ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ G, U-СОДЕРЖАЩИЕ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДЫ Российский патент 2007 года по МПК A61K31/7088 A61P37/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и иммуностимуляции. В частности, настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим рибонуклеиновым кислотам, гомологам указанных иммуностимулирующих рибонуклеиновых кислот и способам применения указанных иммуностимулирующих рибонуклеиновых кислот и гомологов. Считается, что композиции и способы по данному изобретению пригодны для индукции передачи сигнала при помощи Toll-подобного рецептора 7 (TLR7) и Toll-подобного рецептора 8 (TLR8).

Предпосылки изобретения

Иммунный ответ, как известно, определяется врожденным и приобретенным иммунитетом. Считается, что врожденный иммунитет предполагает узнавание патогенассоциированных молекулярных паттернов (PAMP), которые являются общими для определенных классов молекул, экспрессируемых инфекционными микроорганизмами, или чужеродных макромолекул. РАМР распознаются рецепторами узнавания паттернов (PRR), расположенными на определенных иммунных клетках.

Toll-подобные рецепторы (TLR) образуют семейство высококонсервативных полипептидов, которые имеют важное значение для врожденного иммунитета млекопитающих. В настоящее время идентифицировано десять членов указанного семейства, получивших названия TLR1-TLR10. Цитоплазматические домены разных рецепторов TLR характеризуются наличием домена рецептора Toll-интерлейкина 1 (IL-1) (TIR); Medzhitov R. et al. (1998) Mol. Cell 2:253-8. Узнавание микробной инвазии рецепторами TLR активирует путь передачи сигнала, который является эволюционно консервативным у дрозофилы и млекопитающих. Установлено, что адапторный белок MyD88, содержащий домен TIR, взаимодействует с рецепторами TLR и осуществляет для них рекрутинг киназы, ассоциированной с рецептором IL-1 (IRAK), и фактора 6, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TNF) (TRAF6). МуD88-зависимый путь передачи сигнала активирует факторы транскрипции NF-kB и митогенактивированные протеинкиназы (МАРК) NH₂-концевой киназы с-Jun (Jnk), что имеет важное значение для активации иммунитета и продуцирования воспалительных цитокинов. См., Aderem A. et al. (2000) Nature 406:782-87.

Несмотря на то, что в научных публикациях описан ряд специфических лигандов TLR, лиганды для некоторых рецепторов TLR все еще не идентифицированы. Лиганды для TLR2 включают пептидогликан и липопептиды; Yoshimura A. et al. (1999) J. Immunol. 163:1-5; Yoshimura A. et al. (1999) J. Immunol. 163:1-5; Aliprantis A.O. et al., (1999) Science 285:736-9. Как известно, выделенная из вируса двухцепочечная РНК (дцРНК) и поли I:C, синтетический аналог дцРНК, являются лигандами TLR3; Alexopoulou L. et al. (2001) Nature 413:732-8. Липополисахарид (LPS) является лигандом для TLR4; Poltorak A. et al. (1998) Science 282:2085-8; Hoshino K. et al. (1999) J. Immunol. 162:3749-52. Бактериальный флагеллин является лигандом для TLR5; Hayashi F. et al. (2001) Nature 410:1099-1103. Как указано в научных публикациях, пептидогликан является лигандом не только для TLR2, но также для TLR6; Ozinsky A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13766-71; Takeuchi O. et al. (2001) Int. Immunol. 13:933-40. Бактериальная ДНК (CpG-содержащая ДНК) является лигандом для TLR9; Hemmi H. et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9237-42. Все перечисленные выше лиганды TLR являются естественными лигандами, то есть лигандами TLR, обнаруженными в природе в виде молекул, экспрессированных инфекционными микроорганизмами.

Естественные лиганды для TLR1, TLR7, TLR8 и TLR10 неизвестны, хотя недавно было установлено, что определенные низкомолекулярные синтетические соединения, в частности имидазохинолоны, такие как имихимод (R-837) и резихимод (R-848), являются лигандами TLR7; Hemmi H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200.

Краткое описание изобретения

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие авторами изобретения определенных иммуностимулирующих РНК и РНК-подобных (далее просто РНК) молекул. Авторы настоящего изобретения считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК должны иметь последовательность оснований, включающую, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U), причем, по крайней мере, один G может быть вариантом или гомологом G и/или, по крайней мере, один U может быть независимо вариантом или гомологом U. Молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению могут быть одноцепочечными или, по крайней мере, частично двухцепочечными. Кроме того, молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению не требуют наличия мотива CpG для оказания иммуностимулирующего действия. Не ограничивая себя какой-либо конкретной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению передают сигналы по MуD88-зависимому пути, вероятно, при помощи рецептора TLR. Не желая связывать себя какой-либо определенной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения далее считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению взаимодействуют с рецепторами TLR8, TLR7 или некоторыми другими еще не идентифицированными рецепторами TLR и передают сигналы с их помощью.

Авторы настоящего изобретения также считают, что молекулы иммуностимулирующей РНК являются типичными представителями встречающегося в природе класса молекул РНК, которые могут индуцировать иммунный ответ. Не связывая себя какой-либо конкретной теорией или механизмом, авторы настоящего изобретения считают, что соответствующий класс молекул РНК, обнаруженных в природе, представлен рибосомной РНК (рРНК), транспортной РНК (тРНК), матричной РНК (мРНК) и вирусной РНК (вРНК). В данной связи следует отметить, что молекулы иммуностимулирующей РНК по настоящему изобретению могут состоять из 5-40 нуклеотидов. Такие короткоцепочечные молекулы РНК не входят в определение непроцессированных матричных РНК, которые, как известно, пригодны для трансфекции дендритных клеток с целью индукции иммунного ответа на раковые антигены. См., например, Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-72; Mitchell D.A. et al. (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2:176-81.

В соответствии с настоящим изобретением установлено, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению можно успешно объединять с некоторыми средствами, стимулирующими стабилизацию РНК, локальное образование кластеров молекул РНК и/или перенос молекул РНК в эндосомный компартмент клеток. В частности, в соответствии с настоящим изобретением установлено, что для указанной цели можно использовать некоторые липиды и/или липосомы. Например, некоторые катионные липиды, включающие, в частности, метилсульфат N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), по-видимому, являются особенно предпочтительными для объединения с молекулами иммуностимулирующей РНК по данному изобретению. В качестве другого примера можно привести ковалентное конъюгирование холестерильной части РНК, например, с 3'-концом РНК, оказывающее иммуностимулирующее действие РНК даже при отсутствии катионного липида.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению, и способам их применения. Указанные композиции и способы пригодны наряду с прочим для активации иммунных клеток in vivo, in vitro и ex vivo, лечения инфекционных заболеваний и рака, получения фармацевтической композиции, идентификации рецептора-мишени для иммуностимулирующей РНК, обнаружения и исследования дополнительных иммунностимулирующих соединений. Кроме того, композиции, содержащие молекулы иммуностимулирующей РНК по настоящему изобретению, можно успешно объединять с другими иммуностимулирующими композициями, то же самое относится к способам по настоящему изобретению, при осуществлении которых можно использовать наряду с композициями по данному изобретению другие иммуностимулирующие композиции.

Одним объектом настоящего изобретения является иммуностимулирующая композиция. Иммуностимулирующая композиция по данному объекту изобретения содержит выделенный олигомер РНК длиной 5-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, включающей, по крайней мере, один гуанин (G), по крайней мере, один урацил (U) и необязательно катионный липид. Олигомер РНК может быть естественного или искусственного происхождения. Олигомер РНК естественного происхождения в одном варианте осуществления изобретения может быть выделен из прокариотической РНК и в другом варианте осуществления изобретения может быть выделен из эукариотической РНК. Кроме того, олигомер РНК естественного происхождения может включать часть рибосомной РНК. Олигомер РНК искусственного происхождения может включать молекулу РНК, синтезированную вне клетки, например, при помощи химических методов, известных специалистам в данной области. В одном варианте осуществления изобретения олигомер РНК может включать производный олигомер РНК естественного происхождения.

В одном варианте осуществления изобретения выделенный олигомер РНК представляет собой рассмотренную ниже РНК с высоким содержанием G и U.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-RURGY-3', где R означает пурин, U означает урацил, G означает гуанин и Y означает пиримидин. В другом варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUAGU-3', где А означает аденин. В другом варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUAGUGU-3'.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUUGB-3', где В означает U, G или С.

В одном варианте осуществления изобретения G,U-содержащая иммуностимулирующая РНК является выделенной молекулой РНК длиной не менее 5 нуклеотидов с последовательностью оснований, выраженной 5'-GUGUG-3'.

В одном варианте осуществления изобретения выделенная молекула РНК может содержать несколько любых вышеуказанных последовательностей, комбинации любых вышеуказанных последовательностей или комбинации любых вышеуказанных последовательностей, включающих несколько любых вышеуказанных последовательностей. Несколько последовательностей и комбинаций могут быть связаны прямой или непрямой связью, то есть при помощи промежуточного нуклеозида или последовательности. В одном варианте осуществления изобретения промежуточным связующим нуклеозидом является G; в другом варианте осуществления изобретения промежуточным связующим нуклеозидом является U.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-GUGUUUAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-GUGUUUAC-3'.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-GUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-GUAGGCAC-3'.

В еще одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-CUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-CUAGGCAC-3'.

В еще одном варианте осуществления изобретения последовательность оснований включает 5'-CUCGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения последовательностью оснований является 5'-CUCGGCAC-3'.

В одном варианте осуществления изобретения олигомер содержит 5-12 нуклеотидов. В другом варианте осуществления изобретения олигомер содержит 8-12 нуклеотидов.

Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения по данному объекту последовательность оснований не содержит динуклеотида CpG. Таким образом, в данном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая РНК не является CpG-содержащей нуклеиновой кислотой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по данному объекту последовательность оснований олигомера РНК является, по крайней мере, частично самокомплементарной. В одном варианте осуществления изобретения степень самокомплементарности равна, по крайней мере, 50%. Степень самокомплементарности может быть увеличена до 100%. Так, например, последовательность оснований, по крайней мере, частично самокомплементарного олигомера РНК в разных вариантах осуществления изобретения может характеризоваться, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, по крайней мере, 90% или 100% самокомплементарности. Комплементарные пары оснований включают гуанин-цитозин (G-C), аденин-урацил (А-U), аденин-тимин (А-Т) и гуанин-урацил (G-U). "Неоднозначное" спаривание оснований G-U, которое является достаточно обычным в рибосомной РНК и ретровирусной РНК, является более слабым по сравнению с традиционным спариванием оснований Ватсона-Крика G-C, A-T или A-U. Частично самокомплементарная последовательность может включать одну или несколько частей самокомплементарной последовательности. В одном варианте осуществления изобретения, который включает частично самокомплементарную последовательность, олигомер РНК может включать самокомплементарную часть, расположенную у каждого конца олигомера и охватывающую каждый конец.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту олигомер состоит из нескольких олигомеров, то есть из нескольких олигомеров РНК длиной 6-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, содержащей, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U). Несколько олигомеров могут, но не обязательно, включать последовательности, которые являются, по крайней мере, частично комплементарными друг другу. В одном варианте осуществления изобретения несколько олигомеров включают олигомер, содержащий первую последовательность оснований, и олигомер, содержащий вторую последовательность оснований, причем первая последовательность оснований и вторая последовательность оснований являются комплементарными, по крайней мере, на 50%. Так, например, по крайней мере, частично комплементарные последовательности оснований в разных вариантах осуществления изобретения могут быть комплементарными, по крайней мере, на 50%, по крайней мере, на 60%, по крайней мере, на 70%, по крайней мере, на 80%, по крайней мере, на 90% или 100%. Как было указано выше, комплементарные пары оснований включают гуанин-цитозин (G-C), аденин-урацил (A-U), аденин-тимин (А-Т) и гуанин-урацил (G-U). Частично комплементарные последовательности могут включать одну или несколько частей комплементарной последовательности. В одном варианте осуществления изобретения, в котором использованы частично комплементарные последовательности, олигомеры РНК могут включать комплементарную часть, расположенную, по крайней мере, у одного конца олигомеров и охватывающую один конец.

В одном варианте осуществления изобретения олигомер состоит из нескольких олигомеров, содержащих олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUGUUUAC-3', и олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUAGGCAC-3'. В другом варианте осуществления изобретения олигомер состоит из нескольких олигомеров, содержащих олигомер с последовательностью оснований 5'-GUGUUUAC-3' и олигомер с последовательностью оснований 5'-GUAGGCAC-3'.

В разных вариантах осуществления изобретения по данному объекту олигомер включает искусственную связь в остове, модифицированное основание, модифицированный сахар или любую комбинацию вышеуказанных компонентов. Искусственная связь в остове может быть стабилизированной связью, то есть связью, которая относительно устойчива к разрушению РНКазой или нуклеазой по сравнению с фосфодиэфирной связью. В одном варианте осуществления изобретения искусственная связь в остове является фосфортиоатной связью. Олигомер может включать одну или несколько искусственных связей в остове, каждую из которых выбирают независимо от остальных. Модифицированное основание может быть модифицированным основанием G, U, A или С, включающим, по крайней мере, один G и, по крайней мере, один U в последовательности оснований по данному объекту изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное основание может быть выбрано из 7-деазагуанозина, 8-азагуанозина, 5-метилурацила и псевдоурацила. Олигомер может включать одно или несколько модифицированных оснований, каждое из которых выбирают независимо от других. Модифицированный сахар может быть метилированным сахаром, арабинозой. Олигомер может включать один или несколько модифицированных сахаров, каждый из которых выбирают независимо от других.

В одном варианте осуществления изобретения катионный липид является метилсульфатом N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP). Считается, что DOTAP доставляет олигомер РНК в клетки, в частности переносит в эндосомный компартмент, где он может высвобождать олигомер РНК в зависимости от рН. Оказавшись в эндосомном компартменте, РНК может взаимодействовать с определенными внутриклеточными молекулами Toll-подобных рецепторов (TLR), активируя TLR-опосредованные пути передачи сигнала, участвующие в формировании иммунного ответа. Вместо или дополнительно к DOTAP можно использовать другие вещества с аналогичными свойствами, обеспечивающие перенос в эндосомный компартмент.

В одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая композиция дополнительно содержит антиген. В одном варианте осуществления изобретения антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения антиген является раковым антигеном. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном.

Кроме того, объектом настоящего изобретения в соответствии с другим вариантом осуществления является фармацевтическая композиция. Данная фармацевтическая композиция содержит иммуностимулирующую композицию по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Способы получения фармацевтической композиции также входят в объем изобретения. Такие способы включают введение иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в соприкосновение с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция может быть получена для удобства в виде дозированной лекарственной формы.

Другим объектом настоящего изобретения является способ активации иммунной клетки. Данный способ включает контактирование иммунной клетки с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению в эффективном количестве для индукции активации иммунной клетки. В одном варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию цитокина иммунной клеткой. Цитокин в одном варианте осуществления изобретения выбирают из группы, включающей интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерферон (IFN) и фактор некроза опухоли (TNF). В другом варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию хемокина. В одном варианте осуществления изобретения секретированный хемокин является гамма-интерферон-индуцированным белком 10 (IP-10). В одном варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает экспрессию костимулирующей/вспомогательной молекулы иммунной клеткой. В одном варианте осуществления изобретения костимулирующую/вспомогательную молекулу выбирают из группы, включающей межклеточные адгезивные молекулы (ICAM, например CD54), антигены, ассоциированные с функцией лейкоцитов (LFA, например CD58), B7 (CD80, CD86) и CD40.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту активация иммунной клетки предполагает активацию MyD88-зависимого пути передачи сигнала. Считается, что МуD88 является адапторной молекулой, которая взаимодействует с доменом Toll/интерлейкинового-1 (TIR) рецептора разных молекул Toll-подобного рецептора (TLR) и участвует в активации пути передачи сигнала, который в конце концов активирует ядерный фактор каппа-В (NF-κB). Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения МуD88-зависимый путь передачи сигнала взаимосвязан с TLR. В частности, в одном варианте осуществления изобретения TLR является TLR8. В другом варианте осуществления изобретения TLR является TLR7.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту иммунная клетка является иммунной клеткой человека. В другом варианте осуществления изобретения иммунная клетка является миелоидной дендритной клеткой.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту контактирование осуществляют in vitro. В другом варианте осуществления изобретения контактирование происходит in vivo.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает введение субъекту иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа у указанного субъекта. Следует отметить, что способ по данному объекту изобретения не предполагает введения антигена субъекту. В одном варианте осуществления изобретения субъектом является человек. В одном варианте осуществления изобретения указанный субъект болен или подвержен риску заболеть раком. В другом варианте осуществления изобретения субъект болен или подвержен риску заболеть инфекционным заболеванием, вызываемым агентом, выбранным из группы, состоящей из вирусов, бактерий, грибов и паразитов. В конкретном варианте осуществления изобретения субъект болен или подвержен риску заболеть вирусной инфекцией. Кроме того, следует отметить, что способ по данному объекту изобретения можно применять для лечения субъекта со сниженной способностью к выработке эффективного или желаемого иммунного ответа. Например, у субъекта может быть подавлена иммунная система вследствие инфекционного заболевания, рака, острого или хронического заболевания, такого как почечная или печеночная недостаточность, хирургического вмешательства и воздействия иммуносупрессорного средства, такого как химиотерапия, облучение, некоторые лекарственные средства или тому подобные. В одном варианте осуществления изобретения субъект подвержен риску заболеть аллергическим заболеванием или астмой. Такой субъект может испытывать воздействие аллергена, вызывающего аллергическую реакцию или астму.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает введение субъекту антигена и иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа на указанный антиген. Следует отметить, что антиген может быть введен до, после или одновременно с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению. Кроме того, как антиген, так и иммуностимулирующее соединение можно вводить субъекту несколько раз.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является раковым антигеном. Раковый антиген в одном варианте осуществления изобретения может быть раковым антигеном, выделенным из организма субъекта. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном. Микробный антиген может быть антигеном вируса, бактерии, гриба или паразита.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает выделение дендритных клеток у субъекта, контактирование дендритных клеток ex vivo с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению, контактирование дендритных клеток ex vivo с антигеном и введение подвергнутых контакту дендритных клеток указанному субъекту.

В одном варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является аллергеном. В другом варианте осуществления изобретения по данному объекту антиген является раковым антигеном. Раковый антиген в одном варианте осуществления изобретения может быть раковым антигеном, выделенным у субъекта. В другом варианте осуществления изобретения антиген является микробным антигеном. Микробный антиген может быть антигеном вируса, бактерии, гриба или паразита.

Иммунный ответ, вызываемый стимуляцией одного рецептора TLR, можно модифицировать, усилить или амплифицировать путем стимуляции другого рецептора TLR, при этом объединенное иммуностимулирующее действие может быть синергичным. Например, известно, что TLR9 реагирует на бактериальную ДНК, в частности на CpG-содержащую ДНК. Иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования рецептора TLR9 с естественным лигандом (или любым лигандом TLR9), можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с лигандом TLR7 или рецептора TLR8 с лигандом TLR8 либо обоих рецепторов. Аналогичным образом иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования рецептора TLR7 с лигандом TLR7, можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR8 с лигандом TLR8 или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или с любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов. В соответствии с другим примером иммунный ответ, вызываемый в результате контактирования TLR8 с лигандом рецептора TLR8, можно модифицировать, усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с лигандом TLR7 или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или с любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов.

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие авторами изобретения предполагаемых естественных лигандов для TLR7 и TLR8. Хотя для некоторых рецепторов TLR известны естественные лиганды, выделенные из микробов, до сих пор не были описаны естественные лиганды для рецепторов TLR7 и TLR8. В качестве лигандов TLR7 были описаны определенные синтетические мелкие молекулы, в частности соединения имидазохинолина, но такие соединения следует отличать от естественных лигандов по настоящему изобретению; Hemmi H. et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200.

Выделенные естественные лиганды TLR7 и TLR8 можно использовать в качестве композиций, способных индуцировать, усиливать и комплементировать иммунный ответ. Естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для получения новых композиций, которые могут индуцировать, усиливать и комплементировать иммунный ответ. Кроме того, естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для избирательной индукции TLR7- и TLR8-опосредованной передачи сигнала и для избирательной индукции TLR7- и TLR8-опосредованных иммунных ответов. Кроме того, естественные лиганды TLR7 и TLR8 пригодны для разработки и выполнения анализов по идентификации и селекции иммуностимулирующих соединений.

Настоящее изобретение также частично основано на открытии того, что нейтрофилы человека интенсивно экспрессируют TLR8. Данное открытие имеет важное значение, так как нейтрофилы очень часто первыми взаимодействуют с инфекционными патогенами и, таким образом, инициируют иммунные ответы. Считается, что активированные нейтрофилы секретируют хемокины и цитокины, которые в свою очередь обеспечивают рекрутинг дендритных клеток. TLR9-экспрессирующие дендритные клетки, перемещаемые к месту действия активированных нейтрофилов, активируются и тем самым амплифицируют иммунный ответ.

Настоящее изобретение основано также частично на признании дифференциальной экспрессии разных рецепторов TLR, включая TLR7, TLR8 и TLR9, в разных клетках иммунной системы. Такое разделение может иметь важное значение для TLR7, TLR8 и TLR9 человека. Иммунный ответ, возникающий в результате стимуляции любого из указанных рецепторов TLR, может быть усилен или амплифицирован стимуляцией другого рецептора TLR, при этом объединенное иммуностимулирующее действие может быть синергичным. Например, известно, что TLR9 реагирует на бактериальную ДНК, в частности на CpG-содержащую ДНК. Иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR9 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR9), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с его естественным лигандом (или с любым приемлемым лигандом TLR7) или рецептора TLR8 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR8) либо обоих рецепторов. Аналогичным образом иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR7 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR7), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR8 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR8) или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов. В соответствии с другим примером иммунный ответ, возникающий в результате контактирования TLR8 с его естественным лигандом (или любым лигандом TLR8), можно усилить или амплифицировать, осуществляя избирательное контактирование рецептора TLR7 с его естественным лигандом (или любым приемлемым лигандом TLR7) или рецептора TLR9 с CpG-содержащей ДНК (или любым приемлемым лигандом TLR9) либо обоих рецепторов.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество лиганда для TLR8, необходимое для индукции передачи сигнала рецептором TLR8, и эффективное количество лиганда для второго рецептора TLR, выбираемого из группы, включающей TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR9 и TLR10, необходимое для индукции передачи сигнала вторым рецептором TLR. В одном варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR3. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR7. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR9. В другом варианте осуществления изобретения лиганд для TLR8 и лиганд для второго рецептора TLR связаны друг с другом. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество лиганда TLR7, необходимое для индукции передачи сигнала рецептором TLR7, и эффективное количество лиганда для второго рецептора TLR, выбираемого из группы, включающей TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR8, TLR9 и TLR10, необходимое для индукции передачи сигнала вторым рецептором TLR. В одном варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TRL3. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR8. В другом варианте осуществления изобретения вторым рецептором TLR является TLR9. В другом варианте осуществления изобретения лиганд для TLR7 и лиганд для второго рецептора TLR связаны друг с другом. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая конъюгат ДНК:РНК, в котором ДНК включает иммуностимулирующий фрагмент, эффективно стимулирующий передачу сигнала рецептором TLR9, и РНК эффективно стимулирует передачу сигнала рецепторами TLR3, TLR7, TLR8 или любой комбинацией указанных рецепторов. В одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является мотив CpG. В другом варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является поли-dT. В другом варианте осуществления изобретения иммуностимулирующим фрагментом, эффективно стимулирующим передачу сигнала рецептором TLR9, является поли-dG. В одном варианте осуществления изобретения указанный конъюгат включает химерный остов из ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения химерный остов включает сайт расщепления между ДНК и РНК. В одном варианте осуществления конъюгат включает двухцепочечный гетеродуплекс ДНК:РНК. В другом варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала TLR8. Данный способ включает контактирование рецептора TLR8 с выделенной РНК, используемой в эффективном количестве для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения РНК является двухцепочечной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является рибосомной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является транспортной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является матричной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является вирусной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является РНК с высоким содержанием G и U. В другом варианте осуществления изобретения РНК по существу состоит из G и U.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование рецептора TLR8 со смесью нуклеозидов, состоящей в основном из G и U, в соотношении от 1G:50U до 10G:1U, используемой в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения нуклеозиды являются рибонуклеозидами. В другом варианте осуществления изобретения нуклеозиды образуют смесь рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения G является производным гуанозина, выбираемым из группы, включающей 8-бромгуанозин, 8-оксогуанозин, 8-меркаптогуанозин, 7-аллил-8-оксогуанозин, ванадильный комплекс гуанозинрибонуклеозида, инозин и небуларин.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 со смесью ванадильных комплексов рибонуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения данная смесь содержит ванадильные комплексы гуанозинрибонуклеозидов.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 с выделенным олигонуклеотидом с высоким содержанием G и U, имеющим последовательность, выбираемую из группы, включающей UUGUGG, UGGUUG, GUGUGU и GGGUUU, в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид является олигорибонуклеотидом. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит 7-50 оснований. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид имеет длину, равную 12-24 основаниям. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид имеет последовательность 5'-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3' (SEQ ID NO:1).

