок крови - 58,1 г/л), тромбопитопения - 169·10⁹/л.

Беременная У. госпитализирована в стационар с диагнозом: гестоз легкой степени. Проведено патогенетическое лечение. Беременность закончилась самостоятельными срочными родами в сроке 39-40 недель и рождением доношенной девочки массой 3150 г, ростом 52 см, оценкой по Апгар 8/9 баллов.

Предлагаемый способ высокоинформативен и специфичен, позволяет четко прогнозировать развитие гестоза, своевременно провести комплекс профилактических мероприятий, определить тактику ведения беременной женщины.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования гестоза. Сущность способа заключается в определении концентрации антител к нейроспецифической енолазе и глиофибриллярно-кислому протеину в сыворотке крови беременных. Развитие гестоза прогнозируют при уровне анти-NSE-антител более 0,6 мкг/мл или анти-GFAP-антител более 0,9 мкг/мл. Техническим результатом является разработка высокоинформативного и специфичного способа прогнозирования развития гестоза. 1 табл.

Способ прогнозирования гестоза путем исследования сыворотки крови беременной, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию антител к нейроспецифической енолазе и глиофибриллярно-кислому протеину и при уровне анти-NDE-антител более 0,6 мкг/мл или анти-GFAP-антител более 0,9 мкг/мл прогнозируют развитие гестоза.