СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/36 A61K35/32 A61K9/06 A61K38/39 

Описание патента на изобретение RU2288729C2

Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, а именно к производству препаратов, действке которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани и ее регенерацию, и предназначено для использования в косметологии, кроме того, возможно его использование в области медицины.

В настоящее время известно, что коллагеновые волокна матрикса соединительной ткани выполняют структурную, опорную и стабилизирующую роль в отношении протеогликанов и воды. Кроме того, коллагеновый каркас обладает большой упругостью при действии сил растяжения и сжатия, играя основную роль в ограничении степени гидратации матрикса соединительной ткани (Miller E.J. Biochemical characteristics and biological significance of the genetically distinct collagens // Molec. Cell. Biochem. - 1976. - Vol.13. - N.2. - P.165-192).

Известен способ получения коллагена из - неминерализованной соединительной ткани - дермы, которую подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации уксусной кислотой, с последующим замораживанием, лиофильной сушкой и измельчением, без последующей стерилизации (Патент РФ №2076718, опубл. 10.04.1997).

Однако известный способ подразумевает выделение коллагена из неминерализованной соединительной ткани, в случае использования минерализованного сырья выделение коллагена и по данной схеме затруднительно.

Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа получения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающем предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворившийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6000g, осадок диализуют против дистиллированной воды и очищают хроматографиен на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:

Фиг.1 - иллюстрирует схему выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани;

Фиг.2 - иллюстрирует хроматографический профиль коллагена костной ткани на катионообменнике.

Способ осуществляют следующим образом.

После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань измельчали до кусочков размерами около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0.1 М HCl с рН 2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, из которого осаждали коллаген добавлением сульфата аммония до 25%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000 gx). Для получения высокоочищенного коллагена используют хроматографическое разделение на СМ-сефадексе. После этого коллаген лиофильно высушивают.

Примеры лабораторного выполнения.

Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиривают спирт-эфирной смесью 1:1, измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.

100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (40.000 g × 30 минут)

После этого к раствору протеолизата приливали насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 25%. Осадок коллагена, образовавшийся за 24 часа, отделяли центрифугированием (6.000 g × 60 минут), суспендировали и диализовали против дистилированной воды в течении 2-х суток, затем лиофильно высушивали. Полученный коллаген растворяли в 0,02 М растворе CH3COONa (pH 4,8) в 1,0 М мочевине, центрифугировали и наносили на колонку размерами 2,5×20 см с СМ-сефадексом (ионообменная емкость 4,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Для элюирования использовали линейный градиент NaCl (0,00-1,5 М) в ацетатном буфере (pH 4.8). Хроматографию проводили в денатурирующих условиях. Фракции денситометрировали при длине волны 226 нм, фракцию коллагена в пределах одного хроматографического пика собирали, диализовали против воды и лиофильно высушивали.

Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов и он позволяет получать высокоочищенный продукт из дешевого доступного сырья.

Кроме этого, получение высокоочищеного коллагена может проводиться в комплексе с выделением других биологически-активных веществ (ГАГ - гликозаминогликаны, НКБ - не коллагеновые белки) костной ткани, снижая тем самым себестоимость целевого продукта.

Похожие патенты RU2288729C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ МИНЕРАЛИЗОВАННОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ 2003
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Матвеева Елена Леонидовна
  • Накоскин Александр Николаевич
RU2325902C2
БИОИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОЗМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ МИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ТКАНЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Шевцов Владимир Иванович
  • Талашова Ирина Александровна
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Ковинька Михаил Александрович
RU2311167C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНЪЕКЦИОННОГО ЗАМЕНИТЕЛЯ СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ 2012
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Матвеева Елена Леонидовна
  • Накоскин Александр Николаевич
  • Спиркина Елена Сергеевна
RU2517237C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ ВТОРИЧНЫХ КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ 2017
  • Гармашов Сергей Юрьевич
  • Бабич Ольга Олеговна
  • Дышлюк Любовь Сергеевна
  • Пискаева Анастасия Игоревна
  • Башкирцева Надежда Александровна
RU2658918C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И КОНСЕРВАЦИИ МИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА 2012
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Накоскин Александр Николаевич
  • Ковинька Михаил Александрович
RU2495567C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ 2005
  • Саващук Дмитрий Алексеевич
  • Панасюк Андрей Федорович
RU2304441C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОАКТИВНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ/ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ 2006
  • Арион Виталий Яковлевич
  • Ковалев Владимир Абрамович
  • Бреусов Юрий Николаевич
  • Оксененко Борис Геннадьевич
  • Москвина Светлана Николаевна
  • Зимина Ирина Васильевна
RU2327475C1
БИОМАТЕРИАЛ ДЛЯ ВОЗМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2011
  • Ирьянов Юрий Михайлович
  • Ирьянова Татьяна Юрьевна
RU2478394C1
ГЕЛЬ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ СУСТАВНОГО ХРЯЩА И МЕЖПОЗВОНОЧНЫХ ДИСКОВ "СТОПАРТРОЗ" И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2002
  • Шевцов В.И.
  • Лунева С.Н.
  • Гнеушев В.Г.
  • Канджа С.Н.
RU2241473C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА В ВИДЕ КРОШКИ 2011
  • Лунин Владимир Глебович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Шарапова Наталья Евгеньевна
  • Ершова Анна Степановна
  • Громов Александр Викторович
  • Никитин Кирилл Евгеньевич
  • Субботина Марина Евгеньевна
  • Котнова Алина Петровна
  • Лаврова Наталья Витальевна
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Соболева Любовь Александровна
  • Грунина Татьяна Михайловна
  • Овечкина Татьяна Андреевна
  • Бартов Михаил Сергеевич
  • Мишина Дарья Михайловна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2456003C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 288 729 C2

Реферат патента 2006 года СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, и предназначено для использования в косметологии и медицине. Способ выделения коллагена включает предварительную обработку костной ткани сельскохозяйственных животных, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, при этом костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает разработку экономичного по расходу времени и реактивов способа выделения коллагена из различных видов минерализованной соединительной ткани и получение косметического средства из высокоочищенного целевого продукта - коллагена, выделенного из костной ткани сельскохозяйственных животных. 2 ил.

Формула изобретения RU 2 288 729 C2

Способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающий предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, отличающийся тем, что костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н HCl в течение 20 ч, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 ч при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2288729C2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНА 1993
  • Беляева Г.В.
  • Новикова Л.С.
RU2076718C1
КРЕМ ДЛЯ КОЖИ 1993
  • Кучумова Л.Я.
  • Сидоркина О.М.
  • Маяцкая Т.В.
RU2090179C1
RU 2059383 C1, 10.05.1996
SU 1417454 A1, 20.05.1996
КОСМЕТИЧЕСКОЕ И ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ОБРАБОТКИ КОЖИ И/ИЛИ КЕРАТИНОВЫХ МАТЕРИАЛОВ 2000
  • Зенович С.М.
  • Стрелец Б.Х.
RU2195255C2
WO 9405702 A1, 17.03.1994
GALLOP P.M
et al
Preparation and properties of soluble collagen, Method in Enzy-mology, A.P., N.Y., 1963, v.6, p.635-641..

RU 2 288 729 C2

Авторы

Лунева Светлана Николаевна

Ковинька Михаил Александрович

Матвеева Елена Леонидовна

Талашова Ирина Александровна

Накоскин Александр Николаевич

Даты

2006-12-10Публикация

2003-11-24Подача