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR8. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR8 с молекулой, по крайней мере, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей, по крайней мере, одну пару оснований G-U, в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR8.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR8-опосредованного иммунного ответа. Данный способ включает контактирование рецептора TRL8 с эффективным количеством лиганда TLR8 для индукции TLR8-опосредованного иммунного ответа и контактирование TLR, не являющегося рецептором TLR8, с эффективным количеством лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR8, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR8.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR8-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту включает введение субъекту, нуждающемуся в иммунном ответе, эффективного количества лиганда TLR8 для индукции TLR8-опосредованного иммунного ответа и эффективного количества лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR8, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR8. В одном варианте осуществления изобретения TLR, не являющийся рецептором TLR8, представляет собой TLR9. В одном варианте осуществления изобретения лиганд для TLR9 является CpG-содержащей нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления изобретения CpG-содержащая нуклеиновая кислота имеет стабилизированный остов. В одном варианте осуществления изобретения лиганд для TLR8 и лиганд для TLR9 образуют конъюгат. В одном варианте осуществления изобретения данный конъюгат содержит двухцепочечный гетеродуплекс ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит химерный остов ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения химерный остов имеет сайт расщепления между ДНК и РНК.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 с выделенным гуанозинрибонуклеозидом, используемым в эффективном количестве для стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. В одном варианте осуществления изобретения гуанозинрибонуклеозид является производным гуанозинрибонуклеозида, выбираемым из группы, включающей 8-бромгуанозин, 8-оксогуанозин, 8-меркаптогуанозин, 7-аллил-8-оксогуанозин, ванадильный комплекс гуанозинрибонуклеозида, инозин и небуларин. В одном варианте осуществления изобретения производное гуанозинрибонуклеозида является 8-оксогуанозином. В одном варианте осуществления изобретения гуанозиннуклеозид является рибонуклеозидом. В одном варианте осуществления изобретения гуанозиннуклеозид образует смесь рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 с выделенной нуклеиновой кислотой, содержащей концевой окисленный или галогенированный гуанозин, в эффективном количестве для стимуляции передачи сигнала TLR7. В одном варианте осуществления изобретения окисленный или галогенированный гуанозин является 8-оксогуанозином.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 с выделенной РНК, используемой в эффективном количестве для стимуляции передачи сигнала TLR7. В одном варианте осуществления изобретения РНК является двухцепочечной РНК. В одном варианте осуществления изобретения РНК является рибосомной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является транспортной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является матричной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является вирусной РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК является РНК с высоким содержанием G. В другом варианте осуществления изобретения РНК является частью гетеродуплекса ДНК:РНК. В другом варианте осуществления изобретения РНК содержит в основном гуанозинрибонуклеозид.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 со смесью нуклеозидов, содержащих в основном G и U с соотношением от 1G:50U до 10G:1U в количестве, достаточном для стимуляции передачи сигнала TLR7.

Другим объектом настоящего изобретения является способ стимуляции передачи сигнала рецептором TLR7. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 со смесью ванадильных комплексов рибонуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения смесь содержит ванадильные комплексы гуанозинрибонуклеозидов.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR7-опосредованного иммунного ответа. Способ по данному объекту изобретения включает контактирование TLR7 с эффективным количеством лиганда TLR7 для индукции TLR7-опосредованного иммунного ответа и контактирование TLR, не являющегося рецептором TLR7, с эффективным количеством лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR7, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR7.

Другим объектом настоящего изобретения является способ дополнения TLR7-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Данный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в иммунном ответе, эффективного количества лиганда TLR7 для индукции TLR7-опосредованного иммунного ответа и эффективного количества лиганда TLR, не являющегося рецептором TLR7, для индукции иммунного ответа, опосредованного TLR, не являющимся рецептором TLR7. В одном варианте осуществления изобретения TLR, не являющийся рецептором TLR7, представляет собой TLR9. В одном варианте осуществления изобретения лиганд для TLR9 является CpG-содержащей нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления изобретения CpG-содержащая нуклеиновая кислота имеет стабилизированный остов. В одном варианте осуществления изобретения лиганды для TLR7 и TLR9 образуют конъюгат. В одном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит двухцепочечный гетеродуплекс ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит химерный остов ДНК:РНК. В одном варианте осуществления изобретения химерный остов имеет сайт расщепления между ДНК и РНК.

Другим объектом настоящего изобретения является способ скрининга предполагаемых иммуностимулирующих соединений. Способ по данному объекту изобретения включает измерение TLR8-опосредованного контрольного сигнала, возникающего под действием контрольной РНК, измерение TLR8-опосредованного испытуемого сигнала, возникающего под воздействием предполагаемого иммуностимулирующего соединения, и сравнение TLR8-опосредованного испытуемого сигнала с TLR8-опосредованным контрольным сигналом.

Другим объектом настоящего изобретения является способ скрининга предполагаемых иммуностимулирующих соединений, который включает измерение TLR8-опосредованного контрольного сигнала, возникающего под действием контрольного имидазохинолина, измерение TLR8-опосредованного испытуемого сигнала, возникающего под действием предполагаемого иммуностимулирующего соединения, и сравнение TLR8-опосредованного испытуемого сигнала с TLR8-опосредованным контрольным сигналом.

Другим объектом настоящего изобретения является способ скрининга предполагаемых иммуностимулирующих соединений. Данный способ включает измерение TLR7-опосредованного контрольного сигнала, возникающего под действием контрольного имидазохинолина, измерение TLR7-опосредованного испытуемого сигнала, возникающего под действием предполагаемого иммуностимулирующего соединения, и сравнение TLR7-опосредованного испытуемого сигнала с TLR7-опосредованным контрольным сигналом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения имидазохинолин является резихимодом (R-848).

В некоторых вариантах осуществления изобретения имидазохинолин является имихимодом (R-837).

Другим объектом настоящего изобретения является также способ скрининга предполагаемых иммуностимулирующих соединений. Способ по данному объекту изобретения включает измерение TLR7-опосредованного контрольного сигнала, возникающего под действием контрольного 7-аллил-8-оксогуанозина, измерение TLR7-опосредованного испытуемого сигнала, возникающего под действием предполагаемого иммуностимулирующего соединения, и сравнение TLR7-опосредованного испытуемого сигнала с TLR7-опосредованным контрольным сигналом.

В объем изобретения могут входить разные варианты осуществления изобретения. Из вышеизложенного следует, что все признаки изобретения, включающие любой элемент или комбинацию элементов, могут входить в объем каждого объекта данного изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена столбчатая диаграмма, показывающая секрецию IL-12 p40 мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) человека под действием определенных стимулов, включающих выбранные G,U-содержащие олигонуклеотиды РНК, используемые с DOTAP или без него (соответственно "с липосомами" и "без липосом"), при измерении методом специфического твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Строчная буква "s" в последовательностях оснований обозначает фосфортиоатную связь.

На фиг. 2 изображена столбчатая диаграмма, показывающая секрецию TNF-α клетками PBMC человека под действием определенных стимулов, включающих выбранные G,U-содержащие олигонуклеотиды РНК, используемые с DOTAP или без него (соответственно "с липосомами" и "без липосом"), при измерении методом специфического анализа ELISA.

На фиг. 3 изображена столбчатая диаграмма, показывающая секрецию IL-12 p40 клетками PBMC человека в зависимости от дозы под действием выбранных G,U-содержащих олигонуклеотидов РНК в разных концентрациях (с DOTAP) при измерении методом специфического анализа ELISA.

На фиг. 4 изображена столбчатая диаграмма, показывающая секрецию TNF-α клетками РВМС человека в зависимости от последовательности под действием разных выбранных олигонуклеотидов РНК, родственных олигонуклеотиду РНК GUAGGCAC (с DOTAP), при измерении методом специфического анализа ELISA.

На фиг. 5 изображена столбчатая диаграмма, показывающая влияние DOTAP на секрецию IL-12 p40 клетками РВМС человека под действием разных стимулов при измерении методом специфического анализа ELISA.

На фиг. 6 изображены четыре столбчатые диаграммы, показывающие секрецию IL-12 p40 разными типами макрофагов мыши под действием разных испытуемых и контрольных иммуностимулирующих соединений при измерении методом специфического анализа ELISA. Блок А, макрофаги дикого типа в присутствии IFN-γ; блок В, макрофаги без МуD88 в присутствии IFN-γ; блок С, линия макрофагов J774; блок D, линия макрофагов RAW 264.7.

На фиг. 7 изображены два графика, показывающие секрецию (А) TNF-α и (В) IL-12 p40 клетками РВМС человека в результате инкубации с выделенными из ВИЧ-1 последовательностями РНК с DOTAP или без него. Кружки - 5'-GUAGUGUGUG-3' (SEQ ID NO:2); треугольники - 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEQ ID NO:3). Незаштрихованные символы - без DOTAP; заштрихованные символы - с DOTAP.

На фиг. 8 изображен график, показывающий явное сродство рецепторов TLR.

На фиг. 9 показаны домены связывания нуклеиновой кислоты в рецепторах TLR7, TLR8 и TLR9.

На фиг. 10 изображена столбчатая диаграмма, показывающая реакцию клеток РВМС человека на фактор реакции, обусловленной недостатком средств (SRF).

На фиг. 11 изображена столбчатая диаграмма, показывающая реакцию клеток РВМС человека на ванадильные комплексы рибонуклеозидов (RVC). Х означает резихимод.

На фиг. 12 изображены три столбчатые диаграммы, показывающие реакцию TLR7 и TLR8 человека на отдельные рибонуклеозиды. Х означает резихимод.

На фиг. 13 изображены три столбчатые диаграммы, показывающие реакцию TLR7 и TLR8 на смеси двух рибонуклеозидов.

На фиг. 14 изображена столбчатая диаграмма, показывающая реакцию клеток РВМС человека на смесь рибонуклеозидов G и U.

На фиг. 15 изображена столбчатая диаграмма, показывающая реакцию клеток РВМС человека на РНК с высоким содержанием G и U, а не на олигонуклеотиды ДНК.

На фиг. 16 изображена столбчатая диаграмма, показывающая реакцию клеток РВМС человека на окисленную РНК.

На фиг. 17 изображены три столбчатые диаграммы, показывающие реакции TLR7 и TLR8 человека на окисленный гуанозинрибонуклеозид. Х означает резихимод.

На фиг. 18 изображены две столбчатые диаграммы, показывающие реакции TLR7 человека на модифицированные гуанозинрибонуклеозиды.

На фиг. 19 представлены совмещенные изображения геля, показывающие разную экспрессию TLR1-TLR9 в CD123+ дендритных клетках человека (CD123+ DC), CD11c+ DC и нейтрофилах.

На фиг. 20 изображены три графика, показывающие способность короткоцепочечных, одноцепочечных G,U-содержащих олигомеров РНК индуцировать NF-κB в клетках НЕК-293, устойчиво трансфицированных экспрессирующей плазмидой для TLR7 или TLR8 человека.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение частично относится к открытию авторами изобретения ряда молекул РНК и родственных РНК молекул, являющихся эффективными иммуностимулирующими соединениями. Иммуностимулирующие соединения идентифицированы благодаря постоянным усилиям, направленным на идентификацию встречающихся в природе лигандов для TLR7 и TLR8. В результате указанных усилий было установлено, что РНК- и РНК-подобные молекулы, содержащие гуанин (G) и урацил (U), в том числе специфические последовательности, включающие G и U, обладают иммуностимулирующими свойствами и действуют по МуD88-зависимому пути с участием рецепторов TLR. Некоторые последовательности РНК встречаются в сильноконсервативных структурных элементах 5'-концевых нетранслируемых областей вирусной РНК, которые имеют важное значение для репликации вирусов. Идентифицированные последовательности иммуностимулирующей РНК соответствуют или почти соответствуют другим РНК, включая тРНК, выделенную из бактерий и дрожжей, а также рРНК, выделенную из бактерий и, возможно, некоторых эукариотических организмов. Иммуностимулирующая РНК по данному изобретению включает одноцепочечную РНК помимо частично или полностью двухцепочечной РНК, и действие указанной РНК может быть аннулировано в результате обработки РНКазой. Когда РНК имеет, по крайней мере, частично двухцепочечную структуру, в одном варианте осуществления изобретения такая РНК может включать стволовую петлю. Как подробно описано ниже, благодаря данному изобретению было установлено, что одноцепочечные РНК с высоким содержанием G и U и длиной цепи около 5 нуклеотидов могут стимулировать иммунные клетки, которые продуцируют большое число цитокинов и хемокинов, включая TNF-α, IL-6, IL-12, интерферон типа 1 (например, IFN-α) и IP-10.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые молекулы G,U-содержащей РНК и их аналоги, за исключением соответствующих ДНК, обладают иммуностимулирующими свойствами. G,U-содержащие олигорибонуклеотиды по данному изобретению могут быть значительно меньше ранее описанной матричной РНК и при этом могут быть пригодны для получения вакцин на основе дендритных клеток. См., например, Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-72; Mitchell D.A. et al. (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2:176-81. Хотя молекулы G,U-содержащей РНК по данному изобретению могут быть заменителями рибосомной РНК и/или вирусной РНК, встречающихся в природе, они могут иметь короткую цепь, состоящую из 5-40 нуклеотидов. Как будет описано ниже, G,U-содержащие олигорибонуклеотиды по данному изобретению включают, по крайней мере, один G и, по крайней мере, один U. Весьма удивительным является то, что удаление G или U из G,U-содержащих олигорибонуклеотидов по данному изобретению по существу аннулирует их иммуностимулирующее действие. По крайней мере, один G и, по крайней мере, один U могут располагаться рядом друг с другом, либо они могут быть разделены промежуточными нуклеозидами или последовательностью. Молекулы иммуностимулирующей G,U-содержащей РНК по данному изобретению не требуют использования CpG-содержащего динуклеотида.

Одним объектом настоящего изобретения является иммуностимулирующая композиция. Иммуностимулирующая композиция по данному объекту изобретения включает выделенный олигомер РНК длиной 5-40 нуклеотидов, имеющий последовательность оснований, содержащую, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U). Как будет более подробно описано ниже, олигомер иммуностимулирующей РНК длиной 5-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, содержащей, по крайней мере, один гуанин (G) и, по крайней мере, один урацил (U), успешно включают в препарат таким образом, что данный РНК-олигомер стабилизирован против разрушения, сконцентрирован внутри или на поверхности частицы, такой как липосома, и/или направленно воздействует на эндосомный компартмент клеток. В одном препарате, описанном в приведенных ниже примерах, олигомер РНК успешно объединен с катионным липидом DOTAP, который, как считается, способствует переносу G,U-содержащих олигорибонуклеотидов в эндосомный компартмент. Таким образом, одним объектом данного изобретения является иммуностимулирующая композиция, которая включает олигомер РНК длиной 5-40 нуклеотидов с последовательностью оснований, содержащей, по крайней мере, один G, по крайней мере, один U и необязательно катионный липид.

Олигомер РНК по данному изобретению может быть естественного или искусственного происхождения. Встречающаяся в природе РНК представляет собой тип нуклеиновой кислоты, которая обычно определяется как линейный полимер, включающий определенные рибонуклеозидные звенья, причем каждое рибонуклеозидное звено состоит из пуринового или пиримидинового основания и рибозосахара, связанных межнуклеозидными фосфодиэфирными связями. Термин "линейный" означает первичную структуру РНК. РНК обычно является одноцепочечной или двухцепочечной, в том числе частично двухцепочечной.

В используемом здесь значении термин "нуклеозид" означает одну часть молекулы, представляющую сахар (например, рибоза или дезоксирибоза), связанную с заменяемым органическим основанием, которое является замещенным пиримидином (например, цитозин (С), тимидин (Т) или урацил (U)) или замещенным пурином (например, аденин (А) или гуанин (G)). Как указано в данном описании изобретения, нуклеозид может быть естественным нуклеозидом, модифицированным нуклеозидом или синтетическим (искусственным) нуклеозидом.

Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид", используемые взаимозаменяемо, означают несколько нуклеотидов (то есть молекулы, содержащие сахар (например, рибозу или дезоксирибозу), связанных с фосфатной группой и заменяемым органическим основанием, которое является замещенным пиримидином (например, цитозин (С), тимидин (Т) или урацил (U)) или замещенным пурином (например, аденин (А) или гуанин (G)). В используемом здесь значении указанные термины означают олигорибонуклеотиды, а также олигодезоксирибонуклеотиды. Указанные термины также включают полинуклеозиды (то есть полинуклеотид без фосфата) и любой другой органический, содержащий основания полимер. Молекулы нуклеиновой кислоты можно получить из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномная или кДНК), но указанные молекулы предпочтительно являются синтетическими (например, полученными методом синтеза нуклеиновых кислот).

Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" также означают нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды, включающие замены или модификации оснований и/или сахаров. Например, они включают нуклеиновые кислоты, содержащие сахара в остове, которые ковалентно присоединены к низкомолекулярным органическим группам, не являющимся гидроксильной группой в 3'-концевом положении и фосфатной группой в 5'-концевом положении. Подобным образом модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать 2'-O-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты могут содержать вместо рибозы такие сахара, как арабиноза. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут иметь гетерогенный состав остова, включающий любую возможную комбинацию полимерных звеньев, связанных вместе с образованием пептидных нуклеиновых кислот (которые имеют аминокислотный остов с основаниями нуклеиновых кислот). В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновые кислоты имеют гомогенный состав остова. Нуклеиновые кислоты содержат также замещенные пурины и пиримидины, такие как основания, модифицированные С-5 пропином; Wagner R.W. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:840-4. Пурины и пиримидины включают, не ограничиваясь ими, аденин, цитозин, гуанин, тимидин, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие естественные и искусственные основания нуклеиновых кислот, замещенные и незамещенные в ароматические части. Специалистам в данной области хорошо известны другие такие модификации.

Естественное нуклеозидное основание может быть заменено модифицированным нуклеозидным основанием, которое, например, выбирают из группы, включающей гипоксантин, дигидроурацил, псевдоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-аминоурацил, 5-(С₁-С₆)алкилурацил, 5-(С₂-С₆)алкенилурацил, 5-(С₂-С₆)алкинилурацил, 5-(гидроксиметил)урацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-гидроксицитозин, 5-(С₁-С₆)алкилцитозин, 5-(С₂-С₆)алкенилцитозин, 5-(С₂-С₆)алкинилцитозин, 5-хлорцитозин, 5-фторцитозин, 5-бромцитозин, N²-диметилгуанин, 2,4-диаминопурин, 8-азапурин (включая, в частности, 8-азагуанин), замещенный 7-деазапурин (включая, в частности, 7-деазагуанин), в том числе 7-деаза-7-замещенный и/или 7-деаза-8-замещенный пурин, или другие модификации естественных нуклеозидных оснований. Данный перечень приведен в качестве примера и не ограничивает объема изобретения.

В частности, по крайней мере, одно основание гуанина иммуностимулирующего G,U-содержащего олигорибонуклеотида может быть замещенным или модифицированным гуанином, таким как 7-деазагуанин, 8-азагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С₂-С₆)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенный гуанин, гипоксантин, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, 8-замещенный гуанин, такой как 8-гидроксигуанин, и 6-тиогуанин. Данный перечень приведен в качестве примера и не ограничивает объема изобретения.

Кроме того, в частности, по крайней мере, одно основание урацила G,U-содержащего олигорибонуклеотида может быть замещенным или модифицированным урацилом, таким как псевдоурацил и 5-метилурацил.

Нуклеиновые кислоты по данному изобретению можно синтезировать de novo любыми способами, известными в данной области. Например, можно использовать способ на основе β-цианоэтилфосфорамидита (Beaucage S.L. et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859), способ на основе нуклеозид-Н-фосфоната (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27:4051-4; Froehler et al. (1986) Nucl. Acid Res. 14:5399-407; Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett. 27:4055-8; Gaffney et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:2619-22). Указанные способы можно осуществлять в целом ряде автоматических синтезаторов нуклеиновых кислот, представленных на рынке сбыта. Данные нуклеиновые кислоты являются синтетическими нуклеиновыми кислотами. Альтернативно, динуклеотиды с высоким содержанием Т и/или TG можно получить в плазмидах в промышленном масштабе (см., Sambrook T. et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) и затем разделить на более мелкие части или вводить целиком. Нуклеиновые кислоты можно получить из существующих последовательностей нуклеиновых кислот (например, геномная или кДНК) известными методами, например, с использованием рестрикционных ферментов, экзонуклеаз или эндонуклеаз. Нуклеиновые кислоты, полученные указанным методом, являются выделенными нуклеиновыми кислотами. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая отделена от компонентов, с которыми она обычно связана в природе. В качестве примера можно отметить, что выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена из клетки, ядра, митохондрий или хроматина. В определение термина "нуклеиновая кислота" входит как синтетическая, так и выделенная нуклеиновая кислота.

Для применения in vivo нуклеиновые кислоты должны быть относительно устойчивыми к разрушению (например, стабилизированы). В некоторых вариантах осуществления изобретения лишь определенные части нуклеиновых кислот могут быть необязательно стабилизированы. Термин "молекула стабилизированной нуклеиновой кислоты" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая относительно устойчива к разрушению in vivo (например, под действием экзо- или эндонуклеазы). Стабилизация может быть достигнута за счет длины или вторичной структуры. Нуклеиновые кислоты, имеющие цепь длиной от десятков до сотен т.п.о., относительно устойчивы к разрушению in vivo. В случае более коротких нуклеиновых кислот вторичная структура может стабилизировать и усиливать их действие. Например, если 3'-конец нуклеиновой кислоты является самокомплементарным к верхней области, благодаря чему он может сворачиваться и образовывать стволовую петлю определенного типа, нуклеиновая кислота стабилизируется и поэтому характеризуется большей активностью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по данному объекту последовательность оснований олигомера РНК является, по крайней мере, частично самокомплементарной. Самокомплементарная последовательность в используемом здесь значении означает последовательность оснований, которая при определенном сходстве может вызывать внутримолекулярное или более типично межмолекулярное спаривание оснований в неоднозначных парах G-C, A-U и/или G-U. В одном варианте осуществления изобретения степень самокомплементарности равна, по крайней мере, 50%. Например, 8-мер, который является самокомплементарным, по крайней мере, на 50%, может иметь последовательность, способную образовывать 4, 5, 6, 7 или 8 неоднозначных пар оснований G-C, A-U и/или G-U. Такие пары оснований могут, хотя и необязательно, включать основания, расположенные у любого конца самокомплементарного олигомера РНК. Когда стабилизация нуклеиновой кислоты имеет важное значение для олигомеров РНК, такая нуклеиновая кислота может быть успешно "сцеплена" с одним или обоими концами двухцепочечной нуклеиновой кислоты путем спаривания оснований или любым другим приемлемым способом. Степень самокомплементарности может зависеть от сходства олигомеров, и такое сходство может включать или не включать перекрывания одного или нескольких нуклеозидов. В других вариантах осуществления изобретения степень самокомплементарности равна, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, по крайней мере, 90% или даже 100%. Несмотря на вышеизложенное, следует отметить, что двухцепочечная структура не является обязательным требованием, предъявляемым к олигомерам РНК по данному изобретению.

Аналогичные принципы применимы к межмолекулярному спариванию оснований олигонуклеотидов РНК с разными последовательностями оснований. Так, при совместном использовании нескольких олигомеров РНК указанные олигомеры могут, хотя и необязательно, включать последовательности, которые, по крайней мере, частично комплементарны друг другу. В одном варианте осуществления изобретения несколько олигомеров включают олигомер, имеющий первую последовательность оснований, и олигомер, имеющий вторую последовательность оснований, где первая и вторая последовательности оснований являются комплементарными, по крайней мере, на 50%. Например, два 8-мера, комплементарные, по крайней мере, на 50%, могут образовывать 4, 5, 6, 7 или 8 неоднозначных пар оснований G-C, A-U и/или G-U. Такие пары оснований могут, хотя и необязательно, включать основания, расположенные у любого конца комплементарных олигомеров РНК. Степень комплементарности может зависеть от сходства олигомеров, и такое сходство может включать или не включать перекрывания одного или нескольких нуклеозидов. В других вариантах осуществления изобретения степень комплементарности равна, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, по крайней мере, 90% или даже 100%.

Альтернативно нуклеиновая кислота может быть стабилизирована путем модификации фосфатного остова. Предпочтительные стабилизированные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению имеют модифицированный остов. Установлено, что модификация остова нуклеиновой кислоты сообщает повышенную активность нуклеиновым кислотам при введении in vivo. Одним типом модификации остова является модификация фосфатного остова. Введение в иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, по крайней мере, двух фосфортиоатных связей у 5'-конца олигонуклеотида и нескольких (предпочтительно пяти) фосфортиоатных связей у 3'-конца может в некоторых случаях сообщить максимальную активность и защитить нуклеиновую кислоту от разрушения внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами. Другими модифицированными нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, модифицированные фосфодиэфиром, комбинации нуклеиновых кислот, содержащих фосфодиэфир и фосфортиоат, алкилфосфонат и арилфосфонат, алкилфосфортиоат и арилфосфортиоат, метилфосфонат, метилфосфортиоат, фосфордитиоат, п-этокси, морфолино и их комбинации. Нуклеиновые кислоты, имеющие фосфортиоатные связи, сообщают максимальную активность и защищают нуклеиновую кислоту от разрушения внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами и их комбинациями. Все такие комбинации и их конкретное воздействие на иммунные клетки более подробно рассмотрены на примере CpG-содержащих нуклеиновых кислот в выданных патентах США №№ 6207646 и 6239116, которые полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Считается, что указанные модифицированные нуклеиновые кислоты могут оказывать более сильное стимулирующее действие благодаря повышенной устойчивости к нуклеазе, более высокому поглощению клетками, более интенсивному связыванию белка и/или измененной локализации внутри клетки.

Модифицированные остовы, такие как фосфортиоаты, можно синтезировать автоматическими методами на основе химии фосфорамидатов или Н-фосфонатов. Арил- и алкилфосфонаты можно получить, например, в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 4469863, и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженная кислородная часть алкилирована способом, описанным в патенте США № 5023243 и европейском патенте № 092574) можно получить при помощи автоматического твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реагентов. В научных публикациях описаны способы выполнения других модификаций и замещений в остове ДНК; Uhlmann E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165.

Другие стабилизированные нуклеиновые кислоты включают неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный кислород фосфоната заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфир и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная часть молекулы алкилирована. Кроме того, установлено, что нуклеиновые кислоты, содержащие диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, у любого или обоих концов, по существу устойчивы к разрушению нуклеазой.

Другой класс модификаций остова включает 2'-О-метилрибонуклеозиды (2'-ОМе). Замещения указанных типов всесторонне описаны в научных публикациях, и, в частности, вызываемые ими иммуностимулирующие свойства рассмотрены в статье Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:24:3453-8. В указанной статье описаны способы выполнения модификаций 2'-ОМе в нуклеиновых кислотах.

Олигомеры иммуностимулирующей G,U-содержащей РНК по данному изобретению обычно имеют цепь длиной от около 5 до около 40 нуклеотидов. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретения олигомер G,U-содержащей РНК может иметь цепь, состоящую из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. В одном варианте осуществления изобретения олигомер G,U-содержащей РНК может включать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. В одном варианте осуществления изобретения олигомер G,U-содержащей РНК может включать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидов. В одном варианте осуществления изобретения олигомер G,U-содержащей РНК может включать 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеотидов.

Например, установлено, что для использования в композициях по настоящему изобретению пригодны олигомеры РНК с нижеследующими последовательностями оснований: 5'-GUGUUUAC-3', 5'-GUAGGCAC-3', 5'-CUAGGCAC-3', 5'-CUCGGCAC-3' и 5'-GUGUUUAC-3' в комбинации с 5'-GUAGGCAC-3'.

Так как установлено, что иммуностимулирующее действие олигомеров G,U-содержащей РНК по данному изобретению зависит от МуD88, авторы данного изобретения считают, что олигомеры иммуностимулирующей G,U-содержащей РНК по данному изобретению могут взаимодействовать, по крайней мере, с одним рецептором TLR, что является одной стадией проявления иммуностимулирующего действия. Таким образом, олигомеры иммуностимулирующей G,U-содержащей РНК по данному изобретению могут представлять или имитировать, по крайней мере, части естественных лигандов, по крайней мере, для одного рецептора TLR. Такие естественные лиганды могут включать рибосомную РНК, прокариотическую или эукариотическую, а также некоторые вирусные РНК. Рецепторами TLR могут быть TLR8, TLR7 или некоторые еще не идентифицированные рецепторы TLR. Естественные лиганды для TLR1, TLR7, TLR8 и TLR10 ранее не были описаны в научной литературе.

Установлено, что молекулы иммуностимулирующей РНК по данному изобретению встречаются в природе во всех типах РНК, обычно в сочетании с сильноконсервативной последовательностью или главным структурным признаком. В одном примере было показано, что иммуностимулирующая РНК присутствует на внутреннем аминоацильном сайте рибосомы (IRES).

IRES является минимальным цис-действующим элементом РНК, присутствующим в структуре комплекса в 5'-концевой нетранслируемой области (5' UTR) вирусной РНК и других мРНК, который регулирует инициацию трансляции вирусного генома независимо от кэп-группировки; Hellen C.U. et al. (2001) Genes Dev. 15:1593-1612. Независимая от кэп-группировки инициация трансляции вирусной РНК была впервые обнаружена в пикорнавирусах; Jackson R.J. et al. (1990) Trends Biochem. Sci. 15:477-83; Jackson R.J. et al. (1995) RNA 1:985-1000.

В большинстве эукариотических клеток трансляцию мРНК инициирует рекрутинг эукариотического фактора инициации кэп-связывающего комплекса (eIF)4F, включающего eIF4E (кэп-связывающий белок), eIF4A и eIF4G, в направлении 5'-кэппированного конца мРНК. Рибосомная субъединица 40S, несущая eIF3, и тройной инициирующий комплекс тРНК-eIF2-GTP затем перемещаются к 5'-концу мРНК в результате взаимодействия eIF3 и eIF4G. Затем субъединица 40S сканирует мРНК в направлении от 5'-конца к 3'-концу, пока она не находит соответствующий инициирующий кодон, с которым связывается антикодон инициирующей метионин-тРНК, при этом происходит связывание субъединицы 60S с образованием рибосомы 80S, после чего начинается трансляция.

Таким образом, считается, что значение IRES, по крайней мере, для вируса состоит в способности IRES сообщать преимущественную избирательность вирусу по сравнению с зависимой от кэп-группировки трансляцией в клетке.

Известно, что элементы IRES имеют в своем геноме следующие вирусы: все пикорнавирусы, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус классической лихорадки свиней, вирус паралича бескрылых насекомых, вирус энцефаломиокардита, вирус ящура, вирус мышиного лейкоза Фрейнда gag мРНК, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека env мРНК, вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши, вирус мышиного лейкоза Молони gag мРНК, кишечный вирус Plautia stali, полиовирус, риновирус, вирус Rhopalosiphum padi и вирус саркомы Рауса; Hellen C.U. et al. (2001) Genes Dev. 15:1593-1612. Приведенный перечень не ограничивает объема изобретения.

Вирусные белки вируса гепатита С (HCV) транслируются из одноцепочечной положительной смысловой РНК длиной 9,5 т.п.о., которая фланкирована 5'- и 3'-концевыми нетранслируемыми областями (UTR). Высококонсервативная 5'-концевая UTR включает IRES, присутствующий в нуклеотидах 40-370; Reynolds J.E. et al. (1996) RNA 2:867-78. Считается, что 5'-концевая UTR HCV имеет четыре основных структурных домена (I-IV), из которых домены II и III имеют субдомены. Субдомен IIId включает стволовую петлю из 27 нуклеотидов (нуклеотиды 253-279), которая в результате исследований мутаций in vivo была признана важной для IRES-опосредованной трансляции HCV; Kieft J.S. (1999) J. Mol. Biol. 292:513-29; Klinck R. et al. (2000) RNA 6:1423-31. Последовательность 27-мера IIId представляет собой 5'-GCCGAGUAGUGUUGGGUCGCGAAAGGC-3' (SEQ ID NO:4), где UUGGGU образует концевую петлю. Известно, что структура стволовой петли включает несколько пар оснований, не являющихся парами Ватсона-Крика, которые типичны для других РНК, включая неоднозначные пары оснований U-G, U-A, G-A и А-А.

В качестве другого примера можно отметить, что последовательности иммуностимулирующей РНК по данному изобретению обнаружены в последовательности с высоким содержанием G и U у 5'-конца вирусной РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), что имеет важное значение для эффективной упаковки вирусной РНК; Russell R.S. et al. (2002) Virology 303:152-63. В частности, две основные последовательности с высоким содержанием G и U в U5, а именно 5'-GUAGUGUGUG-3' (SEQ ID NO:2) и 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEQ ID NO:3), соответствующие нуклеотидам 99-108 и 112-123 штамма ВН10, обладают высокой иммуностимулирующей активностью (см. нижеследующий пример 11). Следует отметить, что SEQ ID NO:2 содержит как GUAGU, так и GUGUG, и SEQ ID NO:3 содержит GUGUG.

В соответствии с другим примером обнаружено, что последовательности иммуностимулирующей РНК по данному изобретению встречаются в петле Е рибосомной РНК 5S в большом числе видов бактерий.

Рецепторы TLR8 и TLR7 характеризуются значительной гомологией последовательности с TLR9 (фиг. 8). TLR9 является рецептором CpG-содержащей ДНК и передает иммуностимулирующие сигналы. В TLR9 обнаружены два ДНК-связывающих мотива (заявка на патент США № 09/954987), которые присутствуют также в TLR8 и TLR7 с некоторыми модификациями (фиг. 9). Однако, несмотря на подобное сходство, рецепторы TLR7 и TLR8 не связывают CpG-содержащую ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением установлено, что гуанозин, в частности гуанозин в сочетании с урацилом, и некоторые гуанозинсодержащие нуклеиновые кислоты и их производные являются естественными лигандами TLR8. Кроме того, обнаружено, что молекулы РНК, окисленной РНК, нуклеиновых кислот с высоким содержанием G и U и, по крайней мере, частично двухцепочечных нуклеиновых кислот, имеющие, по крайней мере, одну пару оснований G-U, являются лигандами TLR8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения с использованием гуанозина, производных гуанозина и нуклеиновых кислот с высоким содержанием G и U гуанозин является рибонуклеозидом. Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие GUU, GUG, GGU, GGG, UGG, UGU, UUG, UUU, любые их повторы и комбинации, как полагают, являются лигандами TRL8. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганд TLR8 является олигонуклеотидом с высоким содержанием G и U, который включает гексамерную последовательность (UUGUGG)_n, (UGGUUG)_n, (GUGUGU)_n или (GGGUUU)n, где n является целым числом от 1 до 8, и предпочтительно n равно, по крайней мере, 3. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением также обнаружено, что смесь ванадильных комплексов рибонуклеозидов (то есть смеси ванадильных комплексов аденин, цитозин, гуанозин и урацилрибонуклеозида) и используемые отдельно ванадильные комплексы гуанозинрибонуклеозидов являются лигандами TLR8. Кроме того, установлено, что некоторые имидазохинолины, включая резихимод и имихимод, являются лигандами TLR8.

В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что гуанозин и некоторые гуанозинсодержащие нуклеиновые кислоты и их производные являются естественными лигандами TLR7. Установлено, что молекулы РНК, окисленной РНК, нуклеиновых кислот с высоким содержанием G и, по крайней мере, частично двухцепочечных нуклеиновых кислот с высоким содержанием G являются лигандами TLR7. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, в которых использован гуанозин, производные гуанозина и нуклеиновые кислоты с высоким содержанием G, гуанозин является рибонуклеозидом. Кроме того, установлено, что смеси ванадильных комплексов рибонуклеозидов (то есть смеси ванадильных комплексов аденин, цитозин, гуанозин и урацилрибонуклеозидов) и используемые отдельно ванадильные комплексы гуанозинрибонуклеозидов являются лигандами TLR7. Помимо этого обнаружено, что 7-аллил-8-оксогуанозин (локсорибин) является лигандом TLR7.

Считается, что помимо наличия разнообразных лигандов разные рецепторы TLR по-разному экспрессированы в разных тканях и разных типах иммунных клеток. Например, известно, что рецептор TLR7 человека экспрессирован в плаценте, легком, селезенке, лимфатических узлах, миндалинах и на дендритных клетках-предшественниках плазмацитоидных клеток (pDC); Chuang T-H et al. (2000) Eur. Cytokine Netw. 11:372-8); Kadowaki N. et al. (2001) J. Exp. Med. 194:863-9. Известно, что рецептор TLR8 человека экспрессирован в легком, лейкоцитах периферической крови (PBL), плаценте, селезенке, лимфатических узлах и на моноцитах; Kadowaki N. et al. (2001) J. Exp. Med. 194:863-9; Chuang T-H et al. (2000) Eur. Cytokine Netw. 11:372-8. В научных публикациях указано, что рецептор TLR9 человека экспрессирован в селезенке, лимфатических узлах, костном мозге, PBL и на pDC, В-клетках и CD123+ DC; Kadowaki N. et al. (2001) J. Exp. Med. 194:863-9; Bauer S. et al. (2001) Proc Natl. Acad. Sci. USA 98:9237-42; Chuang T-H et al. (2000) Eur. Cytokine Netw. 11:372-8.

Производные гуанозина ранее были описаны как активаторы В-клеток и NK-клеток, но их рецепторы и механизм действия были неизвестны; Goodman M.G. et al. (1994) J. Pharm. Exp. Ther. 274:1552-57; Reitz A.B. et al. (1994) J. Med. Chem. 37:3561-78. Такие производные гуанозина включают, не ограничиваясь ими, 8-бромгуанозин, 8-оксогуанозин, 8-меркаптогуанозин и 7-аллил-8-оксогуанозин (локсорибин).

Считается, что имидазохинолины, которые являются синтетическими низкомолекулярными модификаторами иммунного ответа, индуцируют экспрессию нескольких цитокинов, включая интерфероны (например, IFN-α и IFN-γ), альфа-фактор некроза опухоли (TNF-α) и некоторые интерлейкины (например, IL-1, IL-6 и IL-12). Имидазохинолины могут стимулировать иммунный ответ типа Th1, о чем частично свидетельствует их способность индуцировать повышение уровней IgG2a. Имидазохинолины также могут ингибировать продуцирование Th2-цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-13. Некоторые цитокины, индуцированные имидазохинолинами, продуцируются макрофагами и дендритными клетками. Известно, что некоторые виды имидазохинолинов повышают литическую активность NK-клеток и стимулируют пролиферацию и дифференцировку В-клеток, индуцируя тем самым продуцирование и секрецию антител.

В используемом здесь значении имидазохинолины включают имидазохинолин-амины, имидазопиридин-амины, 6,7-конденсированные циклоалкилимидазопиридин-амины и имидазохинолин-амины, соединенные мостиковой связью у атомов 1,2. Указанные соединения описаны в патентах США №№ 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5494916, 5482936, 5525612, 6039969 и 6110929. Определенные типы имидазохинолинов включают 4-амино-α,α-диметил-2-этоксиметил-1Н-имидазо[4,5-c]хинолин-1-этанол (резихимод или R-848 или S-28463, PCT/US01/28764, WO 02/22125) и 1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-c]хинолин-4-амин (имихимод или R-837 или S-26308). В настоящее время имихимод используют для местного лечения бородавок, таких как остроконечные и анальные бородавки, и выполняют испытания по его применению для местного лечения базально-клеточного рака.

Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности рецептора TLR3 человека и мыши. См., например, банк генов под номерами доступа U88879, NM_003265, NM_126166, AF355152 и ААС34134, NP_003256, NP_569054, AAK26117. Известно, что рецептор TLR3 человека содержит 904 аминокислоты и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:20. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:21. Рецептор TLR3 мыши содержит 905 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:22. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:23. Полипептид TLR3 включает внеклеточный домен, имеющий область повторов с высоким содержанием лейцина, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен TIR.

В используемом здесь значении термин "полипептид TLR3" означает полипептид, представляющий собой непроцессированный рецептор TLR3, соответствующий одной из приведенных выше последовательностей, ортологи, аллельные варианты, SNP, варианты, включающие консервативные замены аминокислот, слитые белки TLR3 и функциональные фрагменты любых вышеуказанных последовательностей. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают полипептиды TLR3 человека, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR3 человека SEQ ID NO:20. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают также полипептиды TLR3 мыши, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR3 мыши SEQ ID NO:22.

В используемом здесь значении термин "передача сигнала рецептором TLR3" означает способность полипептида TLR3 активировать путь передачи сигнала TLR/IL-1R (TIR), определяемый также как путь трансдукции сигнала TLR. Изменение активности TLR3 можно измерить при помощи анализов, представленных в данном описании изобретения, включая экспрессию генов под контролем κВ-чувствительных промоторов и энхансеров. Такие естественные гены включают гены, кодирующие IL-1β, IL-6, IL-8, субъединицу p40 интерлейкина 12 (IL-12 p40) и костимулирующие молекулы CD80 и CD86. Другие гены могут контролироваться регуляторными элементами (см. ниже) и, таким образом, могут служить для определения уровня передачи сигнала TLR3. К SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:23 можно добавить дополнительную нуклеотидную последовательность, предпочтительно у 5'-конца или 3'-конца открытой рамки считывания SEQ ID NO:21, в результате чего образуется нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид, включающий детектируемую или репортерную часть, например, FLAG, люциферазу (luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие, известные специалистам в данной области.

SEQ ID NO:20Аминокислотная последовательность TLR3 человека

SEQ ID NO:21Нуклеотидная последовательность TLR3 человека

SEQ ID NO:22Аминокислотная последовательность TLR3 мыши

SEQ ID NO:23Нуклеотидная последовательность TLR3 мыши

Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности TLR7 человека и мыши. См., например, банк генов под номерами доступа AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211 и ААF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191, AAL73192. Рецептор TLR7 человека содержит 1049 аминокислот и имеет последоватеьность, представленную SEQ ID NO:24. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:25. Рецептор TLR7 мыши содержит 1050 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:26. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:27. Полипептид TLR7 включает внеклеточный домен, имеющий область повторов с большим содержанием лейцина, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен TIR.

В используемом здесь значении термин "полипептид TLR7" означает полипептид, представляющий собой непроцессированный рецептор TLR7, соответствующий одной из приведенных выше последовательностей, ортологи, аллельные варианты, SNP, варианты, включающие консервативные замены аминокислот, слитые белки TLR7 и функциональные фрагменты любых вышеуказанных последовательностей. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают полипептиды TLR7 человека, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR7 человека SEQ ID NO:24. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают также полипептиды TLR7 мыши, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR7 мыши SEQ ID NO:26.

В используемом здесь значении термин "передача сигнала рецептором TLR7" означает способность полипептида TLR7 активировать путь передачи сигнала TLR/IL-1R (TIR), определяемый также как путь трансдукции сигнала TLR. Изменение активности TLR7 можно измерить при помощи анализов, представленных в данном описании изобретения, включая экспрессию генов под контролем κВ-чувствительных промоторов и энхансеров. Такие естественные гены включают гены, кодирующие IL-1β, IL-6, IL-8, субъединицу p40 интерлейкина 12 (IL-12 p40) и костимулирующие молекулы CD80 и CD86. Другие гены могут контролироваться регуляторными элементами (см. ниже) и, таким образом, могут служить для определения уровня передачи сигнала TLR7. К SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27 можно добавить дополнительную нуклеотидную последовательность, предпочтительно у 5'-конца или 3'-конца открытой рамки считывания SEQ ID NO:25, в результате чего образуется нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид, включающий детектируемую или репортерную часть, например, FLAG, люциферазу (luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие, известные специалистам в данной области.

SEQ ID NO:24Аминокислотная последовательность TLR7 человека

SEQ ID NO:25Нуклеотидная последовательность TLR7 человека

SEQ ID NO:26Аминокислотная последовательность TLR7 мыши

SEQ ID NO:27Нуклеотидная последовательность TLR7 мыши

Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности TLR8 человека и мыши. См., например, банк генов под номерами доступа AF246971, AF245703, NM_016610, ХМ_045706, AY035890, NM_133212 и AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677, NP_573475. Рецептор TLR8 человека существует, по крайней мере, в виде двух изомеров, один из которых содержит 1041 аминокислоту и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:28, и другой содержит 1059 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:30. Соответствующие нуклеотидные последовательности представлены SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:31 соответственно. Считается, что более короткая из двух указанных изоформ имеет большее значение. Рецептор TLR8 мыши содержит 1032 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:32. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:33. Полипептид TLR8 включает внеклеточный домен, имеющий область повторов с большим содержанием лейцина, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен TIR.

В используемом здесь значении термин "полипептид TLR8" означает полипептид, представляющий собой непроцессированный рецептор TLR8, соответствующий одной из приведенных выше последовательностей, ортологи, аллельные варианты, SNP, варианты, включающие консервативные замены аминокислот, слитые белки TLR8 и функциональные фрагменты любых вышеуказанных последовательностей. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают полипептиды TLR8 человека, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR8 человека SEQ ID NO:28. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают также полипептиды TLR8 мыши, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR8 мыши SEQ ID NO:32.

В используемом здесь значении термин "передача сигнала рецептором TLR8" означает способность полипептида TLR8 активировать путь передачи сигнала TLR/IL-1R (TIR), определяемый также как путь трансдукции сигнала TLR. Изменение активности TLR8 можно измерить при помощи анализов, представленных в данном описании изобретения, включая экспрессию генов под контролем κВ-чувствительных промоторов и энхансеров. Такие естественные гены включают гены, кодирующие IL-1β, IL-6, IL-8, субъединицу p40 интерлейкина 12 (IL-12 p40) и костимулирующие молекулы CD80 и CD86. Другие гены могут контролироваться регуляторными элементами (см. ниже) и, таким образом, могут служить для определения уровня передачи сигнала TLR8. К SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:33 можно добавить дополнительную нуклеотидную последовательность, предпочтительно у 5'-конца или 3'-конца открытой рамки считывания SEQ ID NO:29, в результате чего образуется нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид, включающий детектируемую или репортерную часть, например FLAG, люциферазу (luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие, известные специалистам в данной области.

SEQ ID NO:28Аминокислотная последовательность TLR8 человека (1041)

SEQ ID NO:29Нуклеотидная последовательность TLR8 человека

SEQ ID NO:30Аминокислотная последовательность TLR8 человека (1059)

SEQ ID NO:31Нуклеотидная последовательность TLR8 человека

SEQ ID NO:32Аминокислотная последовательность TLR8 мыши

SEQ ID NO:33Нуклеотидная последовательность TLR8 мыши

Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности TLR9 человека и мыши. См., например, банк генов под номерами доступа NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178 и NP_059138, AAF72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488, NP_112455. Рецептор TLR9 человека существует, по крайней мере, в виде двух изомеров, один из которых содержит 1032 аминокислоты и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:34, и другой содержит 1055 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:36. Соответствующие нуклеотидные последовательности представлены SEQ ID NO:35 и SEQ ID NO:37. Считается, что более короткая из двух указанных изоформ имеет большее значение. Рецептор TLR9 мыши содержит 1032 аминокислот и имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:38. Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO:39. Полипептид TLR9 включает внеклеточный домен, имеющий область повторов с большим содержанием лейцина, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен TIR.

В используемом здесь значении термин "полипептид TLR9" означает полипептид, представляющий собой непроцессированный рецептор TLR9, соответствующий одной из приведенных выше последовательностей, ортологи, аллельные варианты, SNP, варианты, включающие консервативные замены аминокислот, слитые белки TLR9 и функциональные фрагменты любых вышеуказанных последовательностей. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают полипептиды TLR9 человека, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR9 человека SEQ ID NO:34. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают также полипептиды TLR9 мыши, у которых последовательность, по крайней мере, на 65%, более предпочтительно, по крайней мере, на 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 95% идентична аминокислотной последовательности TLR9 мыши SEQ ID NO:38.

В используемом здесь значении термин "передача сигнала рецептором TLR9" означает способность полипептида TLR9 активировать путь передачи сигнала TLR/IL-1R (TIR), определяемый также как путь трансдукции сигнала TLR. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно признать, что путь передачи сигнала TLR/IL-1R обеспечивает передачу сигнала при помощи молекул миелоидного дифференцирующего маркера 88 (MyD88) и фактора 6 (TRAF6), ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TNF), активирующих киназы в киназном комплексе IκВ и NH₂-концевые киназы с-jun (например, Jnk 1/2); Häcker H. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:595-600. Изменение активности TLR9 можно измерить при помощи анализов, представленных в данном описании изобретения, включая экспрессию генов под контролем κВ-чувствительных промоторов и энхансеров. Такие естественные гены включают гены, кодирующие IL-1β, IL-6, IL-8, субъединицу p40 интерлейкина 12 (IL-12 p40) и костимулирующие молекулы CD80 и CD86. Другие гены могут контролироваться регуляторными элементами (см. ниже) и, таким образом, могут служить для определения уровня передачи сигнала TLR9. К SEQ ID NO:35 или SEQ ID NO:39 можно добавить дополнительную нуклеотидную последовательность, предпочтительно у 5'-конца или 3'-конца открытой рамки считывания SEQ ID NO:35, в результате чего образуется нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид, включающий детектируемую или репортерную часть, например FLAG, люциферазу (luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие, известные специалистам в данной области.

SEQ ID NO:34Аминокислотная последовательность TLR9 человека (1032)

SEQ ID NO:35Нуклеотидная последовательность TLR9 человека

SEQ ID NO:36Аминокислотная последовательность TLR9 человека (1055)

SEQ ID NO:37Нуклеотидная последовательность TLR9 человека

SEQ ID NO:38Аминокислотная последовательность TLR9 мыши

SEQ ID NO:39Нуклеотидная последовательность TLR9 мыши

Ванадильные комплексы рибонуклеозидов (то есть смеси ванадильных комплексов аденин-, цитозин-, гуанозин- и урацилрибонуклеозидов) хорошо известны специалистам в данной области в качестве ингибиторов РНКазы; Berger S.L. et al. (1979) Biochemistry 18:5143; Puskas R.S. et al. (1982) Biochemistry 21:4602. Ванадильные комплексы рибонуклеозидов можно приобрести коммерческим путем у разных поставщиков, в том числе в компании Sigma-Aldrich, Inc.

В одном варианте осуществления изобретения олигомер иммуностимулирующей G,U-содержащей РНК по данному изобретению не содержит динуклеотида CpG и не является CpG-содержащей иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению используют CpG-содержащую иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту.

CpG-содержащая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой, содержащей динуклеотид CG с неметилированным остатком С. Известно, что CpG-содержащие иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты стимулируют иммунные реакции Th1-типа. CpG-содержащие последовательности, которые относительно редко встречаются в ДНК человека, обычно можно обнаружить в ДНК инфекционных микроорганизмов, таких как бактерии. Иммунная система человека в ходе эволюции, по-видимому, приобрела способность распознавать CpG-содержащие последовательности как раннее предупреждение о появлении инфекции и инициировать немедленный и мощный иммунный ответ против проникающих патогенов, не вызывая вредных реакций, которые часто характерны для других иммуностимулирующих веществ. Таким образом, полагаясь на указанный врожденный механизм иммунной защиты, можно использовать CpG-содержащие нуклеиновые кислоты в качестве уникального и естественного средства для иммунотерапии. Модулирующее действие, оказываемое CpG-содержащими нуклеиновыми кислотами на иммунную систему, всесторонне описано в патентах США №№ 6194388 В1, 6207646 В1, 6239116 В1 и 6218371 В1 и опубликованных заявках на патент, таких как РСТ/US98/03678, PCT/US98/10408, PCT/US98/04703 и PCT/US99/09863. Указанные патенты и заявки на патент полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

CpG-содержащая нуклеиновая кислота является нуклеиновой кислотой, которая имеет, по крайней мере, один неметилированный динуклеотид CpG. Нуклеиновая кислота, содержащая, по крайней мере, один неметилированный динуклеотид CpG, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает неметилированный цитозин в динуклеотидной последовательности цитозин-гуанин (то есть "CpG-содержащая ДНК" или ДНК, содержащая 5'-цитозин и 3'-гуанозин, связанные фосфатной связью) и активирует иммунную систему. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Двухцепочечные молекулы являются более устойчивыми in vivo, в то время как одноцепочечные молекулы обладают более сильной иммунной активностью. Таким образом, в одних вариантах осуществления изобретения желательна одноцепочечная нуклеиновая кислота, а в других вариантах осуществления изобретения желательна двухцепочечная нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота, хотя и является одноцепочечной, может образовывать вторичные и третичные структуры (например, путем складчатого сворачивания или гибридизации с самой собой на протяжении всей цепи или в выбранных сегментах). Поэтому хотя первичная структура такой нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной, ее структуры высшего порядка могут быть двух- или трехцепочечными. Термины "CpG-содержащая нуклеиновая кислота" или "CpG-содержащий олигонуклеотид" в используемом здесь значении означают иммуностимулирующую CpG-содержащую нуклеиновую кислоту за исключением особо оговоренных случаев. Вся иммуностимулирующая нуклеиновая кислота или ее части могут быть неметилированными, и только остаток С в последовательности 5'-CG-3' должен быть не метилирован.

Одним объектом настоящего изобретения является способ активации иммунной клетки. Данный способ включает контактирование иммунной клетки с вышеописанной иммуностимулирующей композицией по данному изобретению, используемой в эффективном количестве для активации иммунной клетки. В используемом здесь значении термин "иммунная клетка" означает клетку, которая относится к иммунной системе. Иммунные клетки участвуют в возникновении и регуляции воспалительных и иммунных реакций. Такие клетки включают, не ограничиваясь ими, В-лимфоциты (В-клетки), Т-лимфоциты (Т-клетки), естественные клетки-киллеры (NK-клетки), дендритные клетки, другие тканеспецифические антигенпредставляющие клетки (например, клетки Лангерганса), макрофаги, моноциты, гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и мастоциты. Спленоциты, тимоциты и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) содержат иммунные клетки. Иммунные клетки можно выделить из крови, селезенки, костного мозга, лимфатических узлов, тимуса и других тканей способами, известными специалистам в данной области. Иммунные клетки могут также включать определенные линии клеток, а также первичные культуры, сохраняемые in vitro или ex vivo.

В одном варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию цитокина такой иммунной клеткой. В другом варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает секрецию хемокина такой иммунной клеткой. В другом варианте осуществления изобретения активация иммунной клетки предполагает экспрессию костимулирующей/вспомогательной молекулы такой иммунной клеткой. В одном варианте осуществления изобретения костимулирующую/вспомогательную молекулу выбирают из группы, включающей межклеточные адгезивные молекулы (ICAM, например CD54), антигены, взаимосвязанные с функцией лейкоцитов (LFA, например CD58), B7 (CD80, CD86) и CD40.

Термин "активация иммунной клетки" означает переход иммунной клетки из состояния покоя в состояние повышенной метаболической активности и образование фенотипа, обусловленного функцией иммунной клетки. Такая функция иммунной клетки может включать, например, секрецию растворимых продуктов, таких как иммуноглобулины, цитокины и хемокины; экспрессию костимулирующих/вспомогательных молекул и антигенов МНС на поверхности клетки; миграцию иммунной клетки; фагоцитоз и цитотоксическую активность в отношении клеток-мишеней и созревание иммунной клетки. В некоторых случаях активация иммунитета может означать активацию иммунного ответа типа Th1, в других случаях активация иммунитета может означать активацию иммунного ответа типа Th2.

Термин "активация иммунного ответа типа Th1" в используемом здесь значении означает активацию в иммунных клетках экспрессии Th1-подобных секретируемых продуктов, включая определенные цитокины, хемокины и подклассы иммуноглобулина, и активацию определенных иммунных клеток. Th1-подобные секретируемые продукты включают, например, цитокины IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α и хемокины IP-10 (CXCL10). У мышей активация иммунного ответа типа Th1 стимулирует секрецию IgG2a. Активация иммунного ответа типа Th1 может также включать активацию NK-клеток и дендритных клеток, то есть клеток, вызывающих клеточный иммунитет. Считается, что активация иммунного ответа типа Th1 противодействует активации иммунного ответа типа Th2.

Термин "активация иммунного ответа типа Th2" в используемом здесь значении означает активацию в иммунных клетках экспрессии Th2-подобных секретируемых продуктов, включая определенные цитокины и подклассы иммуноглобулина. Th2-подобные секретируемые продукты включают, например, цитокины IL-4 и IL-10. У мышей активация иммунного ответа типа Th2 стимулирует секрецию IgG1 и IgE. Считается, что активация иммунного ответа типа Th2 противодействует активации иммунного ответа типа Th1.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Данный способ включает введение субъекту композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа у нуждающегося субъекта. Таким образом, композиции по данному изобретению можно использовать для лечения субъекта, нуждающегося в активации иммунитета. Субъект, нуждающийся в активации иммунитета, может быть субъектом, нуждающимся в активации Th1-подобного иммунного ответа.

Композиции и способы по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с другими средствами для лечения субъекта, нуждающегося в активации Th1-подобного иммунного ответа. "Субъект, нуждающийся в активации Th1-подобного иммунного ответа" является субъектом, который болен или подвержен риску возникновению заболевания, лечение которого может дать положительный эффект в результате возникновения иммунного ответа, смещенного в сторону Th1. Такой субъект может быть болен или подвержен риску возникновения Th2-опосредованного заболевания, которое поддается Th1-опосредованной перекрестной регуляции или супрессии. Такие заболевания включают, например, некоторые органспецифические аутоиммунные заболевания. Альтернативно, такой субъект может быть болен или подвержен риску возникновения заболевания, связанного с Th1-дефицитом. Такие заболевания включают, например, опухоли, инфекции, вызываемые внутриклеточными патогенами, и СПИД.

В используемом здесь значении термин "РНК с высоким содержанием G и U" означает РНК, содержащую, по крайней мере, 5 нуклеотидов, в которой, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 80% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% оснований представляют собой гуанин (G) и урацил (U). Такой состав оснований характерен для всей цепи РНК, если ее длина не превышает 10 оснований, и для фрагмента, содержащего, по крайней мере, 10 смежных оснований, если РНК состоит из более чем 10 оснований.

В используемом здесь значении термин "РНК с высоким содержанием G" означает РНК, в которой, по крайней мере, 70%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще предпочтительнее, по крайней мере, 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% оснований представляют собой гуанин (G). Такой состав оснований характерен для всей цепи РНК, если ее длина не превышает 10 оснований, и для фрагмента, содержащего, по крайней мере, 10 смежных оснований, если РНК состоит из более чем 10 оснований.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению включают конъюгат ДНК:РНК. Конъюгат ДНК:РНК представляет собой молекулу или комплекс, который включает, по крайней мере, один дезоксирибонуклеозид, связанный, по крайней мере, с одним рибонуклеозидом. Дезоксирибонуклеозид и рибонуклеозид могут быть связаны в результате взаимодействия пар оснований. Альтернативно, дезоксирибонуклеозид и рибонуклеозид могут быть связаны ковалентной связью, существующей между частями сахара, по крайней мере, в одном дезоксирибонуклеозиде и, по крайней мере, в одном рибонуклеозиде. Ковалентная связь между частями сахара может быть прямой или непрямой, например, создаваемой при помощи линкера. Взаимодействия пар оснований обычно являются, не ограничиваясь ими, нековалентными взаимодействиями пар оснований типа Ватсона-Крика. В объем изобретения входят другие взаимодействия пар оснований, включая нековалентные (например, спаривание оснований Хугстейна) и ковалентные взаимодействия. Взаимодействия пар оснований обычно предполагают образование дуплекса, включающего две цепи, но в объем изобретения входят также взаимодействия более высокого порядка.

Конъюгат ДНК:РНК, включающий ковалентную связь между частями сахара, по крайней мере, в одном дезоксирибонуклеозиде и, по крайней мере, в одном рибонуклеозиде, определяется как химерный остов ДНК:РНК. Конъюгат ДНК:РНК с химерным остовом ДНК:РНК имеет первичную структуру, определяемую последовательностью оснований, и при этом он может также иметь вторичную структуру или структуру более высокого порядка. Вторичная структура или структура более высокого порядка включает, по крайней мере, одно внутримолекулярное взаимодействие пары оснований, например стволовую петлю, или межмолекулярное взаимодействие пары оснований.

Спаривание оснований в гетеродуплексе означает внутримолекулярное или межмолекулярное взаимодействие пар оснований между ДНК и РНК. Например, спаривание оснований в гетеродуплексе может происходить между отдельными молекулами комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК. Альтернативно, как это имеет место в случае приемлемых молекул нуклеиновых кислот с химерным остовом ДНК:РНК, спаривание оснований в гетеродуплексе может происходить между областями комплементарной ДНК и РНК в одной молекуле.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению включают химерный остов ДНК:РНК, имеющий сайт расщепления между ДНК и РНК. Сайт расщепления является структурным элементом в химерном остове, который может быть расщеплен любым приемлемым способом. Сайт расщепления может представлять собой фосфодиэфирную связь, которая относительно хорошо расщепляется эндонуклеазой. В данном случае ДНК и РНК могут иметь стабилизированные межнуклеотидные связи, благодаря чему химерный остов становится особенно подвержен расщеплению эндонуклеазой в месте фосфодиэфирной связи между стабилизированной ДНК и стабилизированной РНК. Сайт расщепления может иметь характеристики, вызывающие его расщепление в определенных условиях рН, например указанная связь может быть относительно устойчивее при более высоком показателе рН, чем при более низком показателе рН, или наоборот. Подобная чувствительность к показателю рН может быть достигнута, например, путем получения композиции химерной ДНК:РНК в липосомах. Сайт расщепления может иметь дисульфидную связь. Такая дисульфидная связь может быть относительно более устойчивой в окислительных условиях, чем в восстановительных условиях, например восстановительные условия присутствуют в эндосоме. Сайт расщепления может также включать линкер, который подвержен расщеплению ферментом при определенном показателе рН, в окислительно-восстановительных условиях или тому подобных условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения данная композиция может включать несколько сайтов расщепления.

Конъюгаты по настоящему изобретению позволяют выбрать фиксированные молярные соотношения компонентов в конъюгатах. В случае конъюгатов ДНК:РНК может быть желательно или удобно иметь соотношение ДНК и РНК, равное 1:1. Конъюгаты, представляющие собой гетеродуплекс ДНК:РНК, обычно характеризуются соотношением ДНК и РНК, равным 1:1. Конъюгаты с химерным остовом ДНК:РНК могут также иметь соотношение ДНК и РНК, равное 1:1. В объем настоящего изобретения входят конъюгаты с другими соотношениями ДНК:РНК, которые включают, не ограничиваясь ими, соотношения 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1, 4:1 и так далее. Конъюгация может стабилизировать один или несколько компонентов по сравнению с устойчивостью, достигаемой при отдельном использовании одного или нескольких компонентов. Конъюгация может также облегчить доставку компонентов в клетки в выбранном соотношении.

Сайты расщепления могут служить нескольким целям по настоящему изобретению. После доставки в представляющую интерес клетку компоненты, связанные при помощи сайта (или сайтов) расщепления, могут высвобождаться, становясь независимо или оптимально активными в самой клетке или рядом с клеткой. В некоторых вариантах осуществления изобретения сайты расщепления могут иметь важное значение для фармакокинетики, по крайней мере, одного из компонентов конъюгата. Например, сайты расщепления могут быть созданы и выбраны с целью увеличения времени высвобождения одного из компонентов.

Настоящее изобретение относится к эффективным способам идентификации иммуностимулирующих соединений, а также к идентифицированным соединениям и средствам. Способы скрининга обычно включают анализ соединений, подавляющих или усиливающих передачу сигнала при помощи определенного рецептора TLR. При осуществлении указанных способов используют рецептор TLR, приемлемый контрольный лиганд для TLR и предполагаемое иммуностимулирующее соединение. Выбранный рецептор TLR вводят в соприкосновение с приемлемым контрольным соединением (лигандом TLR) и измеряют TLR-опосредованный контрольный сигнал. Выбранный рецептор TLR вводят также в соприкосновение с предполагаемым иммуностимулирующим соединением и измеряют TLR-опосредованный испытуемый сигнал. Затем испытуемый сигнал сравнивают с контрольным сигналом. Иммуностимулирующее соединение, активность которого подтверждена анализом, затем можно использовать в качестве контрольного соединения в данном анализе. Такие способы могут быть автоматизированы для высокопроизводительного скрининга предполагаемых соединений. Примеры таких высокопроизводительных способов скрининга описаны в патентах США №№ 6103479, 6051380, 6051373, 5998152, 5876946, 5708158, 5443791, 5429921 и 5143854.

Анализируемая смесь включает предполагаемое иммуностимулирующее соединение. Обычно параллельно исследуют несколько анализируемых смесей в разных концентрациях, чтобы выявить разную реакцию на разные концентрации. Как правило, одна из указанных концентраций служит в качестве отрицательного контрольного параметра, то есть соответствует нулевой концентрации средства или концентрации средства ниже пределов обнаружения. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут относиться к разным химическим классам, хотя обычно они являются органическими соединениями. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения предпочтительно являются низкомолекулярными органическими соединениями, то есть соединениями с молекулярной массой больше 50, но меньше примерно 2500. Полимерные предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут иметь более высокую молекулярную массу, например молекулярная масса олигонуклеотидов находится в пределах от около 2500 до около 12500. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут содержать функциональные химические группы, необходимые для структурного взаимодействия с полипептидами, и могут включать, по крайней мере, одну аминогруппу, карбонильную, гидроксильную или карбоксильную группу, предпочтительно, по крайней мере, две функциональные химические группы и более предпочтительно, по крайней мере, три функциональные химические группы. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут иметь циклическую углеродную или гетероциклическую структуру и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или несколькими вышеуказанными функциональными группами. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут также представлять собой биомолекулы, такие как нуклеиновые кислоты, пептиды, сахариды, жирные кислоты, стерины, изопреноиды, пурины, пиримидины, производные или структурные аналоги вышеуказанных веществ или их комбинации и тому подобные. Если предполагаемое иммуностимулирующее соединение является нуклеиновой кислотой, такое соединение обычно представляет собой молекулу ДНК или РНК, хотя в объем настоящего изобретения входят также модифицированные нуклеиновые кислоты, содержащие искусственные связи или субъединицы.

Предполагаемые иммуностимулирующие соединения получают из разных источников, включающих библиотеки природных, синтетических или полусинтетических соединений либо любые комбинации указанных веществ. Например, существует много способов произвольного и направленного синтеза целого ряда органических соединений и биомолекул, в том числе экспрессия рандомизированных олигонуклеотидов, комбинированные библиотеки синтетических органических соединений, библиотеки фагов рандомизированных пептидов и тому подобные. Альтернативно, существуют или могут быть легко созданы библиотеки природных соединений в форме бактериальных, грибных, растительных и животных экстрактов. Кроме того, библиотеки природных и синтетических соединений могут быть легко модифицированы известными химическими, физическими и биохимическими методами. Известные фармакологические средства могут быть подвергнуты направленной или произвольной химической модификации, такой как ацилирование, алкилирование, этерификация, амидирование и т.д., с образованием структурных аналогов предполагаемых иммуностимулирующих соединений.

Таким образом, источником предполагаемых иммуностимулирующих соединений являются библиотеки молекул, созданных на основе известных лигандов TLR, например CpG-содержащих олигонуклеотидов, которые, как известно, взаимодействуют с TLR9, причем структура такого лиганда изменена в одном или нескольких положениях молекулы так, что молекула содержит больше или меньше химических частей или другие химические части. Структурные изменения, внесенные в молекулы при создании библиотек аналогов ингибиторов, могут быть направленными, произвольными или представлять собой комбинацию направленных и произвольных замен и/или добавлений. Специалист в данной области, занимающийся созданием комбинированных библиотек, может легко получить такие библиотеки на основе существующих лигандов TLR9.

Вышеуказанная смесь может содержать ряд других реагентов. Такие реагенты включают соли, буферы, нейтральные белки (например, альбумин), детергенты и т.д., которые можно использовать для облегчения оптимального связывания белок-белок и/или белок-нуклеиновая кислота. Такой реагент может также уменьшать неспецифические или фоновые взаимодействия реакционных компонентов. В состав смеси могут также входить другие реагенты, повышающие эффективность анализа, такие как ингибиторы протеазы, ингибиторы нуклеазы, антимикробные средства и тому подобные.

Можно легко определить порядок добавления компонентов, температуру инкубации, время инкубации и другие параметры анализа. Такое экспериментирование относится только к оптимизации параметров анализа, а не основных принципов анализа. Температура инкубации обычно находится в интервале от 4 до 40°С. Время инкубации предпочтительно является минимальным для облегчения быстрого, высокопроизводительного скрининга и обычно составляет от 1 минуты до 10 часов.

После инкубации любым методом, известным пользователю, детектируют уровень сигнала, передаваемого TLR. При выполнении бесклеточных анализов связывания часто осуществляют стадию разделения для отделения связанных компонентов от несвязанных. Стадия разделения может быть выполнена разными способами. Например, разделение можно произвести в растворе либо, по крайней мере, один из компонентов иммобилизуют на твердом субстрате, от которого можно легко отделить несвязанные компоненты. Твердый субстрат можно изготовить из разных материалов и разной формы, например в качестве субстрата можно использовать титрационный микропланшет, микрошарики, стержень, частицы смолы и т.д. Субстрат предпочтительно выбирают с целью максимального увеличения соотношения сигнал-шум, чтобы прежде всего минимизировать фоновое связывание, а также облегчить разделения и уменьшить затраты.

Разделение можно производить, например, путем удаления шарика или стержня из емкости, сбора или разведения содержимого емкости, такой как лунка титрационного микропланшета, промывания шарика, частицы, хроматографической колонки или фильтра промывочным раствором или растворителем. Стадия разделения предпочтительно включает несколько промывок. Например, когда твердым субстратом является титрационный микропланшет, лунки можно несколько раз промыть промывочным раствором, который обычно включает компоненты инкубируемой смеси, не участвующие в специфическом связывании, такие как соли, буфер, детергент, неспецифический белок и т.д. Когда твердым субстратом является магнитный шарик, такой шарик можно один или несколько раз промыть промывочным раствором и отделить при помощи магнита.

Обнаружение можно произвести любым известным методом клеточного анализа, таким как измерение индуцированного полипептида внутри клетки, на поверхности клетки или секретированного клеткой. Примеры методов обнаружения при помощи клеточных анализов включают сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), биолюминесценцию, флуоресценцию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), полимеразную реакцию синтеза цепи с обратной транскриптазой (RT-PCR) и тому подобные. Примеры методов обнаружения при помощи бесклеточных анализов включают биолюминесценцию, флуоресценцию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), полимеразную реакцию синтеза цепи с обратной транскриптазой (RT-PCR) и тому подобные.

Субъект является человеком или животным, которое включает, не ограничиваясь ими, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, цыпленка, грызунов, например крыс и мышей, примата, например обезьяну, рыбу или виды, разводимые в виде аквакультуры, такие как рыба с хвостовым плавником (например, лосось) и водные животные, имеющие панцирь (например, креветки и гребешки). Субъекты, подлежащие терапевтическому или профилактическому лечению, включают позвоночных и беспозвоночных животных. Указанные субъекты могут быть, не ограничиваясь ими, домашними питомцами (такими как собаки, кошки, рыбки и т.д.), сельскохозяйственными животными (такими как коровы, лошади, свиньи, цыплята и т.д.), лабораторными животными (такими как мыши, крысы, кролики и т.д.), животными в зоопарке (такими как львы, жирафы и т.д.). Хотя многие варианты осуществления изобретения, рассмотренные в данном описании изобретения, относятся к заболеваниям человека, данное изобретение пригодно также для лечения других позвоночных, отличных от человека.

В используемом здесь значении термин "лечить" применительно к одному из описанных выше заболеваний означает как профилактическое лечение, уменьшающее вероятность заболевания субъекта, так и лечение имеющегося заболевания, например ослабление или устранение заболевания или симптомов заболевания либо предотвращение ухудшения заболевания или симптомов заболевания.

Больным субъектом является субъект, имеющий объективно измеряемые признаки заболевания. Так, например, субъект, болеющий раком, имеет обнаруживаемые раковые клетки. Субъект, страдающий инфекционным заболеванием, - это субъект, который испытал воздействие инфекционного микроорганизма, и в его организме обнаружен указанный микроорганизм в острой или хронической форме. Инфекция может быть латентной (спящей) или активной.

Субъект с повышенным риском заболевания является субъектом, который подвержен большему риску возникновения заболевания по сравнению с нормальным риском. Нормальный риск обычно характерен для обычных субъектов, которые не страдают данным заболеванием и не предрасположены к его возникновению, например, с точки зрения генетики или окружающей среды. Таким образом, субъектом с повышенным риском заболевания без каких-либо ограничений может быть субъект, который генетически предрасположен к возникновению заболевания, а также субъект, который испытывает или будет испытывать воздействие агента, находящегося в окружающей среде и вызывающего данное заболевание. Агенты, присутствующие в окружающей среде, обычно включают, не ограничиваясь ими, инфекционные агенты, такие как вирусы, бактерии, грибы и паразиты. Другие агенты, присутствующие в окружающей среде, могут включать, например, табачный дым, определенные органические химические вещества, асбест и тому подобные.

Термин "эффективное количество" нуклеиновой кислоты или другого лечебного средства означает количество, необходимое или достаточное для оказания требуемого биологического действия. Как правило, эффективное количество является таким количеством, которое необходимо для активации иммунной системы, в результате которой возникает антигенспецифический иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота или другое лечебное средство вводят в эффективном количестве для стимуляции или индукции иммунного ответа типа Th1 или общего иммунного ответа. Эффективное количество, необходимое для стимуляции иммунного ответа типа Th1, можно определить как количество, стимулирующее продуцирование одного или нескольких цитокинов Th1-типа, таких как IL-2, IL-12, TNF-α и IFN-γ, и/или продуцирование одного или нескольких антител Th1-типа.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает введение субъекту антигена и иммуностимулирующей композиции по данному изобретению в эффективном количестве для индукции иммунного ответа на данный антиген. Следует отметить, что антиген может быть введен до, после или одновременно с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению. Кроме того, антиген и иммуностимулирующее соединение можно вводить субъекту несколько раз.

Другим объектом настоящего изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта. Способ по данному объекту изобретения включает выделение дендритных клеток у субъекта, контактирование полученных дендритных клеток ex vivo с иммуностимулирующей композицией по данному изобретению, контактирование дендритных клеток ex vivo с антигеном и введение подвергнутых контакту дендритных клеток указанному субъекту.

Термин "антиген" означает молекулу, способную вызывать иммунный ответ. В широком определении термин "антиген" относится к молекуле любого типа, которая распознается системой хозяина как чужеродная. Антигены включают, не ограничиваясь ими, микробные антигены, раковые антигены и аллергены. Антигены включают, не ограничиваясь ими, клетки, клеточные экстракты, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, полисахаридные конъюгаты, пептидные и непептидные вещества, имитирующие полисахариды и другие молекулы, мелкие молекулы, липиды, гликолипиды и углеводы. Многие антигены имеют белковое или полипептидное происхождение, так как белки и полипептиды обычно обладают более высокими антигенными свойствами, чем углеводы или жиры.

Антиген может быть антигеном, кодированным или не кодированным вектором на основе нуклеиновой кислоты. В первом случае субъекту вводят вектор на основе нуклеиновой кислоты, и антиген экспрессируется in vivo. Во втором случае антиген может быть введен непосредственно субъекту. Антиген, не кодированный в векторе на основе нуклеиновой кислоты, представляет собой антиген любого типа, не являющийся нуклеиновой кислотой. Например, в соответствии с некоторыми объектами изобретения антиген, не кодированный в векторе на основе нуклеиновой кислоты, является пептидом или полипептидом. Незначительные модификации первичных аминокислотных последовательностей пептидных или полипептидных антигенов могут также вызвать образование полипептида, обладающего по существу такой же антигенной активностью, что и немодифицированный полипептид. Такие модификации могут быть намеренными, такими как сайтнаправленный мутагенез, или спонтанными. Все полипептиды, полученные в результате таких модификаций, входят в объем настоящего изобретения, если они сохраняют антигенные свойства. Указанный пептид или полипептид может быть, например, выделен из вируса. Антигены, пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть любой длины от небольших пептидных фрагментов непроцессированного белка или полипептида до полностью непроцессированной формы. Например, антиген может иметь цепь, включающую менее 5, менее 8, менее 10, менее 15, менее 20, менее 30, менее 50, менее 70, менее 100 или больше аминокислотных остатков, при условии, что данный антиген стимулирует специфический иммунный ответ.

Нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, функционально связана с экспрессирующей ген последовательностью, которая направляет экспрессию нуклеиновой кислоты антигена в эукариотической клетке. Экспрессирующая ген последовательность является любой регуляторной нуклеотидной последовательностью, такой как промоторная последовательность или комбинация промотора-энхансера, которая облегчает эффективную транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты антигена, с которой она функционально связана. Экспрессирующая ген последовательность может быть, например, промотором млекопитающего или вируса, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, не ограничиваясь ими, промоторы для следующих генов: промоторы гена гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозин-деаминазы, пируват-киназы, β-актина и другие конститутивные промоторы. Типичные вирусные промоторы, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяны (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, длинных концевых повторов (LTR) вируса лейкоза Молони и других ретровирусов, и промотор на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса. Специалистам в данной области известны другие конститутивные промоторы. Промоторы, пригодные для использования в качестве экспрессирующих ген последовательностей по данному изобретению, включают также индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, индукция промотора гена металлотионеина для стимуляции транскрипции и трансляции происходит в присутствии ионов определенных металлов. Специалистам в данной области известны другие индуцибельные промоторы.

Как правило, экспрессирующая ген последовательность должна при необходимости включать 5'-концевую нетранскрибирующую и 5'-концевую нетранслирующую последовательности, участвующие в инициации соответственно транскрипции и трансляции, такие как блок ТАТА, кэппирующая последовательность, последовательность СААТ и тому подобные. В частности, такие 5'-концевые нетранскрибирующие последовательности должны включать промоторную область, которая содержит промоторную последовательность, предназначенную для контроля транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты антигена. Экспрессирующие ген последовательности необязательно включают энхансерные последовательности или находящиеся слева активаторные последовательности.

Нуклеиновая кислота антигена функционально связана с экспрессирующей ген последовательностью. В используемом здесь значении последовательность нуклеиновой кислоты антигена и экспрессирующая ген последовательность считаются функционально связанными тогда, когда они ковалентно связаны с возможностью осуществления экспрессии или транскрипции и/или трансляции кодирующей последовательности антигена под управлением или контролем экспрессирующей ген последовательности. Считается, что две последовательности ДНК функционально связаны, если индукция промотора в 5'-концевой экспрессирующей ген последовательности вызывает транскрипцию последовательности антигена и если характер связи между двумя последовательностями ДНК (1) не вызывает интродукции мутации со сдвигом рамки, (2) не препятствует способности промоторной области направлять транскрипцию последовательности антигена или (3) не препятствует способности соответствующего транскрипта РНК транслироваться в белок. Таким образом, экспрессирующая ген последовательность функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты антигена, если экспрессирующая ген последовательность способна осуществлять транскрипцию указанной последовательности нуклеиновой кислоты антигена, в результате которой полученный транскрипт транслируется с образованием требуемого белка или полипептида.

Нуклеиновая кислота антигена по данному изобретению может быть доставлена в иммунную систему отдельно или в комбинации с вектором. В наиболее широком смысле вектор является любым носителем, способным облегчить перенос нуклеиновой кислоты антигена в клетки иммунной системы, в результате чего антиген может быть экспрессирован или представлен на поверхности иммунной клетки. Указанный вектор обычно переносит нуклеиновую кислоту в иммунные клетки с меньшей степенью разрушения по сравнению с разрушением, имеющим место при отсутствии вектора. Данный вектор необязательно содержит вышеописанную экспрессирующую ген последовательность, которая усиливает экспрессию нуклеиновой кислоты антигена в иммунных клетках. Векторы, применяемые в данном изобретении, включают, не ограничиваясь ими, плазмиды, фагомиды, вирусы, другие носители, выделенные из вирусов или бактерий, в которые были вставлены или введены последовательности нуклеиновых кислот антигена. Вирусные векторы являются предпочтительными векторами и включают, не ограничиваясь ими, последовательности нуклеиновой кислоты, выделенные из нижеследующих вирусов: ретровируса, такого как вирус мышиного лейкоза Молони, вирус мышиной саркомы Харвея, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовируса, аденоассоциированного вируса, вирусов типа SV40, вирусов полиомы, вирусов Эпштейна-Барра, вирусов папилломы, вируса герпеса, вируса коровьей оспы, полиовируса и РНК-содержащего вируса, такого как ретровирус. Специалист может легко использовать другие векторы, не указанные в описании изобретения, но известные в данной области.

Предпочтительные вирусные векторы получают на основе нецитопатических эукариотических вирусов, в которых заменимые гены заменены представляющим интерес геном. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых предполагает обратную транскрипцию геномной РНК вируса в ДНК с последующей интеграцией провируса в ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы одобрены для применения в испытаниях лекарственных средств для генотерапии человека. Наиболее пригодными являются ретровирусы с отсутствием репликации (то есть способные направлять синтез требуемых белков, но не способные создавать инфекционную частицу). Экспрессирующие векторы на основе таких генетически измененных ретровирусов используют для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные методы получения ретровирусов с отсутствием репликации (включая стадии введения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекции пакующей клетки, содержащей плазмиду, продуцирования рекомбинантных ретровирусов линией пакующих клеток, сбора вирусных частиц из среды с культурой ткани и инфицирования клеток-мишеней вирусными частицами) описаны в научных публикациях Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990), and Murray, E.J. Methods in Molecular Biology, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).

Предпочтительным вирусом для некоторых применений является аденоассоциированный вирус, а именно вирус, содержащий двухцепочечную ДНК. Можно создать аденоассоциированный вирус с отсутствием репликации, способный инфицировать различные типы клеток и видов. Другим преимуществом указанного вируса является его теплостойкость и устойчивость к липидному растворителю, высокая частота трансдукции в клетках разных линий, включая гемопоэтические клетки, и отсутствие подавления суперинфекции, что позволяет произвести несколько серий трансдукций. Аденоассоциированный вирус дикого типа проявляет некоторое предпочтение к сайтам интеграции в ДНК клеток человека, сводя к минимуму возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность экспрессии введенного гена, характерную для ретровирусной инфекции. Кроме того, инфекции, вызываемые аденоассоциированным вирусом дикого типа, сохраняются в культуре ткани на протяжении более чем 100 пассажей при отсутствии давления отбора, свидетельствуя о том, что интеграция генома аденоассоциированного вируса является относительно устойчивой. Аденоассоциированный вирус может также функционировать вне хромосомы. У рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, не имеющих белка репликазы, по-видимому, отсутствует подобная интеграционная специфичность последовательности.

Другими векторами являются плазмидные векторы. Плазмидные векторы всесторонне описаны в данной области и хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было установлено, что плазмидные векторы особенно пригодны для доставки генов в клетки in vivo благодаря их неспособности реплицироваться и встраиваться в геном хозяина. Однако указанные плазмиды, содержащие промотор, совместимый с клеткой-хозяином, могут экспрессировать пептид из гена, функционально кодированного в данной плазмиде. Некоторые обычно используемые плазмиды включают pBR322, pUC18, pUC19, pRc/CMV, SV40 и pBlueScript. Специалистам в данной области хорошо известны другие подобные плазмиды. Кроме того, такие плазмиды могут быть созданы с использованием рестрикционных ферментов и реакций лигирования для удаления и добавления специфических фрагментов ДНК.

Недавно было установлено, что несущие ген плазмиды можно доставить в иммунную систему с помощью бактерий. Модифицированные формы бактерий, таких как Salmonella, могут быть трансфицированы указанной плазмидой и использованы в качестве доставляющих носителей. Бактериальные доставляющие носители можно вводить хозяину перорально или другими способами введения. Бактерии доставляют плазмиду в иммунные клетки, например В-клетки, дендритные клетки, преодолевая, по-видимому, кишечный барьер. При помощи данного метода достигаются высокие уровни иммунной защиты. Такие методы доставки применимы при осуществлении настоящего изобретения, обеспечивая системную доставку антигена, нуклеиновых кислот и/или других лечебных средств.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения нуклеиновые кислоты вводят вместе с лечебными средствами, в частности с лекарственными средствами, предназначенными для лечения конкретного заболевания. В используемом здесь значении специфическое для заболевания лекарственное средство является средством, применяемым главным образом для лечения или профилактики данного заболевания.

В соответствии с одним объектом изобретения комбинация нуклеиновой кислоты и специфических для заболевания лекарственных средств позволяет вводить более высокие дозы специфических для болезни лекарственных средств без возникновения многих побочных эффектов, которые обычно возникают при введении высоких доз. В соответствии с другим объектом изобретения комбинация нуклеиновой кислоты и специфических для заболевания лекарственных средств позволяет вводить более низкие субтерапевтические дозы любого соединения с достижением более высокой эффективности по сравнению с эффективностью, характерной для применения таких низких доз. В качестве одного примера следует отметить, что при введении комбинации иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты и лекарственного средства можно вызвать эффективный ответ даже при введении указанного лекарственного средства в дозе, которая при раздельном введении не вызывает терапевтического действия (то есть в субтерапевтической дозе). В качестве другого примера можно отметить, что при совместном введении ответ достигается даже тогда, когда нуклеиновую кислоту вводят в дозе, которая сама по себе не вызывает терапевтического действия.

Нуклеиновые кислоты и/или другие лечебные средства можно также вводить в соответствии с фиксированной схемой применения или в разное время относительно друг друга. Разные комбинации имеют много преимуществ по сравнению с ранее известными методами модуляции иммунного ответа, профилактики или лечения заболеваний, в частности, связанных с пониженной неспецифической токсичностью в нормальных тканях.

Рак является заболеванием, при котором происходит неконтролируемый рост (то есть деление) клеток. Некоторые известные механизмы, способствующие неконтролируемой пролиферации раковых клеток, включают независимость фактора роста, неспособность обнаружить мутации в геноме и неправильную передачу сигнала в клетке. Способность раковых клеток игнорировать факторы, контролирующие нормальный рост, может привести к увеличению скорости пролиферации. Хотя причины возникновения рака до конца неизвестны, существуют некоторые факторы, которые, как известно, способствуют или, по крайней мере, вызывают предрасположенность субъекта к заболеванию раком. Такие факторы включают определенные генетические мутации (например, мутация гена BRCA для рака молочной железы, АРС для рака ободочной кишки), воздействие предполагаемых вызывающих рак средств или канцерогенов (таких как асбест, УФ-излучение) и семейную предрасположенность к возникновению определенных типов рака, таких как рак молочной железы.

Рак может быть злокачественным или незлокачественным заболеванием. Раковые заболевания или опухоли включают, не ограничиваясь ими, рак желчных путей, рак головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, хориокарциному, рак ободочной кишки, рак эндометрия, рак пищевода, рак желудка, интраэпителиальные опухоли, лимфомы, рак печени, рак легкого (например, мелкоклеточный рак и немелкоклеточный рак), меланому, нейробластомы, рак полости рта, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, саркомы, рак кожи, рак яичка, рак щитовидной железы и рак почки, а также другие карциномы и саркомы. В одном варианте осуществления изобретения рак включает лейкозный ретикулоэндотелиоз, хронический миелогенный лейкоз, кожный Т-клеточный лейкоз, множественную миелому, фолликулярную лимфому, злокачественную меланому, плоскоклеточный рак, почечноклеточный рак, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря или рак ободочной кишки.

"Субъект, страдающий раком" является субъектом, в организме которого обнаружены раковые клетки.

"Субъект с повышенным риском заболевания раком" является субъектом, для которого характерна более высокая вероятность возникновения рака по сравнению с обычной вероятностью. Такими субъектами являются, например, субъекты с генетическими нарушениями, которые, как установлено, связаны с более высокой вероятностью заболевания раком, субъекты с семейной предрасположенностью к раку, субъекты, испытывающие воздействие вызывающих рак средств (то есть канцерогенов), таких как табак, асбест или другие химические токсины, и субъекты, которые ранее проходили курс лечения от рака и находятся на стадии явной ремиссии.

Термин "раковый антиген" в используемом здесь значении означает соединение, такое как пептид или белок, связанное с поверхностью опухолевой или раковой клетки и способное вызывать иммунный ответ, будучи экспрессированным на поверхности антигенпредставляющей клетки в контексте молекулы МНС. Раковые антигены можно выделить из раковых клеток в виде неочищенных экстрактов раковых клеток, как это описано, например, в научной публикации Cohen P.A. et al. (1994) Cancer Res. 54:1055-8, путем частичной очистки антигенов, методами рекомбинантных ДНК или синтезом известных антигенов de novo. Раковые антигены включают, не ограничиваясь ими, рекомбинантно экспрессированные антигены, их иммуногенную часть, всю опухоль или раковую опухоль. Такие антигены можно выделить или получить методом рекомбинантных ДНК либо любым другим способом, известным в данной области.

Термины "раковый антиген" и "опухолевый антиген" имеют взаимозаменяемое значение и означают антигены, которые дифференциально экспрессированы в раковых клетках и поэтому могут быть использованы для направленного воздействия на раковые клетки. Раковые антигены являются антигенами, которые потенциально могут стимулировать опухолеспецифические иммунные ответы. Некоторые указанные антигены кодируются, хотя и необязательно экспрессируются, нормальными клетками. Указанные антигены могут быть определены как нормально молчащие (то есть не экспрессирующиеся) в нормальных клетках, как антигены, экспрессирующиеся только на определенных стадиях дифференцировки, и как временно экспрессирующиеся антигены, такие как эмбриональные и плодные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активируемые онкогеном ras), супрессорные гены (например, мутант р53), слитые белки, образующиеся в результате внутреннего удаления или хромосомных транслокаций. Другие раковые антигены могут кодироваться вирусными генами, присутствующими в онкогенных вирусах, содержащих РНК и ДНК. Примеры опухолевых антигенов включают MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, дипептидилпептидазу IV (DPPIV), белок, связывающий аденозин-деаминазу (ADAbp), циклофилин b, антиген, ассоциированный с прямой и ободочной кишкой (CRC)--C017-1A/GA733, карциноэмбриональный антиген (СЕА) и его иммуногенные эпитопы САР-1 и САР-2, etv6, amll, простатоспецифический антиген (PSA) и его иммуногенные эпитопы PSA-1, PSA-2 и PSA-3, простатоспецифический мембранный антиген (PSMA), цепь Т-клеточный рецептор/CD3-зета, семейство MAGE опухолевых антигенов (например, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Хр2 (MAGE-В2), MAGE-Хр3 (MAGE-В3), MAGE-Хр4 (MAGE-В4), MAGE-С1, MAGE-С2, MAGE-С3, MAGE-С4, MAGE-С5), семейство GAGE опухолевых антигенов (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназу, р53, семейство MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-фетопротеин, Е-кадгерин, α-катенин, β-катенин и γ-катенин, р120ctn, gp100^Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, белок аденоматозного полипоза coli (АРС), фодрин, коннексин 37, Ig-идиотип, р15, gp75, ганглиозиды GM2 и CD2, вирусные продукты, такие как белки вируса папилломы человека, семейство Smad опухолевых антигенов, lmp-1, P1A, EBV-кодированный ядерный антиген (EBNA)-1, гликоген-фосфорилазу головного мозга, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, СТ-7 и c-erbB-2.

Рак или опухоли и опухолевые антигены, ассоциированные с такими опухолями (и не только), включают такие заболевания, как острый лимфобластозный лейкоз (etv6, amll, циклофилин b), В-клеточная лимфома (Ig-идиотип), глиома (E-кадгерин, α-катенин, β-катенин, γ-катенин, р120ctn), рак мочевого пузыря (p21ras), рак желчных путей (p21ras), рак молочной железы (семейство MUC, HER2/neu, c-erbB-2), рак шейки матки (р53, p21ras), рак ободочной кишки (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, семейство MUC), рак ободочной и прямой кишки (антиген, ассоциированный с раком ободочной и прямой кишки (CRC)--C017-1A/GA733, APC), хориокарцинома (СЕА), эпителиально-клеточный рак (циклофилин b), рак желудка (HER2/neu, c-erbB-2, гликопротеин ga733), печеночно-клеточный рак (α-фетопротеин), лимфома Ходжкина (lmp-1, EBNA-1), рак легкого (СЕА, MAGE-3, NY-ESO-1), лимфоидный лейкоз (циклофилин b), меланома (белок р15, gp75, онкофетальный антиген, ганглиозиды GM2 и GD2), миелома (семейство MUC, p21ras), немелкоклеточный рак легкого (HER2/neu, c-erbB-2), носоглоточный рак (lmp-1, EBNA-1), рак яичника (семейство MUC, HER2/neu, c-erbB-2), рак предстательной железы (простатоспецифический антиген (PSA) и его иммуногенные эпитопы PSA-1, PSA-2 и PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2), рак поджелудочной железы (p21ras, семейство MUC, HER2/neu, c-erbB-2, гликопротеин ga733), рак почки (HER2/neu, c-erbB-2), плоскоклеточный рак шейки матки и пищевода (вирусные продукты, такие как белки вируса папилломы человека), рак яичка (NY-ESO-1), Т-клеточный лейкоз (эпитопы HTLVHTLV-1) и меланома (Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100^Pmel117).

Примеры опухолевых антигенов, связывающихся с молекулами МНС класса I и МНС класса II или молекулами обоих классов, приведены в нижеследующих ссылках: Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995; Traversari et al. J Exp Med 176:1453-1457, 1992; Chaux et al. J Immunol 163:2928-2936, 1999; Fujie et al. Int J Cancer 80:169-172, 1999; Tanzarella et al. Cancer Res 59:2668-2674, 1999; van der Bruggen et al. Eur J Immunol 24:2134-2140, 1994; Chaux et al. J Exp Med 189:767-778, 1999; Kawashima et al. Hum Immunol 59:1-14, 1998; Tahara et al. Clin Cancer Res 5:2236-2241, 1999; Gaugler et al. J Exp Med 179:921-930, 1994; van der Bruggen et al. Eur J Immunol 24:3038-3043, 1994; Tanaka et al. Cancer Res 57:4465-4468, 1997; Oiso et al. Int J Cancer 81:387-394, 1999; Herman et al. Immunogenetics 43:377-383, 1996; Manici et al. J Exp Med 189:871-876, 1999; Duffour et al. Eur J Immunol 29:3329-3337, 1999; Zorn et al. Eur J Immunol 29:602-607, 1999; Huang et al. J Immunol 162:6849-6854, 1999; Boël et al. Immunity 2:167-175, 1995; Van den Eynde et al. J Exp Med 182:689-698, 1995; De Backer et al. Cancer Res 59:3157-3165, 1999; Jäger et al. J Exp Med 187:265-270, 1998; Wang et al. J Immunol 161:3596-3606, 1998; Aarnoudse et al. Int J Cancer 82:442-448, 1999; Guilloux et al. J Exp Med 183:1173-1183, 1996; Lupetti et al. J Exp Med 188:1005-1016, 1998; Wölfel et al. Eur J Immunol 24:759-764, 1994; Skipper et al. J Exp Med 183:527-534, 1996; Kang et al. J Immunol 155:1343-1348, 1995; Morel et al. Int J Cancer 83:755-759, 1999; Brichard et al. Eur J Immunol 26:224-230, 1996; Kittlesen et al. J Immunol 160:2099-2106, 1998; Kawakami et al. J Immunol 161:6985-6992, 1998; Topalian et al. J Exp Med 183:1965-1971, 1996; Kobayashi et al. Cancer Research 58:296-301, 1998; Kawakami et al. J Immunol 154:3961-3968, 1995; Tsai et al. J Immunol 158:1796-1802, 1997; Cox et al. Science 264:716-719, 1994; Kawakami et al. Proc Natl Acad Sci USA 91:6458-6462, 1994; Skipper et al. J Immunol 157:5027-5033, 1996; Robbins et al. J Immunol 159:303-308, 1997; Castelli et al. J Immunol 162:1739-1748, 1999; Kawakami et al. J Exp Med 180:347-352, 1994; Castelli et al. J Exp Med 181:363-368, 1995; Schneider et al. Int J Cancer 75:451-458, 1998; Wang et al. J Exp Med 183:1131-1140, 1996; Wang et al. J Exp Med 184:2207-2216, 1996; Parkhurst et al. Cancer Research 58:4895-4901, 1998; Tsang et al. J Natl Cancer Inst 87:982-990, 1995; Correale et al. J Natl Cancer Inst 89:293-300, 1997; Coulie et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:7976-7980, 1995; Wölfel et al. Science 269:1281-1284, 1995; Robbins et al. J Exp Med 183:1185-1192, 1996; Brändle et al. J Exp Med 183:2501-2508, 1996; ten Bosch et al. Blood 88:3522-3527, 1996; Mandruzzato et al. J Exp Med 186:785-793, 1997; Guéguen et al. J Immunol 160:6188-6194, 1998; Gjertsen et al. Int J Cancer 72:784-790, 1997; Gaudin et al. J Immunol 162:1730-1738, 1999; Chiari et al. Cancer Res 59:5785-5792, 1999; Hogan et al. Cancer Res 58:5144-5150, 1998; Pieper et al. J Exp Med 189:757-765, 1999; Wang et al. Science 284:1351-1354, 1999; Fisk et al. J Exp Med 181:2109-2117, 1995; Brossart et al. Cancer Res 58:732-736, 1998; Röpke et al. Proc Natl Acad Sci USA 93:14704-14707, 1996; Iceda et al. Immunity 6:199-208, 1997; Ronsin et al. J Immunol 163:483-490, 1999; Vonderheide et al. Immunity 10:673-679, 1999. Указанные и другие антигены описаны в заявке на патент PCT/US98/18601.

Композиции и способы по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами и методами, применяемыми для лечения рака. В настоящее время при лечении рака применяют разные методы, в том числе хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию. Выбор метода лечения зависит от типа, расположения и распространения рака. Например, хирургическая операция и лучевая терапия могут быть более пригодны в случае солидной, хорошо выявленной массы опухоли, и менее пригодны в случае рака, отличающегося отсутствием солидной опухоли, такого как лейкоз и лимфома. Одним из преимуществ хирургической операции и лучевой терапии является возможность в некоторой степени контролировать воздействие лечения и, таким образом, ограничивать токсичность указанных методов для нормальных тканей в организме. Однако после хирургической операции и лучевой терапии часто проводят химиотерапию для уничтожения любых оставшихся или устойчивых к облучению раковых клеток. Химиотерапия также является наиболее приемлемым методом лечения диссеминированных типов рака, таких как лейкоз и лимфома, а также метастазов.

Химиотерапия представляет собой метод лечения с использованием химических и/или биологических средств, воздействующих на раковые клетки. В отличие от местной хирургической операции или облучения химиотерапия обычно является системным методом лечения, поэтому токсичность для нормальных тканей вызывает наибольшее беспокойство. Так как многие химиотерапевтические средства направленно воздействуют на раковые клетки с учетом пролиферативных профилей, такие ткани как желудочно-кишечный тракт и костный мозг, которые обычно являются пролиферативными, также подвергаются воздействию химиотерапии. Одним из главных побочных эффектов химиотерапии является миелосупрессия (включая анемию, нейтропению и тромбоцитопению), которая возникает в результате гибели нормальных клеток-предшественников гемопоэтических клеток.

Для лечения рака созданы многие химиотерапевтические средства. Однако не все опухоли реагируют на химиотерапевтические средства, причем у некоторых опухолей, первоначально реагирующих на воздействие химиотерапевтических средств, затем может возникнуть устойчивость. Таким образом, поиск эффективных противораковых средств направлен прежде всего на получение более эффективных лекарственных средств, обладающих гораздо меньшей неспецифической токсичностью.

Лекарственные средства против рака действуют разными способами. Некоторые противораковые средства направленно воздействуют на физиологические механизмы, присущие опухолевым клеткам. Такие примеры включают направленное воздействие на специфические гены и их генные продукты (то есть прежде всего белки), которые мутировали в раковых опухолях. Такие гены включают, не ограничиваясь ими, онкогены (например, Ras, Her2, bcl-2), гены-супрессоры опухоли (например, EGF, p53, Rb) и мишени, определяющие клеточный цикл (например, CDK4, p21, теломераза). Противораковые средства альтернативно могут направленно воздействовать на пути трансдукции сигнала и молекулярные механизмы, которые изменены в раковых клетках. Направленное воздействие на раковые клетки через эпитопы, экспрессированные на поверхности клеток, осуществляют при помощи моноклональных антител. Последний метод лечения рака обычно определяется как иммунотерапия.

Другие противораковые средства направленно воздействуют на клетки, не являющиеся раковыми клетками. Например, некоторые лекарственные средства побуждают иммунную систему разрушать раковые клетки (например, противораковые вакцины). Другие лекарственные средства, именуемые ингибиторами ангиогенеза, воздействуют на приток крови к солидным опухолям. Так как большинство злокачественных опухолей могут образовывать метастазы (то есть из области локализации первичной опухоли распространяются в другую область, образуя таким образом вторичную опухоль), важное значение имеют лекарственные средства, препятствующие образованию метастазов. Медиаторы ангиогенеза включают FGF, VEGF, ангиопоэтины, ангиостатин, эндостатин, TNF-α, TNP-470, тромбоспондин-1, тромбоцитарный фактор 4, CAI и некоторые члены семейства интегринов белков. К одной категории лекарственных средств подобного типа относится ингибитор металлопротеиназы, который подавляет ферменты, используемые раковыми клетками для распространения первичной опухоли в другие ткани.

Некоторые раковые клетки являются антигенными и, таким образом, могут быть мишенями для направленного воздействия иммунной системы. В соответствии с одним объектом изобретения комплексное воздействие нуклеиновой кислоты и противораковых средств, в частности, классифицируемых как иммунотерапевтические противораковые средства, позволяет стимулировать специфический иммунный ответ против ракового антигена.

Теория иммунного надзора состоит в том, что главной функцией иммунной системы является обнаружение и устранение опухолевых клеток до образования опухоли. Основным принципом указанной теории является то, что раковые клетки отличаются в антигенном отношении от нормальных клеток и поэтому вызывают иммунные ответы, которые аналогичны ответам, вызывающим отторжение иммунологически несовместимых аллотрансплантатов. Выполненные исследования подтвердили, что экспрессия антигенов опухолевыми клетками отличается в качественном или количественном отношении. Например, "опухолеспецифические антигены" являются антигенами, которые специфически взаимосвязаны с опухолевыми клетками, а не с нормальными клетками. Примерами опухолеспецифических антигенов являются вирусные антигены в опухолях, индуцированных вирусами, содержащими ДНК или РНК. "Опухолеспецифические" антигены присутствуют как в опухолевых клетках, так и нормальных клетках, но в опухолевых клетках они находятся в другом количестве или другой форме. Примерами таких антигенов являются онкофетальные антигены (например, карциноэмбриональный антиген), дифференцировочные антигены (например, Т- и Tn-антигены) и онкогенные продукты (например, HER/neu).

Идентифицированы разные типы клеток, способных уничтожать раковые клетки-мишени in vitro и in vivo: естественные клетки-киллеры (NK), цитолитические Т-лимфоциты (CTL), лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK) и активированные макрофаги. NK-клетки могут уничтожать опухолевые клетки без предварительной сенсибилизации к специфическим антигенам, и их активность не требует присутствия антигенов класса I, кодируемых главным комплексом гистосовместимости (МНС) на клетках-мишенях. Считается, что NK-клетки контролируют образование опухолей и рост метастазов. В отличие от NK-клеток CTL могут уничтожать опухолевые клетки только после сенсибилизации к опухолевым антигенам и при экспрессии антигена-мишени на опухолевых клетках, которые также экспрессируют МНС класса I. Считается, что CTL являются эффекторными клетками при отторжении трансплантированных опухолей и опухолей, вызываемых ДНК-содержащими вирусами. Клетки LAK образуют субпопуляцию нулевых лимфоцитов, отличающихся от популяций NK-клеток и CTL. Активированные макрофаги могут уничтожать опухолевые клетки после активации независимо от антигена и без ограничений, связанных с МНС. Считается, что активированные макрофаги замедляют скорость роста опухолей, в которые они проникают. Анализы in vitro позволили выявить другие иммунные механизмы, в частности, антитело-зависимые, опосредуемые клетками цитотоксические реакции и лизис, вызываемый антителом с комплементом. Однако считается, что указанные эффекторные механизмы иммунной системы имеют менее важное значение in vivo по сравнению с функцией NK, CTL, LAK и макрофагов in vivo (см. научную публикацию Piessens W.F. et al. "Tumor Immunology", In: Scientific American Medicine, Vol. 2, Scientific American Books, N.Y., сс. 1-13, 1996).

Целью иммунотерапии является усиление иммунного ответа субъекта на возникшую опухоль. Один метод, применяемый в иммунотерапии, включает использование адъювантов. Адъюванты, выделенные из микроорганизмов, таких как бацилла Calmette-Guérin, усиливают иммунный ответ и повышают сопротивляемость к образованию опухолей у животных.

Иммунотерапевтические средства являются лекарственными препаратами, выделяемыми из антител или фрагментов антител, которые специфически связывают или узнают раковый антиген. Иммунотерапевтические средства на основе антител связываются с поверхностью раковой клетки и таким образом стимулируют воздействие эндогенной иммунной системы на раковую клетку. Лекарственные средства на основе антител применяют также в качестве системы доставки токсических веществ в раковые клетки. Антитела обычно конъюгируют с токсинами, такими как рицин (например, выделенный из обыкновенной клещевины), калихеамицин и майтанзиноиды, радиоактивными изотопами, такими как йод-131 и иттрий-90, химиотерапевтическими средствами (приведенными в данном описании изобретения) или биологическими модификаторами иммунного ответа. Таким образом, можно сконцентрировать токсические вещества в области раковой опухоли и минимизировать неспецифическую токсичность для нормальных клеток. Помимо антител, специфичных для раковых антигенов, при осуществлении данного изобретения можно использовать антитела, которые связываются с сосудистой сетью аналогично антителам, связывающимся с эндотелиальными клетками. Это происходит потому, что выживание солидных опухолей зависит от образования новых кровеносных сосудов, поэтому большинство опухолей способно стимулировать рост новых кровеносных сосудов. Таким образом, многие противораковые средства воздействуют на кровеносные сосуды, питающие опухоль и/или соединительные ткани (или строму), поддерживающие такие кровеносные сосуды.

Противораковые вакцины являются лекарственными средствами, действие которых направлено на стимуляцию эндогенного иммунного ответа против раковых клеток. Существующие в настоящее время вакцины активируют преимущественно гуморальную иммунную систему (то есть вызывают антитело-зависимый иммунный ответ). Другие вакцины, которые в настоящее время находятся на стадии разработки, активируют опосредуемую клетками иммунную систему, включая цитотоксические Т-лимфоциты, способные уничтожать опухолевые клетки. Противораковые вакцины обычно усиливают презентацию раковых антигенов антиген-представляющим клеткам (например, макрофагам и дендритным клеткам) и/или другим иммунным клеткам, таким как Т-клетки, В-клетки и NK-клетки.

Хотя противораковые вакцины могут иметь любую из рассмотренных выше форм, их целью является доставка раковых антигенов и/или опухолеспецифических антигенов к антиген-представляющим клеткам (АРС) для облегчения эндогенной обработки таких антигенов клетками АРС и конечной презентации антигена на поверхности клетки в контексте молекул МНС класса I. Одной формой противораковой вакцины является цельноклеточная вакцина, которая представляет собой препарат раковых клеток, выделенных из организма субъекта, обработанных ex vivo и затем вновь введенных субъекту в виде цельных клеток. Лизаты опухолевых клеток можно также использовать в качестве противораковых вакцин для возбуждения иммунного ответа. Другой формой противораковой вакцины является пептидная вакцина, в которой для активации Т-клеток использованы опухолеспецифические или опухолеассоциированные мелкие белки. Опухолеассоциированными белками являются белки, которые экспрессируются не только раковыми клетками (то есть другие нормальные клетки могут также экспрессировать указанные антигены). Однако экспрессия опухолеассоциированных антигенов обычно увеличивается в опухолях определенного типа. Другие противоопухолевые вакцины включают ганглиозидные вакцины, вакцины на основе белков теплового шока, вирусные и бактериальные вакцины и вакцины на основе нуклеиновой кислоты.

Еще одной формой противораковой вакцины является вакцина на основе дендритных клеток, которая содержит цельные дендритные клетки, подвергнутые воздействию ракового антигена или опухолеассоциированного антигена in vitro. Лизаты или мембранные фракции дендритных клеток можно также использовать в качестве противораковых вакцин. Вакцины на основе дендритных клеток способны прямо активировать АРС. Дендритная клетка является профессиональной клеткой АРС. Дендритные клетки устанавливают связь между врожденной и приобретенной иммунной системой путем представления антигенов и экспрессии указанными клетками распознающих рецепторов, которые обнаруживают микробные молекулы, такие как LPS, в локальном окружении. Дендритные клетки эффективно интернализируют, обрабатывают и представляют воздействующий на них растворимый специфический антиген. Процесс интернализации и представления антигена вызывает быстрое усиление экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) и костимулирующих молекул, продуцирование цитокинов и миграцию в направлении лимфатических органов, где они участвуют в активации Т-клеток.

Химиотерапевтические средства включают все другие формы противораковых средств, которые не входят в категории иммунотерапевтических средств или противораковых вакцин. Химиотерапевтические средства включают как химические, так и биологические средства. Указанные средства подавляют клеточную активность, которая необходима раковой клетке для дальнейшего выживания. Такие категории химиотерапевтических средств включают алкилирующие/алкалоидные средства, антиметаболиты, гормоны или аналоги гормонов и разнообразные противоопухолевые средства. Большинство, если не все указанные средства, являются токсичными для раковых клеток и не требуют стимуляции иммунного ответа.

Термин "инфекционное заболевание" или эквивалентный ему термин "инфекция" в используемом здесь значении означает заболевание, возникающее в результате поверхностного, локального или системного проникновения в организм хозяина инфекционного микроорганизма. Инфекционные микроорганизмы включают бактерии, вирусы, грибы и паразиты. Таким образом термин "инфекционное заболевание" относится к бактериальным, вирусным, грибковым и паразитическим инфекциям.

Субъектом, страдающим инфекционным заболеванием, является субъект, который подвергся воздействию инфекционного микроорганизма, при этом в его организме обнаружено острое или хроническое присутствие указанного микроорганизма на детектируемом уровне. Инфекционный микроорганизм обычно воздействует на наружную поверхность тела субъекта, например кожу или слизистые оболочки, и/или проникает через наружную поверхность тела в организм субъекта.

Субъектом с повышенным риском возникновения инфекционного заболевания является субъект в большей степени подверженный воздействию патогенного микроорганизма, вызывающего инфекционное заболевание. Например, таким субъектом может быть субъект, планирующий поездку в район, где обнаружен инфекционный микроорганизм определенного типа, или субъект, который в связи с образом жизни или медицинскими процедурами подвергается воздействию жидкостей, содержащих инфекционные микроорганизмы, или испытывает непосредственное воздействие такого микроорганизма, либо субъект, проживающей в районе, где обнаружен инфекционный микроорганизм. Субъектами с повышенным риском возникновения инфекционного заболевания также является население, которому медицинское агентство рекомендует произвести вакцинацию против определенного инфекционного микроорганизма.

Субъектами с повышенным риском возникновения инфекционного заболевания являются субъекты, постоянно подверженные воздействию микроорганизма, например вируса гриппа, но не страдающие активной формой такого заболевания во время прохождения курса лечения по данному изобретению, а также субъекты, подверженные особому риску возникновения инфекционного заболевания из-за медицинских показаний или факторов окружающей среды, которые делают данного субъекта уязвимым для определенного микроорганизма.

Бактерии являются одноклеточными микроорганизмами, которые размножаются бесполым путем в результате деления надвое. Они классифицированы и получили названия на основании их морфологии, цветных реакций, требований, предъявляемых к питанию и обмену веществ, антигенной структуры, химического состава и генетической гомологии. Бактерии можно классифицировать в три группы с учетом их морфологических форм, а именно сферические (кокк), прямая палочка (бацилла) и изогнутая или спиральная палочка (вибрион, кампилобактер, спирилла и спирохета). Кроме того, бактерии обычно классифицируют на основании цветных реакций в два класса организмов: грамположительные и грамотрицательные. Термин "грам" означает метод окрашивания, который обычно применяют в микробиологических лабораториях. Грамположительные микроорганизмы сохраняют окраску после процедуры окрашивания и приобретают темно-фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы не сохраняют окраску, но приобретают противоположный цвет и, таким образом, становятся розовыми.

Инфекционные бактерии включают, не ограничиваясь ими, грамотрицательные и грамположительные бактерии. Грамположительные бактерии включают, не ограничиваясь ими, виды Pasteurella, Staphylococci и Streptococcus. Грамотрицательные бактерии включают, не ограничиваясь ими, Escherichia coli, виды Pseudomonas и Salmonella. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, не ограничиваясь ими, Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (например, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы А), Streptococcus agalactiae (Streptococcus группы В), Streptococcus (группа виридов), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробный вид), Streptococcus pneumoniae, патогенный вид Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli.

Вирусы являются мелкими инфекционными агентами, которые обычно состоят из ядра, содержащего нуклеиновую кислоту, и белковой оболочки, но необязательно являются живыми организмами. Вирусы могут также иметь форму инфекционных нуклеиновых кислот без белка. Вирус не может выжить при отсутствии живой клетки, в которой он может реплицироваться. Вирусы проникают в определенные живые клетки в результате эндоцитоза или прямой инъекции ДНК (фага) и размножаются, вызывая болезнь. Размножившийся вирус затем может высвобождаться из клетки и инфицировать другие клетки. Одни вирусы являются ДНК-содержащими вирусами и другие являются РНК-содержащими вирусами. Некоторые объекты данного изобретения относятся к лечению заболеваний, вызываемых прионами, таких как губковидная энцефалопатия крупного рогатого скота (то есть бешенство коров, BSE), бессистемная инфекция у животных и болезнь Крейтцфельда-Якоба у человека.

Вирусы включают, не ограничиваясь ими, энтеровирусы (включающие, не ограничиваясь ими, вирусы, относящиеся к семейству picornaviridae, такие как полиовирус, вирус Коксаки, эховирус), ротавирусы, аденовирусы, вирус гепатита. Конкретные примеры вирусов, обнаруженных у человека, включают, не ограничиваясь ими, Retroviridae (например, вирус иммунодефицита человека, такой как ВИЧ-1 (определяемый также как HTLV-III, LAV, HTLV-III/LAV или ВИЧ-III и другие изоляты, такие как ВИЧ-LP); Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита А, энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы энцефалита лошадей, вирусы краснухи); Flaviviridae (например, вирусы тропической лихорадки, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, вирусы эболы); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, вирусы Хантаана, вирусы бунга, флебовирусы и вирусы Найро); Arenaviridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита В); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV)); Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); Iridoviridae (например, вирус лихорадки африканских свиней) и неклассифицированные вирусы (например, этиологические агенты губковидной энцефалопатии, агент дельта-гепатита (который, как считают, является дефектным сателлитом вируса гепатита В), агенты гепатита, не относящегося к типам А и В (класс 1 = внутренне переносимый; класс 2 = парентерально переносимый (то есть гепатит С); вирусы Норвалка и родственные вирусы, а также астровирусы).

Грибы являются эукариотическими организмами, из которых лишь некоторые вызывают инфекционные заболевания у позвоночных млекопитающих. Так как грибы являются эукариотическими организмами, они значительно отличаются от прокариотических бактерий по размеру, структурной организации, жизненному циклу и механизму размножения. Грибы обычно классифицируют на основании морфологических признаков, способа репродукции и характеристик культуры. Хотя грибы могут вызывать у субъектов заболевания разных типов, в частности респираторные аллергические заболевания после вдыхания грибных антигенов и грибную интоксикацию в результате потребления токсических веществ, таких как токсин Amanita phalloides и фаллотоксин, продуцируемый ядовитыми грибами, и афлатоксины, продуцируемые видом aspergillus, не все грибы вызывают инфекционные заболевания.

Инфекционные грибы могут вызывать системные или поверхностные инфекции. Первичная системная инфекция может возникнуть у нормальных здоровых субъектов, и условно-патогенные инфекции чаще всего обнаруживают у субъектов с ослабленной иммунной системой. Наиболее распространенными грибными агентами, вызывающими первичную системную инфекцию, являются Blastomyces, Coccidioides и Htoplasma. Распространенные грибы, вызывающие условно-патогенную инфекцию у субъектов с ослабленной иммунной системой или иммуносупрессией, включают, не ограничиваясь ими, Candida albicans, Cryptococcus neoformans и разные виды Aspergillus. Системные грибковые инфекции являются инвазивными инфекциями внутренних органов. Такие микроорганизмы обычно проникают в организм через легкие, желудочно-кишечный тракт или внутривенные катетеры. Инфекции указанных типов могут быть вызваны первичными патогенными грибами или условно-патогенными грибами.

Поверхностные грибковые инфекции включают рост грибов на наружной поверхности без проникновения во внутренние ткани. Типичные поверхностные грибковые инфекции включают кожные грибковые инфекции, поражающие кожу, волосы или ногти.

Заболевания, связанные с грибковой инфекцией, включают аспергиллез, бластомикоз, кандидоз, хромобластомикоз, кокцидиоидомикоз, криптококкоз, грибковые инфекции глаза, грибковые инфекции, поражающие волосы, ногти и кожу, гистоплазмоз, лобомикоз, мицетому, отомикоз, паракокцидиоидомикоз, диссеминированный Penicillium marneffei, факогифомикоз, риноспоридиоз, споротрихоз и зигомикоз.

Паразиты являются организмами, выживание которых зависит от других организмов, поэтому они должны проникать или инфицировать другой организм для продолжения своего жизненного цикла. Инфицированный организм, то есть хозяин, предоставляет паразиту питание и место обитания. Хотя в широком смысле термин "паразит" может означать все инфекционные агенты (то есть бактерии, вирусы, грибы, простейшие и гельминты), указанный термин обычно используется только применительно к простейшим, гельминтам и членистоногим паразитам (таким как клещи и т.д.). Простейшие являются одноклеточными микроорганизмами, которые могут реплицироваться внутри клетки и вне клетки, в частности в крови, кишечном тракте или внеклеточном материале ткани. Гельминты являются многоклеточными организмами, которые почти всегда обитают вне клеток (за исключением Trichinella spp.). Для репликации гельминты обычно должны покинуть первичного хозяина и переселиться во вторичного хозяина. В отличие от вышеуказанных классов паразитов членистоногие паразиты паразитируют на наружной поверхности тела хозяина.

Паразиты включают внутриклеточных паразитов и облигатных внутриклеточных паразитов. Примеры паразитов включают, не ограничиваясь ими, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Babesia microti, Babesia divergens, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Leishmania major, Leishmania donovani, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense и Schistosoma mansoni.

В научной литературе всесторонне описаны другие болезнетворные микроорганизмы, см., например, научную публикацию C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве свылки. Все приведенные выше перечни являются иллюстративными и не ограничивают объема настоящего изобретения.

Композиции и способы по данному изобретению можно использовать отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами и методами, пригодными для лечения инфекционных заболеваний. Лекарственные средства, предназначенные для лечения инфекционных заболеваний, включают, не ограничиваясь ими, антибактериальные средства, антивирусные средства, противогрибковые средства и антипаразитические средства. Термины "антиинфекцинное средство", "антибиотик", "антибактериальное средство", "антивирусное средство", "противогрибковое средство", "антипаразитическое средство" и "паразитицид" имеют значения, хорошо известные специалистам в данной области, которые приведены в медицинской литературе. Антибактериальные средства уничтожают или ингибируют бактерии и включают антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, обладающие аналогичным действием. Антивирусные средства могут быть выделены из природных источников или синтезированы и применяются для уничтожения или ингибирования вирусов. Противогрибковые средства применяют для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также условно-патогенных и первичных системных грибковых инфекций. Антипаразитические средства уничтожают или ингибируют паразитов. Многие антибиотики являются низкомолекулярными молекулами, продуцируемыми в виде вторичных метаболитов клетками, такими как микроорганизмы. Антибиотики обычно противодействуют одной или нескольким функциям или структурам, которые являются специфическими для данного микроорганизма и отсутствуют в клетках-хозяевах.

Одной из проблем, связанных с антиинфекционной терапией, являются побочные эффекты, возникающие в организме хозяина при лечении антиинфекционным средством. Например, многие антиинфекционные средства могут уничтожать или ингибировать широкий спектр микроорганизмов и не являются специфическими для определенного вида. Лечение антиинфекционными средствами указанных типов приводит к уничтожению нормальной бактериальной флоры в организме хозяина наряду с инфекционным микроорганизмом. Утрата бактериальной флоры может вызывать осложения заболевания и способствовать инфицированию хозяина другими патогенами, так как бактериальная флора конкурирует с инфекционными патогенами и служит барьером для проникновения указанных патогенов. Другие побочные эффекты могут возникнуть в результате специфического или неспецифического действия указанных химических форм на небактериальные клетки или ткани хозяина.

Другой проблемой, связанной с широким применением антиинфекционных средств, является возникновение устойчивых к антибиотикам штаммов микроорганизмов. Уже появились штаммы, устойчивые к антибиотикам, такие как ванкомицин-устойчивый штамм enterococci, пенициллин-устойчивый штамм pneumococci, устойчивый к нескольким антибиотикам штамм S. aureus и устойчивый к нескольким антибиотикам штамм tuberculosis, которые становятся главной причиной клинических проблем. Широкое применение антиинфекционных средств, по-видимому, способствует появлению многих устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий. В связи с этим необходимы новые антиинфекционные средства для борьбы с указанными микроорганизмами.

Антибактериальные антибиотики, которые эффективно уничтожают или ингибируют целый ряд бактерий, являются антибиотиками широкого спектра действия. Другие типы антибактериальных антибиотиков в основном эффективно воздействуют на бактерии, относящиеся к классу грамположительных или грамотрицательных бактерий. Антибиотики указанных типов являются антибиотиками узкого спектра действия. Другие антибиотики, которые эффективно воздействуют на один микроорганизм или заболевание и не воздействуют на другие типы бактерий, являются антибиотиками ограниченного спектра действия.

Антибактериальные средства иногда классифицируют на основании основного способа действия. Как правило, антибактериальные средства являются ингибиторами синтеза оболочки клетки, ингибиторами клеточной мембраны, ингибиторами синтеза белка, ингибиторами синтеза нуклеиновой кислоты или функциональными ингибиторами и конкурентными ингибиторами. Ингибиторы синтеза оболочки клетки подавляют синтез оболочки клетки и, как правило, синтез бактериального пептидогликана. Ингибиторы синтеза оболочки клетки включают β-лактамные антибиотики, природные пенициллины, полусинтетические пенициллины, ампициллин, клавулановую кислоту, цефалоспорины и бацитрацин.

β-Лактамы являются антибиотиками, содержащими четырехчленное β-лактамное кольцо, которое ингибирует последнюю стадию синтеза пептидогликана. β-Лактамные антибиотики могут быть синтезированными или природными. β-Лактамные антибиотики, продуцированные видом penicillium, являются природными пенициллинами, такими как пенициллин G или пенициллин V. Указанные пенициллины образуются в результате ферментации Penicillium chrysogenum. Природные пенициллины обладают узким спектром действия и обычно являются эффективными против Streptococcus, Gonococcus и Staphylococcus. Другие типы природных пенициллинов, которые также эффективно воздействуют на грамположительные бактерии, включают пенициллины F, X, K и О.

Полусинтетические пенициллины обычно являются модификациями молекулы 6-аминопенициллиновой кислоты, продуцируемой плесневыми грибами. 6-Аминопенициллиновая кислота может быть модифицирована путем добавления боковых цепей, которые позволяют получить пенициллины более широкого спектра действия по сравнению с природными пенициллинами или обладающие другими преимущественными свойствами. Полусинтетические пенициллины некоторых типов обладают широким спектром действия против грамположительных и грамотрицательных бактерий, но инактивируются пенициллиназой. Указанные полусинтетические пенициллины включают ампициллин, карбенициллин, оксациллин, азлоциллин, мезлоциллин и пиперациллин. Полусинтетические пенициллины других типов характеризуются более узким спектром действия против грамположительных бактерий, но обладают свойствами, которые делают их устойчивыми к воздействию пенициллиназы. Указанные пенициллины включают, например, метициллин, диклоксациллин и нафциллин. Некоторые полусинтетические пенициллины широкого спектра действия можно использовать в комбинации с ингибиторами β-лактамазы, такие как клавулановые кислоты и сулбактам. Ингибиторы β-лактамазы не обладают антимикробным действием, но могут ингибировать пенициллиназу, защищая таким образом полусинтетический пенициллин от разрушения.

Одним из серьезных побочных эффектов, связанных с применением пенициллинов, как природных, так и полусинтетических, является аллергия на пенициллин. Аллергия на пенициллин имеет очень серьезное значение и может вызвать быструю смерть. У субъекта, испытывающего аллергию на пенициллин, молекула β-лактама связывается с сывороточным белком, который инициирует IgE-опосредованную воспалительную реакцию. Воспалительная реакция вызывает анафилаксию и возможную смерть.

β-Лактамными антибиотиками другого типа являются цефалоспорины. Указанные вещества чувствительны к разрушению бактериальными β-лактамазами и поэтому не всегда оказывают эффективное действие при отдельном применении. Однако цефалоспорины устойчивы к пенициллиназе. Они эффективно воздействуют на целый ряд грамположительных и грамотрицательных бактерий. Цефалоспорины включают, не ограничиваясь ими, цефалотин, цефапирин, цефалексин, цефамандол, цефаклор, цефазолин, цефуроксин, цефокситин, цефотаксим, цефсулодин, цефетамет, цефиксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидин и моксалактам.

Бацитрацин относится к другому классу антибиотиков, которые ингибируют синтез оболочки клетки, подавляя высвобождение муропептидных субъединиц или пептидогликана из молекулы, которая доставляет указанную субъединицу к наружной поверхности мембраны. Хотя бацитрацин эффективно воздействует на грамположительные бактерии, его применение ограничено местным введением из-за высокой токсичности.

Карбапенемы являются другим β-лактамным антибиотиком широкого спектра действия, который способен ингибировать синтез оболочки клетки. Примеры карбапенем включают, не ограничиваясь ими, имипенемы. Монобактамы также являются β-лактамными антибиотиками широкого спектра действия и включают эузтреонам. Антибиотик, продуцируемый Streptomyces, ванкомицин, также эффективно воздействует на грамположительные бактерии, ингибируя синтез клеточной мембраны.

Другой класс антибактериальных средств составляют антибактериальные средства, являющиеся ингибиторами клеточной мембраны. Указанные соединения дезорганизуют структуру или ингибируют функцию бактериальных мембран. Одна проблема, относящаяся к антибактериальным средствам, являющимся ингибиторами клеточной мембраны, состоит в том, что они могут производить в эукариотических клетках такое же действие, что и бактерии, из-за сходства фосфолипидов в бактериальных и эукариотических мембранах. Таким образом, указанные соединения редко являются достаточно специфическими, чтобы их можно было использовать системно, и не допускают применения высоких доз для местного введения.

Одним клинически полезным ингибитором клеточной мембраны является полимиксин. Полимиксин противодействует функции мембраны, связываясь с фосфолипидами мембраны. Полимиксин эффективен в основном против грамотрицательных бактерий, и его обычно применяют для лечения тяжелых инфекций, вызываемых Pseudomonas, или инфекций, вызываемых Pseudomonas, которые устойчивы к менее токсичным антибиотикам. Системное введение указанного соединения вызывает тяжелые побочные эффекты, в частности поражение почки и других органов.

Другие ингибиторы клеточной мембраны включают амфотерицин В и нистатин, которые являются противогрибковыми средствами, применяемыми главным образом для лечения системных грибковых инфекций и инфекций, вызываемых дрожжами Candida. Имидазолы относятся к другому классу антибиотиков, которые являются ингибиторами клеточной мембраны. Имидазолы используют в качестве антибактериальных средств, а также противогрибковых средств, применяемых, например, для лечения инфекций, вызываемых дрожжами и дерматофитами, и системных грибковых инфекций. Имидазолы включают, не ограничиваясь ими, клотримазол, миконазол, кетоконазол, итраконазол и флуконазол.

Многие антибактериальные средства являются ингибиторами синтеза белка. Указанные соединения препятствуют синтезу бактериями структурных белков и ферментов и, таким образом, ингибируют рост или функционирование бактериальных клеток или вызывают гибель клеток. Данные соединения, как правило, препятствуют процессам транскрипции или трансляции. Антибактериальные средства, которые блокируют транскрипцию, включают, не ограничиваясь ими, рифампины и этамбутол. Рифампины, которые ингибируют фермент РНК-полимеразу, обладают широким спектром действия и эффективно воздействуют на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также Mycobacterium tuberculosis. Этамбутол является эффективным средством против Mycobacterium tuberculosis.

Антибактериальные средства, которые блокируют трансляцию, препятствуют бактериальным рибосомам транслировать мРНК в белки. Как правило, соединения указанного класса включают, не ограничиваясь ими, тетрациклины, хлорамфеникол, макролиды (например, эритромицин) и аминогликозиды (например, стрептомицин).

Аминогликозиды относятся к классу антибиотиков, продуцируемых бактериями Streptomyces, таких как, например, стрептомицин, канамицин, тобрамицин, амикацин и гентамицин. Аминогликозиды применяют против целого ряда бактериальных инфекций, вызываемых грамположительными и грамотрицательными бактериями. Стрептомицин используют в качестве основного средства при лечении туберкулеза. Гентамицин применяют против многих штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая инфекции, вызываемые Pseudomonas, особенно в комбинации с тобрамицином. Канамицин применяют против многих грамположительных бактерий, включающих устойчивый к пенициллину штамм Staphylococci. Одним побочным эффектом аминогликозидов, который ограничивает их клиническое применение, является то, что при продолжительном приеме доз, необходимых для достижения эффективного результата, указанные средства нарушают функцию почки и вызывают поражение слуховых нервов, ведущее к глухоте.

Другим типом антибактериального средства, ингибирующего трансляцию, являются тетрациклины. Тетрациклины относятся к классу антибиотиков широкого спектра действия, которые эффективно воздействуют на целый ряд грамположительных и грамотрицательных бактерий. Примеры тетрациклинов включают тетрациклин, миноциклин, доксициклин и хлортетрациклин. Указанные средства имеют важное значение для лечения бактериальных инфекций многих типов, но особенно пригодны для лечения болезни Лима. Благодаря низкой токсичности и минимальным прямым побочным эффектам тетрациклины применяли в медицинской практике сверх меры и не по назначению, что привело к возникновению проблем. Например, избыточное применение указанных средств вызвало возникновение широко распространенной устойчивости.

Антибактериальные средства, такие как макролиды, обратимо связываются с рибосомной субъединицей 50 S и ингибируют удлинение белка пептидилтрансферазой или препятствуют высвобождению незаряженной тРНК из бактериальной рибосомы либо оказывают оба действия. Указанные соединения включают эритромицин, рокситромицин, кларитромицин, олеандомицин и азитромицин. Эритромицин активно воздействует на большинство грамположительных бактерий, Neisseria, Legionella и Haemophilus, и не воздействует на Enterobacteriaceae. Линкомицин и клиндамицин, которые блокируют образование пептидной связи в процессе синтеза белка, применяют против грамположительных бактерий.

Ингибитором трансляции другого типа является хлорамфеникол. Хлорамфеникол связывается с рибосомой 70 S, ингибируя пептидилтрансферазу бактериального фермента и предотвращая таким образом рост полипептидной цепи в процессе синтеза белка. Одним серьезным побочным эффектом, вызываемым хлорамфениколом, является гипопластическая анемия. Гипопластическая анемия возникает при дозах хлорамфеникола, эффективных для лечения бактериальных инфекций, у небольшой части пациентов (1/50000). Хлорамфеникол, который раньше был широко применяемым антибиотиком, в настоящее время назначается редко из-за возможности смерти вследствие анемии. Благодаря эффективности указанного антибиотика его все еще применяют в ситуациях, создающих опасность для жизни (например, в случае брюшного тифа).

Некоторые антибактериальные средства нарушают синтез или функционирование нуклеиновой кислоты, например связываются с ДНК или РНК, в результате чего передаваемая ими информация не может быть прочитана. Указанные средства включают, не ограничиваясь ими, хинолоны и котримоксазол, которые являются синтетическими химическими веществами, и рифамицины, которые являются природными или полусинтетическими химическими веществами. Хинолоны блокируют репликацию бактериальной ДНК, ингибируя ДНК-гиразу, фермент, необходимый бактериям для продуцирования кольцевой ДНК. Указанные средства имеют широкий спектр действия, и их примеры включают норфлоксацин, ципрофлоксацин, эноксацин, налидиксиновую кислоту и темафлоксацин. Налидиксиновая кислота является бактерицидным средством, которое связывается с ферментом ДНК-гиразой (топоизомеразой), необходимым для репликации ДНК, и вызывает ослабление и деформацию сверхспиралей, ингибируя активность ДНК-гиразы. Налидиксиновую кислоту применяют в основном для лечения инфекций нижнего отдела мочевых путей (UTI), так как она эффективно воздействует на несколько типов грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae и Proteus, которые обычно являются причиной возникновения UTI. Котримоксазол представляет собой комбинацию сульфаметоксазола и триметоприма, которая блокирует синтез бактериями фолиевой кислоты, необходимой для создания нуклеотидов ДНК. Рифампицин является производным рифамицина, который активно воздействует на грамположительные бактерии (включая Mycobacterium tuberculosis и менингит, вызываемый Neisseria meningitidis) и некоторые грамотрицательные бактерии. Рифампицин связывается с бета-субъединицами полимеразы и препятствует добавлению первого нуклеотида, необходимого для активации полимеразы, блокируя таким образом синтез мРНК.

Другой класс антибактериальных средств составляют соединения, которые действуют в качестве конкурентных ингибиторов бактериальных ферментов. Конкурентные ингибиторы в структурном отношении аналогичны фактору роста бактерий и конкурируют с ним за связывание, но не выполняют метаболической функции в клетке. Указанные соединения включают сульфонамиды и химически модифицированные формы сульфонамида, которые обладают более сильной и широкой антибактериальной активностью. Сульфонамиды (например, гантризин и триметоприм) пригодны для лечения Streptococcus pneumoniae, бета-гемолитического вида streptococci и E. coli, и их применяют для лечения неосложненных инфекций UTI, вызываемых E. coli, и менингококкового менингита.

Антивирусные средства представляют собой соединения, которые предотвращают инфицирование клеток вирусами или репликацию вируса в клетке. Антивирусных средств гораздо меньше, чем антибактериальных средств, так как процесс вирусной репликации настолько родственен репликации ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические антивирусные средства часто оказываются токсичными для хозяина. Процесс инфицирования вирусом состоит из нескольких стадий, которые можно блокировать или ингибировать антивирусными средствами. Такие стадии включают прикрепление вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулин или связывающие пептиды), декапсидацию вируса (например, амантадин), синтез или трансляцию вирусной мРНК (например, интерферон), репликацию вирусной РНК или ДНК (например, аналоги нуклеозидов), созревание белков новых вирусов (например, ингибиторы протеазы), почкование и высвобождение вируса.

К другой категории антивирусных средств относятся аналоги нуклеозидов. Аналоги нуклеозидов являются синтетическими соединениями, которые подобны нуклеозидам, но содержат неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. Сразу же после попадания аналогов нуклеозидов в клетку, они фосфорилируются, образуя трифосфатную форму, которая конкурирует с нормальными нуклеотидами за встраивание в вирусную ДНК или РНК. Как только трифосфатная форма аналога нуклеозида встраивается в растущую цепь нуклеиновой кислоты, она создает необратимую связь с вирусной полимеразой и, таким образом, прекращает образование цепи. Аналоги нуклеозидов включают, не ограничиваясь ими, ацикловир (применяемый для лечения вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы), ганцикловир (применяемый для лечения цитомегаловируса), идоксуридин, рибавирин (применяемый для лечения респираторно-синцитиального вируса), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин и зидовудин (азидотимидин).

Другой класс антивирусных средств составляют цитокины, такие как интерфероны. Интерфероны являются цитокинами, секретируемыми инфицированными вирусом клетками, а также иммунными клетками. Интерфероны связываются со специфическими рецепторами на клетках, смежных с инфицированными клетками, вызывая изменение в клетке, которое защищает ее от инфицирования вирусом. α- и β-Интерфероны также индуцируют экспрессию молекул МНС класса I и класса II на поверхности инфицированных клеток, усиливая представление антигена, необходимое для узнавания иммунными клетками хозяина. α- и β-Интерфероны существуют в рекомбинантных формах, и их применяют для лечения хронического гепатита В и С. При дозах, необходимых для эффективной антивирусной терапии, интерфероны вызывают тяжелые побочные эффекты, такие как лихорадка, недомогание и снижение веса.

Для профилактики вирусной инфекции применяют иммуноглобулиновую терапию. Иммуноглобулиновая терапия вирусных инфекций отличается от лечения бактериальных инфекций, так как, не являясь антиген-специфическим, иммуноглобулин связывается с внеклеточными вирионами и препятствует их прикреплению и проникновению в клетки, подверженные воздействию вирусной инфекции. Указанная терапия пригодна для профилактики вирусной инфекции при наличии антител в организме хозяина. Существуют два типа иммуноглобулиновой терапии: нормальная иммуноглобулиновая терапия и гипериммуноглобулиновая терапия. Для нормальной иммуноглобулиновой терапии используют продукт антитела, который получают из сыворотки нормальной донорской крови и собирают. Собранный продукт содержит низкие титры антитела к целому ряду вирусов человека, таких как гепатит А, парвовирус, энтеровирус (особенно у новорожденных). Для гипериммуноглобулиновой терапии используют антитела, которые получают из сыворотки субъектов, имеющих высокие титры антитела к определенному вирусу. Указанные антитела затем используют против определенного вируса. Примеры гипериммуноглобулинов включают иммуноглобулин против ветряной оспы (применяемый для профилактики ветряной оспы у детей с ослабленным иммунитетом и новорожденных), иммуноглобулин против бешенства человека (применяемый для профилактики заболевания у субъекта, укушенного бешеным животным), иммуноглобулин против гепатита В (применяемый для профилактики вируса гепатита В, особенно у субъекта, подверженного воздействию вируса) и иммуноглобулин против RSV (применяемый для лечения инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом).

Противогрибковые средства применяют для лечения и профилактики заражения инфекционными грибами. Противогрибковые средства иногда классифицируют в зависимости от механизма действия. Некоторые противогрибковые средства действуют в качестве ингибиторов оболочки клетки, подавляя глюкозосинтазу. Такие средства включают, не ограничиваясь ими, базиунгин/ECB. Другие противогрибковые средства дестабилизируют целостность мембраны. Такие средства включают, не ограничиваясь ими, имидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконакол, а также FK 463, амфотерицин В, BAY 38-9502, МК 991, прадимицин, UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые средства разрушают хитин (например, хитиназу) или вызывают иммуносупрессию (крем 501).

Паразитициды являются средствами, непосредственно убивающими паразитов. Такие соединения известны в данной области и являются коммерчески доступными. Примеры паразитицидов, пригодных для введения человеку, включают, не ограничиваясь ими, албендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлорохин HCl, фосфат хлорохина, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, фуроат дилоксанида, эфлорнитин, фуразолидаон, глюкокортикоиды, галофантрин, йодохинол, ивермектин, мебендазол, мефлохин, антимониат меглумина, меларзопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, паромомицин, изетиоат пентамидина, пиперазин, празиквантел, фосфат примахина, прогуанил, памоат пирантела, пириметанмин-сульфонамид, пириметанмин-сульфадоксин, хинакрин HCl, сульфат хинина, глюконат хинидина, спирамицин, стибоглюконат-натрий (глюконат сурьмы с натрием), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметроприм-сульфаметоксазол и трипарсамид.

Композиции и способы по данному изобретению можно также применять при лечении аллергии и астмы.

Термин "аллергия" означает приобретенную повышенную чувствительность к веществу (аллергену). Аллергические нарушения включают, не ограничиваясь ими, экзему, аллергический ринит или острый ринит, сенную лихорадку, аллергический конъюктивит, бронхиальную астму, крапивницу (сыпь) и пищевую аллергию, другие атопические заболевания, включающие атопический дерматит, анафилаксию, лекарственную аллергию и ангионевротический отек. Аллергические заболевания включают, не ограничиваясь ими, ринит (сенную лихорадку), астму, крапивницу и атопический дерматит.

Аллергия является заболеванием, которое обусловлено продуцированием антител определенного класса иммуноглобулинов, IgE, против аллергенов. Возникновение IgE-опосредованной реакции на обычные воздушные аллергены является также фактором, который указывает на предрасположенность к возникновению астмы. Если аллерген сталкивается с определенным IgE, который связывается с Fc-рецептором IgE (FcεR) на поверхности базофила (циркулирующего в крови) или мастоцита (диспергированного в твердой ткани), клетка активируется, в результате чего продуцируются и высвобождаются медиаторы, такие как гистамин, серотонин и липидные медиаторы.

Субъектом, страдающим аллергией, является такой субъект, который в настоящее время испытывает или ранее испытывал аллергическую реакцию на аллерген.

Субъектом с повышенным риском возникновения аллергии или астмы является субъект, который в прошлом страдал аллергией или астмой, но в настоящее время не испытывает активного проявления указанной болезни, а также субъект, у которого с большей вероятностью может возникнуть астма или аллергия под воздействием генетических или окружающих факторов. Субъектом с повышенным риском возникновения аллергии или астмы может быть также субъект, подвергающийся воздействию аллергена или рискующий заболеть астмой, то есть человек, у которого раньше были приступы астмы, или человек, предрасположенный к возникновению приступов астмы. Например, субъектом с повышенным риском возникновения аллергии может быть субъект, планирующий поехать в район, где обнаружен аллерген или инициатор астмы определенного типа, либо таким субъектом может быть человек, живущий в районе, где обнаружен аллерген. Если у субъекта возникает аллергическая реакция на определенный антиген или субъект испытывает воздействие антигена, например, во время опыления растений, такой субъект подвергается повышенному риску воздействия антигена.

Молекулы, вызывающие аллергическую реакцию, имеют общее название "аллерген". Термин "аллерген" в используемом здесь значении означает молекулу, способную вызывать иммунную реакцию, опосредованную IgE. Аллерген является веществом, которое может индуцировать аллергическую или астматическую реакцию у подверженного субъекта. Таким образом, в контексте данного изобретения термин "аллерген" означает особый тип антигена, способного стимулировать аллергическую реакцию, опосредованную антителом IgE. Способ и препараты по настоящему изобретению относятся к широкому классу таких аллергенов и фрагментов аллергенов или гаптенов, действующих в качестве аллергенов. Перечень аллергенов не имеет ограничений и может включать пыльцу, яды насекомых, перхоть животных, пыль, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин).

Существуют многочисленные виды аллергенов. Аллергическая реакция возникает, когда сенсибилизирующий иммуноглобулин типа IgE взаимодействует с чужеродным аллергеном. Антитело IgE связывается с мастоцитами и/или базофилами, и указанные специализированные клетки высвобождают химические медиаторы (вазоактивные амины) аллергической реакции под воздействием аллергенов, образующих мостиковую связь между концами молекулы антитела. Гистамин, тромбоцитарный фактор, метаболиты арахидоновой кислоты и серотонин являются наиболее известными медиаторами аллергических реакций у человека. Гистамин и другие вазоактивные амины обычно хранятся в мастоцитах и базофильных лейкоцитах. Мастоциты диспергированы в тканях животных, и базофилы циркулируют в сосудистой системе. Указанные клетки продуцируют и хранят гистамин в клетке, пока особая последовательность событий, включающая связывание IgE, не вызывает его высвобождение.

Симптомы аллергической реакции являются различными в зависимости от того, в какой области организма IgE взаимодействует с антигеном. Если взаимодействие происходит в респираторном эпителии, возникают такие симптомы, как чиханье, кашель и астматические реакции. Если указанное взаимодействие происходит в пищеварительном тракте, как это имеет место в случае пищевой аллергии, обычно появляются боли в брюшной полости и диарея. Системные реакции, например, возникающие после укуса пчелы, могут быть весьма серьезными и часто угрожают жизни.

Гиперчувствительность замедленного типа, известная также как аллергическая реакция типа IV, возникает, по крайней мере, через 12 часов после инвазии антигена в организм субъекта, страдающего аллергией, когда появляется воспалительная или иммунная реакция. Т-лимфоциты (сенсибилизированные Т-лимфоциты) субъектов, страдающих аллергическим заболеванием, взаимодействуют с антигеном, заставляя Т-лимфоциты высвобождать лимфокины (фактор угнетения миграции макрофагов (MIF), фактор активации макрофагов (MAF), митогенный фактор (MF), фактор реактивности кожи (SRF), хемотаксический фактор, фактор ускорения неоваскуляризации и т.д.), которые действуют в качестве медиаторов воспаления, и биологическая активность указанных лимфокинов наряду с прямым и непрямым действием локальных лимфоцитов и других воспалительных иммунных клеток вызывает возникновение аллергической реакции типа IV. Аллергические реакции замедленного типа включают туберкулиновую реакцию, реакцию отторжения аллотрансплантата, защитную реакцию в зависимости от клетки, контактный дерматит и тому подобные, которые, как известно, особенно сильно подавляются стероидными агентами. Поэтому стероидные агенты оказывают эффективное действие при лечении заболеваний, вызываемых аллергическими реакциями замедленного типа. Длительное применение стероидных агентов в обычно используемых концентрациях, однако, может вызывать серьезный побочный эффект, известный как стероидная зависимость. Способы по настоящему изобретению позволяют решить некоторые из указанных проблем благодаря возможности введения лекарственных средств в меньших и более редких дозах.

Немедленная гиперчувствительность (или анафилактическая реакция) является формой аллергической реакции, которая возникает очень быстро, то есть через несколько секунд или минут после воздействия аллергена, и опосредуется антителами IgE, продуцируемыми В-лимфоцитами. У субъектов, не страдающих аллергией, отсутствуют антитела IgE, в то время как у субъекта, страдающего аллергическими заболеваниями, антитело IgE опосредует немедленную гиперчувствительность путем сенсибилизации мастоцитов, которые широко распространены в коже, лимфоидных органах, сетчатке глаза, полости носа и рта, дыхательных путях и кишечнике.

На поверхности мастоцитов имеются рецепторы IgE, и у субъектов, страдающих аллергией, антитела IgE связываются с указанными рецепторами. Как было кратко рассмотрено выше, когда со связанным IgE контактирует соответствующий аллерген, происходит дегрануляция мастоцита и высвобождение в окружающую ткань разных веществ, именуемых биоактивными медиаторами, таких как гистамин. Биологическая активность именно этих веществ вызывает клинические симптомы, типичные для немедленной гиперчувствительности, а именно сокращение гладкой мускулатуры в дыхательных путях или кишечнике, расширение мелких кровеносных сосудов и повышение их проницаемости для воды и белков плазмы, секрецию густой липкой слизи, покраснение и опухание кожи и стимуляцию нервных окончаний, вызывающую зуд или боль.

Термин "астма" в используемом здесь значении означает заболевание дыхательной системы, которое характеризуется воспалением, сужением дыхательных путей и усилением реакции дыхательных путей на вдыхаемые вещества. Астма часто, хотя и не всегда, обусловлена атопическим или аллергическим заболеванием. Симптомы астмы включают повторяющиеся приступы стерторозного дыхания, одышку, тяжесть в груди и кашель, возникающий в результате затрудненности дыхания. Воспаление дыхательных путей, связанное с астмой, можно обнаружить по ряду физиологических изменений, таких как денудация эпителия дыхательных путей, отложение коллагена под базальной мембраной, отек, активация мастоцитов, инфильтрация воспалительных клеток, включающих нейтрофилы, инозинофилы и лимфоциты. В результате воспаления дыхательных путей у субъектов, страдающих астмой, часто повышается реация дыхательных путей, затрудняется дыхание, появляются респираторные симптомы и возникает хроническая форма заболевания. Затрудненность дыхания обусловлена острым бронхостенозом, отеком дыхательных путей, образованием слизистой пробки и изменением дыхательных путей, что часто вызывает обструкцию бронхов. В некоторых случаях астмы может возникнуть фиброз базальной мембраны, следствием которого является постоянное неправильное функционирование легкого.

Исследования, проводившиеся в течение последних нескольких лет, позволили установить, что астма, по-видимому, возникает в результате сложных взаимодействий между воспалительными клетками, медиаторами и другими клетками и тканями, находящимися в дыхательных путях. Мастоциты, инозинофилы, эпителиальные клетки, макрофаги и активированные Т-клетки играют важную роль в возникновении воспалительного процесса, обусловленного астмой; Djukanovic R. et al. (1990) Am. Rev. Respir. Dis. 142:434-457. Считается, что указанные клетки могут влиять на функцию дыхательных путей благодаря секреции заранее продуцированных и вновь синтезированных медиаторов, которые могут прямо или косвенно воздействовать на локальную ткань. Кроме того, установлено, что субпопуляции Т-лимфоцитов (Th2) играют важную роль в регуляции аллергического воспаления в дыхательных путях, высвобождая селективные цитокины и вызывая хроническую форму заболевания; Robinson D.S. et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326:298-304.

Астма является комплексным заболеванием, которое возникает на разных стадиях развития, и может быть классифицировано в зависимости от степени тяжести симптомов как острая, подострая или хроническая форма. Острая воспалительная реакция обусловлена ранним рекрутингом клеток в дыхательных путях. Подострая воспалительная реакция включает рекрутинг клеток, а также активацию резидентных клеток, вызывая более постоянную картину воспаления. Хроническая воспалительная реакция характеризуется постоянным уровнем поражения клеток и наступающим процессом восстановления, в результате которого может произойти постоянное нарушение дыхательных путей.

"Субъект, страдающий астмой" является субъектом, у которого имеется заболевание дыхательной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и повышенной реакцией дыхательных путей на вдыхаемые вещества. Астма часто, хотя и не всегда, сопровождается симптомами атопического или аллергического заболевания. Термин "инициатор" в используемом здесь значении означает композицию или фактор окружающей среды, который стимулирует возникновение астмы. Инициаторы включают, не ограничиваясь ими, аллергены, холодную температуру, физическую нагрузку, вирусные инфекции, SO₂.

Композиции и способы по настоящему изобретению можно применять отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами и методами, пригодными для лечения астмы. Термин "лекарственное средство от астмы/аллергии" в используемом здесь значении означает композицию, которая уменьшает симптомы, предотвращает развитие или подавляет астматическую или аллергическую реакцию. Разные типы лекарственных средств, предназначенных для лечения астмы и аллергии, описаны в публикации Guidelines For The Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2, NIH Publication № 97/4051, July 19, 1997, которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Ниже приведен краткий обзор лекарственных средств, описанных в публикации NIH. В большинстве вариантов осуществления изобретения лекарственное средство от астмы/аллергии пригодно в некоторой степени для лечения как астмы, так и аллергии.

Лекарственные средства для лечения астмы обычно разделены на две категории: быстродействующие лекарственные средства и лекарственные средства пролонгированного действия. Больные астмой ежедневно принимают лекарственные средства пролонгированного действия для контроля за состоянием при хронической астме. Лекарственные средства пролонгированного действия включают противовоспалительные средства, такие как кортикостероиды, хромолин-натрий и недокромил; бронхолитические средства пролонгированного действия, такие как β₂-агонисты пролонгированного действия, метилксантины и модификаторы лейкотриена. Быстродействующие лекарственные средства включают β₂-агонисты кратковременного действия, антихолинергические средства и системные кортикостероиды. Все указанные лекарственные средства вызывают много побочных эффектов, и ни одно из указанных лекарственных средств, применяемое отдельно или в комбинации, не позволяет предотвратить или полностью вылечить астму.

Лекарственные средства от астмы включают, не ограничиваясь ими, ингибиторы PDE-4, бронхолитическое средство/агонисты бета-2, лекарственные средства, открывающие К+ канал, антагонисты VLA-4, антагонисты нейрокина, ингибиторы синтеза тромбоксана А2 (ТХА2), ксантины, антагонисты арахидоновой кислоты, ингибиторы 5-липоксигеназы, антагонисты рецептора ТХА2, антагонисты ТХА2, ингибитор белков, активирующих 5-липокс, и ингибиторы протеазы.

Бронхолитическое средство/агонисты β₂ составляют класс соединений, которые вызывают расширение бронхов или расслабление гладких мышц. Бронхолитическое средство/агонисты β₂ включают, не ограничиваясь ими, салметерол, салбутамол, албутерол, тербуталин, D2522/формотерол, фенотерол, битолтерол, пирбуеролметилксантины и орципреналин. Агонисты β₂ пролонгированного действия и бронхолитические средства являются соединениями, которые пригодны для длительного предотвращения симптомов помимо противовоспалительного действия. Агонисты β₂ пролонгированного действия включают, не ограничиваясь ими, салметерол и албутерол. Указанные соединения обычно используют в сочетании с кортикостероидами и, как правило, не применяют без противовоспалительных средств. Указанные лекарственные средства вызывают такие побочные эффекты как тахикардия, дрожание скелетных мышц, снижение содержания калия и удлинение интервала QTc в случае передозировки.

Метилксантины, включающие, например, теофиллин, используют для длительного контроля и предотвращения возникновения симптомов заболевания. Указанные соединения вызывают расширение бронхов в результате подавления фосфодиэстеразы и, по-видимому, антагонистического воздействия на аденозин. Определенные проблемы при использовании соединений указанного типа представляют острые токсичные вещества, образующиеся в зависимости от дозы. В связи с этим применение указанного средства требует постоянного контроля за концентрацией лекарственного средства в сыворотке для выявления токсичности при узком спектре терапевтического действия вследствие индивидуальных различий в выведении продуктов обмена. Побочные эффекты включают тахикардию, тахиаритмию, тошноту и рвоту, стимуляцию центральной нервной системы, головную боль, припадки, кровавую рвоту, гипергликемию и пониженное содержание калия. Агонисты β₂ кратковременного действия включают, не ограничиваясь ими, албутерол, битолтерол, пирбутерол и тербуталин. При введении агонистов β₂ кратковременного действия возникают некоторые вредные побочные эффекты, такие как тахикардия, дрожание скелетных мышц, снижение содержания калия, увеличение содержания молочной кислоты, головная боль и гипергликемия.

Обычные методы лечения или профилактики аллергии включают использование антигистаминных или десенсибилизирующих средств. Антигистаминные и другие лекарственные средства, блокирующие действие химических медиаторов аллергической реакции, помогают регулировать тяжесть аллергических симптомов, но не предотвращают аллергическую реакцию и не оказывают воздействия на последующие аллергические реакции. В процессе десенсибилизирующего лечения вводят небольшие дозы аллергена, обычно в виде подкожной инъекции, чтобы вызвать реакцию IgG-типа против данного аллергена. Считается, что наличие антитела IgG помогает нейтрализовать продуцирование медиаторов, образующихся в результате индукции антител IgE. Сначала субъекту вводят очень низкую дозу аллергена во избежание сильной реакции, после чего дозу постепенно увеличивают. Такой тип лечения является опасным, так как субъекту фактически вводят соединения, которые вызывают аллергическую реакцию, поэтому может возникнуть сильная аллергическая реакция.

Лекарственные средства от аллергии включают, не ограничиваясь ими, антигистаминные средства, стероиды и индукторы простагландина. Антигистаминные средства представляют собой соединения, которые препятствуют высвобождению гистамина мастоцитами или базофилами. Указанные соединения хорошо известны в данной области, и их обычно применяют для лечения аллергии. Антигистаминные средства включают, не ограничиваясь ими, астемизол, азеластин, бетатастин, буклизин, цетеризин, аналоги цетеризина, CS 560, деслоратадин, эбастин, эпинастин, фексофенадин, HSR 609, левокабастин, лоратидин, мизоластин, норастемизол, терфенадин и траниласт.

Индукторы простагландина представляют собой соединения, которые индуцируют активность простагландина. Простагландины регулируют расслабление гладких мышц. Индукторы простагландина включают S-5751, не ограничиваясь данным препаратом.

Лекарственные средства от астмы/аллергии включают также стероиды и иммуномодуляторы. Стероиды включают, не ограничиваясь ими, беклометазон, флутиказон, триамцинолон, будесонид, кортикостероиды и будесонид.

Кортикостероиды включают, не ограничиваясь ими, дипропионат беклометазома, будезонид, флунизолид, пропионат флутикаозона и ацетонид триамцинолона. Хотя дексаметазон является кортикостероидом, обладающим противовоспалительным действием, обычно его не используют для лечения астмы/аллергии в виде лекарственной формы для ингаляции, так как он сильно адсорбируется и оказывает длительное супрессивное побочное действие при введении в эффективной дозе. Однако дексаметазон можно использовать в соответствии с настоящим изобретением для лечения астмы/аллергии, так как при применении в комбинации с нуклеиновыми кислотами по данному изобретению его можно вводить в низкой дозе для уменьшения побочных эффектов. Кортикостероид вызывает некоторые побочные эффекты, такие как кашель, дисфония, кандидозный стоматит, и при введении в более высоких дозах системные эффекты, такие как угнетение функции надпочечников, остеопороз, замедление роста, истончение кожи и гематомы; Barnes & Peterson (1993) Am. Rev. Respir. Dis. 148:S1-S26; and Kamada A.K. et al. (1996) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153:1739-48.

Кортикостероиды системного действия включают, не ограничиваясь ими, метилпреднизолон, преднизолон и преднизон. Кортикостероиды вызывают обратимое нарушение глюкозного обмена, повышенный аппетит, застой жидкости, увеличение веса, изменение настроения, гипертензию, пептическую язву и асептический некроз костей. Указанные соединения пригодны для кратковременного (3-10 дней) предотвращения воспалительной реакции при неправильно контролируемой хронической астме. Указанные соединения применяют также для длительного предотвращения симптомов в случае тяжелой хронической астмы и устранения обратимого воспалительного процесса. Некоторые побочные эффекты, возникающие при более длительном применении, включают угнетение функции надпочечников, замедление роста, истончение кожи, гипертензию, диабет, синдром Кушинга, катаракту, мышечную слабость и в редких случаях ухудшение иммунной функции. Соединения указанных типов рекомендуется использовать в наименьшей эффективной дозе (руководства по диагностике и лечению астмы; отчет экспертного совета; Publication NIH № 97-4051; July 1997).

Иммуномодуляторы включают, не ограничиваясь ими, противовоспалительные средства, антагонисты лейкотриена, мутанты IL-4, растворимые рецепторы IL-4, иммуносупрессоры (такие как вызывающая толерантность пептидная вакцина), антитела против IL-4, антагонисты IL-4, антитела против IL-5, слитые белки - растворимый IL-13 рецептора-Fc, антитела против IL-9, антагонисты CCR3, антагонисты ССR5, ингибиторы VLA-4 и средства, снижающие содержание IgE.

Модификаторы лейкотриена часто используют для длительного предотвращения возникновения симптомов заболевания в случае хронической астмы средней тяжести. Модификаторы лейкотриена действуют в качестве антагонистов рецепторов лейкотриена, избирательно конкурируя за связывание с рецепторами LTD-4 и LTE-4. Указанные соединения включают, не ограничиваясь ими, таблетки зафирлукаста и зилеутона. Таблетки зилеутона являются ингибиторами 5-липоксигеназы. Указанные лекарственные средства повышают содержание ферментов в печени и в некоторых случаях вызывают обратимый гепатит и гипербилирубинемию. Лейкотриены являются биохимическими медиаторами, выделяемыми мастоцитами, инозинофилами и базофилами, которые вызывают сокращение гладких мышц дыхательных путей, увеличивают проницаемость сосудов, стимулируют секрецию слизи и активируют воспалительные клетки в дыхательных путях больных астмой.

Другие иммуномодуляторы включают нейропептиды, которые, как установлено, обладают иммуномодулирующими свойствами. Функциональные исследования показали, что вещество Р, например, может влиять на функцию лимфоцитов при помощи специфических опосредованных рецепторами механизмов. Кроме того, установлено, что вещество Р модулирует немедленную гиперчувствительность, стимулируя образование медиаторов на основе арахидоновой кислоты, выделяемых мастоцитами слизистой оболочки; McGillies J. et al. (1987) Fed. Proc. 46:196-9 (1987). Вещество Р является нейропептидом, который был впервые обнаружен в 1931 г; Von Euler and Gaddum J. Physiol (London) 72:74-87 (1931). Аминокислотная последовательность указанного вещества была описана Chang et al. в 1971 г; Chang M.M. et al. (1971) Nature New Biol. 232:86-87. Иммунорегуляторное действие фрагментов вещества Р было исследовано Siemion I.Z. et al. (1990) Molec. Immunol. 27:887-890 (1990).

Другой класс соединений составляют соединения, понижающие содержание IgE. Указанные соединения включают пептиды или другие молекулы, способные связываться с рецептором IgE, предотвращая таким образом связывание антигенспецифического IgE. Другим типом соединения, понижающего содержание IgE, является моноклональное антитело к области связывания рецептора IgE молекулы IgE человека. Таким образом, одним типом соединения, понижающего содержание IgE, является антитело против IgE или фрагмент такого антитела. Антитело против IgE было создано в компании Genentech. Специалист в данной области может получить функционально активные фрагменты связывающихся пептидов антитела, выполняющих такую же функцию. Другими типами соединений, понижающих содержание IgE, являются полипептиды, способные блокировать связывание антитела против IgE с Fc-рецепторами на поверхности клеток, вытесняя IgE с сайтов связывания.

Проблема, связанная с применением соединений, понижающих содержание IgE, состоит в том, что многие молекулы не обладают прочностью связи с рецептором, соответствующей очень сильному взаимодействию между нативной молекулой IgE и ее рецептором. Молекулы, обладающие указанной прочностью связи, обычно необратимо связываются с рецептором. Однако такие вещества являются относительно токсичными, так как они могут связываться ковалентно и блокировать другие структурно подобные молекулы в организме. В данной связи интересно то, что α-цепь рецептора IgE относится к более крупному семейству генов, которое, например, включает несколько разных Fc-рецепторов IgG. Указанные рецепторы совершенно необходимы для защиты организма, например, от бактериальных инфекций. Кроме того, молекулы, активированные на ковалентное связывание, часто являются относительно неустойчивыми, поэтому их приходится вводить несколько раз в день и в относительно высоких концентрациях, чтобы полностью блокировать постоянно обновляющийся пул рецепторов IgE на мастоцитах и базофильных лейкоцитах.

Хромолин-натрий и недокромил применяют в качестве лекарственных средств пролонгированного действия для предотвращения первичных симптомов астмы, возникающих в результате физической нагрузки, или аллергических симптомов, возникающих под воздействием аллергенов. Считается, что указанные соединения блокируют ранние и поздние реакции на аллергены, препятствуя функционированию хлоридного канала. Указанные средства также стабилизируют мембраны мастоцитов и подавляют активацию и высвобождение медиаторов из инозинофилов и эпителиальных клеток. Для достижения максимального эффекта указанные средства необходимо принимать в течение четырех-шести недель.

Антихолинергические средства обычно применяют для снятия острого бронхоспазма. Считается, что указанные соединения конкурентно ингибируют холинергические рецепторы мускарина. Антихолинергические средства включают бромид ипратропия, не ограничиваясь указанным средством. Данные соединения снимают только холинергически опосредованный бронхоспазм и не изменяют реакцию на антиген. Побочные эффекты, вызываемые указанными средствами, включают сухость в полости рта и респираторную секрецию, повышенное стерторозное дыхание у некоторых субъектов и неясность зрения при попадании в глаза.

Кроме стандартных лекарственных средств от астмы/аллергии существуют другие методы лечения астмы/аллергии, которые применяют отдельно или в сочетании с общепринятыми лекарственными средствами. Одним предпочтительным, но не всегда возможным методом ослабления аллергической реакции, является избегание воздействия аллергена или инициатора. Другой метод, применяемый в настоящее время для лечения аллергических заболеваний, включает инъецирование возрастающих доз аллергена для достижения толерантности к данному аллергену и предотвращения последующих аллергических реакций.

Известно, что метод инъецирования аллергена (иммунотерапия аллергеном) уменьшает тяжесть проявления аллергического ринита. Теоретическое обоснование указанного метода состоит в том, что под влиянием аллергена в организме образуется другая форма антитела, а именно защитного антитела, которое получило название "блокирующего антитела"; Cooke R.A. et al. (1935) Serologic Evidence of Immunity with Coexisting Sensitization in a Type of Human Allergy, Exp. Med. 62:733. Другие методы лечения аллергии включают химическую модификацию аллергена, в результате которой способность аллергена вызывать иммунный ответ у субъекта остается неизменной, но при этом существенно изменяется его способность вызывать аллергическую реакцию. Однако потребуется несколько лет, чтобы указанные методы стали действительно эффективными и не вызывали побочных эффектов, таких как анафилактический шок.

Композиции и способы по настоящему изобретению можно применять для модуляции иммунного ответа. Возможность модулировать иммунный ответ позволяет предотвращать и/или лечить определенные заболевания, которые поддаются лечению в результате модуляции иммунной системы.

Лечение, проводимое после возникновения заболевания, направлено на уменьшение, ослабление или полное устранение указанного заболевания и/или сопутствующих симптомов или предотвращения его ухудшения. Лечение, проводимое до возникновения заболевания (то есть профилактическое лечение), направлено на уменьшение риска возникновения заболевания. В используемом здесь значении термин "предотвращение" означает профилактическое лечение субъектов с повышенным риском возникновения заболевания (направленное на уменьшение вероятности того, что субъект заболеет данным заболеванием) и подавление дальнейшего развития диагностированного заболевания.

Для лечения субъекта могут быть необходимы разные дозы лекарственного средства в зависимости от активности соединения, способа введения, цели иммунизации (то есть профилактической или терапевтической), характера и тяжести заболевания, возраста и веса тела субъекта. Требуемую дозу можно вводить однократно в виде одной дозированной лекарственной формы или многократно в виде нескольких меньших дозированных лекарственных форм. Многократное введение требуемых доз через определенное количество недель или месяцев необходимо для усиления антигенспецифического иммунного ответа.

Благодаря информации, приведенной в данном описании изобретения, в результате правильного выбора активных соединений с учетом таких факторов как эффективность лекарственного средства, относительная биологическая доступность, вес тела субъекта, тяжесть вредных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, можно спланировать эффективную схему профилактического или терапевтического лечения, которая будет нетоксичной и эффективной для лечения конкретного субъекта. Эффективное количество любого лекарственного средства может изменяться в зависимости от таких факторов как характер подлежащего лечению заболевания, вводимое лекарственное средство (например, в случае иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, это тип нуклеиновой кислоты, то есть CpG-содержащая нуклеиновая кислота, число неметилированных мотивов CpG или их расположение в нуклеиновой кислоте, степень модифицикации остова олигонуклеотида и т.д.), размер субъекта или тяжесть заболевания или нарушения. Специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество определенной нуклеиновой кислоты и/или другого лекарственного средства без ненужного экспериментирования.

Дозы соединений по данному изобретению обычно составляют от около 0,1 мкг до 10000 мг, более типично от около 1 мкг/сутки до 8000 мг и наиболее типично от около 10 мкг до 100 мкг в сутки. В расчете на вес тела субъекта типичные дозы составляют от около 0,1 мкг до 20 мг/кг/сутки, более типично от около 1 до 10 мг/кг/сутки и наиболее типично от около 1 до 5 мг/кг/сутки.

Фармацевтические композиции, содержащие нуклеиновые кислоты и/или другие соединения, можно вводить любым приемлемым способом. Существует целый ряд способов введения. Выбор способа введения зависит, несомненно, от выбраного средства или средств, конкретного заболевания, подлежащего лечению, и дозы, необходимой для достижения терапевтического эффекта. Осуществление способов по данному изобретению возможно при любом способе введения, приемлемом с медицинской точки зрения, а именно при любом способе, который обеспечивает достижение эффективных уровней иммунного ответа, не вызывая клинически неприемлемых вредных эффектов. В данном описании изобретения рассмотрены предпочтительные способы введения. В терапии эффективное количество нуклеиновой кислоты и/или другого лекарственного средства можно вводить субъекту любым способом, обеспечивающим доставку данного средства на требуемый участок, например, через слизистую оболочку или системно.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым способом, известным специалисту в данной области. Способы введения включают, не ограничиваясь ими, пероральный, парентеральный, внутривенный, внутримышечный, назальный, подъязычный, внутритрахеальный, в виде ингаляции, подкожный, глазной, вагинальный и ректальный. Для лечения или профилактики астмы или аллергии такие соединения предпочтительно вводят в виде ингаляции, приема внутрь или системными способами. Системные способы введения включают пероральный и парентеральный. Лекарственные формы, вводимые в виде ингаляции, являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления изобретения благодаря прямой доставке в легкое, к месту воспалительного процесса, прежде всего у больных астмой. Для введения лекарственного средства при помощи ингаляции обычно применяют устройства нескольких типов. Такие устройства включают дозирующие ингаляторы (MDI), респираторные MDI, ингаляторы сухого порошка (DPI), двухполостные камеры в комбинации с MDI и аэрозольные ингаляторы.

Лекарственные средства по настоящему изобретению могут быть доставлены в определенную ткань, клетку или иммунную систему при помощи вектора. В наиболее широком смысле слова термин "вектор" означает любой носитель, способный облегчить перенос композиций к клеткам-мишеням. Вектор обычно переносит иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту, антитело, антиген и/или лекарственное средство для лечения данного заболевания в клетки-мишени при меньшей степени разрушения по сравнению с разрушением, возможным при отсутствии вектора.

Векторы, пригодные для применения в данном изобретении, обычно делятся на два класса: биологические векторы и химические/физические векторы. Биологические векторы и химические/физические векторы пригодны для доставки и/или поглощения лекарственных средств по данному изобретению.

Большинство биологических векторов пригодны для доставки нуклеиновых кислот, поэтому такой способ особенно подходит для доставки лекарственных средств, которые являются иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами или содержат такие кислоты.

Помимо биологических векторов, рассмотренных в данном описании изобретения, для доставки лекарственных средств, содержащих иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антитела, антигены и лекарственные средства для лечения конкретного заболевания можно использовать химические/физические векторы. В используемом здесь значении термин "химический/физический вектор" означает естественную или синтетическую молекулу, кроме выделенной из бактериологических или вирусных источников, которая способна доставить к месту действия нуклеиновую кислоту и/или другое лекарственное средство.

Предпочтительным химическим/физическим вектором по данному изобретению является коллоидная дисперсная система. Коллоидные дисперсные системы включают системы на липидной основе, в том числе эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой по данному изобретению является липосома. Липосомы являются искусственными сосудами с оболочкой, которые применяются в качестве вектора доставки in vivo или in vitro. Установлено, что крупные однослойные пузырьки (LUV) размером 0,2-4,0 мкм могут инкапсулировать крупные макромолекулы. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы в водной среде внутри пузырька и доставлены к клеткам в биологически активной форме; Fraley et al. (1981) Trends Biochem. Sci. 6:77.

Липосомы могут направленно воздействовать на определенную ткань в результате связывания со специфическим лигандом, таким как моноклональное антитело, сахар, гликолипид или белок. Лиганды, которые можно использовать для направленной доставки липосомы к иммунной клетке, включают, не ограничиваясь ими, интактные молекулы или их фрагменты, которые взаимодействуют со специфическими рецепторами иммунной клетки, и молекулы, такие как антитела, которые взаимодействуют с маркерами на поверхности иммунных клеток. Такие лиганды можно легко идентифицировать при помощи анализов связывания, хорошо известных специалистам в данной области. В других вариантах осуществления изобретения липосома может быть направленно доставлена в раковую опухоль в результате связывания с одним из иммунотерапевтических антител, рассмотренных выше. Кроме того, вектор может быть связан с ядерным направляющим пептидом, который направляет вектор к ядру клетки-хозяина.

Липидные препараты, предназначенные для трансфекции, можно приобрести коммерческим путем в компании QIAGEN, например EFFECTENE™ (нелипосомный липид со специальным ДНК-конденсирующим энхансером) и SUPERFECT™ (новая дендримерная технология).

Липосомы можно приобрести коммерческим путем в компании Gibco BRL, например LIPOFECTIN™ и LIPOFECTACE™, которые получены из катионных липидов, таких как хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA) и бромид диметилдиоктадециламмония (DDAB). Способы получения липосом хорошо известны в данной области и описаны во многих публикациях. Липосомы также рассмотрены в научной публикации Gregoriadis G. (1985) Trends Biotechnol. 3:235-241.

В одном варианте осуществления изобретения носитель является биосовместимой микрочастицей или имплантатом, пригодным для имплантации или введения млекопитающему-реципиенту. Типичные биологически разрушаемые имплантаты, пригодные для осуществления способа по данному изобретению, описаны в международной заявке на патент РСТ № PCT/US/03307 (публикация № WO95/24929, озаглавленная "Polymeric Gene Delivery System"). В заявке РСТ/US/0307 описана биосовместимая, предпочтительно биологически разрушаемая полимерная матрица, содержащая экзогенный ген под контролем соответствующего промотора. Полимерную матрицу можно использовать для пролонгированного высвобождения лекарственного средства в организме субъекта.

Полимерная матрица предпочтительно имеет форму микрочастицы, такой как микросфера (где нуклеиновая кислота и/или другое лекарственное средство диспергировано в твердой полимерной матрице) или микрокапсула (где нуклеиновая кислота и/или другое лекарственное средство находится внутри полимерной оболочки). Другие формы полимерной матрицы для лекарственного средства включают пленки, покрытия, гели, имплантаты и стенты. Размер и состав полимерной матрицы выбирают с возможностью достижения благоприятной кинетики высвобождения в ткань, в которую была введена данная матрица. Размер полимерной матрицы далее выбирают с учетом способа доставки, которым обычно является инъекция в ткань или введение суспензии в виде аэрозоля в нос и/или легкое. При аэрозольном способе введения полимерную матрицу и нуклеиновую кислоту и/или другое лекарственное средство предпочтительно заключают в поверхностно-активный носитель. Состав полимерной матрицы можно выбрать с учетом необходимой скорости разрушения, а также материала, который является биоадгезивным, в результате чего может быть повышена эффективность переноса при введении матрицы в нос и/или пораженное легкое. Кроме того, можно выбрать состав матрицы, который не разрушается, а выводится путем диффузии в течение длительного периода времени. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения нуклеиновую кислоту вводят субъекту при помощи имплантата, в то время как другое лекарственное средство вводят с возможностью немедленного воздействия. Биосовместимые микросферы, пригодные для таких способов доставки лекарственного средства, как пероральное введение или введение через слизистую оболочку, описаны в публикациях Chickering et al. (1996) Biotech. Bioeng. 52:96-101 and Mathiowitz E. et al. (1997) Nature 386:410-414 и заявка на патент РСТ WO97/03702.

Для доставки в организм субъекта нуклеиновой кислоты и/или другого лекарственного средства можно использовать как биологически неразрушаемые, так и биологически разрушаемые полимерные матрицы. Биологически разрушаемые матрицы являются предпочтительными. Такие полимеры могут быть природными или синтетическими полимерами. Полимер выбирают с учетом периода времени, на протяжении которого желательно высвобождение лекарственного средства, обычно в пределах от нескольких часов до года или дольше. Наиболее желательным является высвобождение лекарственного средства, особенно средства на основе нуклеиновой кислоты, в течение периода времени от несколько часов до трех-двенадцати месяцев. Полимер необязательно имеет форму гидрогеля, который может адсорбировать примерно до 90% своей массы в воде и который далее необязательно поперечно сшит с многовалентными ионами или другими полимерами.

Особый интерес представляют биоадгезивные полимеры, которые включают биологически разрушаемые гидрогели, описанные в публикации H.S. Sawhney, C.P. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules (1993), 26:581-587, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Указанные полимеры включают полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глутин, полиангидриды, полиакриловую кислоту, альгинат, хитозан, полиметилметакрилаты, полиэтилметакрилаты, полибутилметакрилат, полиизобутилметакрилат, полигексилметакрилат, полиизодецилметакрилат, полилаурилметакрилат, полифенилметакрилат, полиметилакрилат, полиизопропилакрилат, полиизобутилакрилат и полиоктадецилакрилат.

Если лекарственным средством является нуклеиновая кислота, желательно использовать уплотняющие агенты. Уплотняющие агенты можно использовать отдельно или в комбинации с биологическим или химическим/физическим вектором. Термин "уплотняющий агент" в используемом здесь значении означает агент, такой как гистон, который нейтрализует отрицательные заряды в нуклеиновой кислоте и, таким образом, обеспечивает уплотнение нуклеиновой кислоты с образованием мелкой гранулы. Уплотнение нуклеиновой кислоты облегчает поглощение данной нуклеиновой кислоты клеткой-мишенью. Уплотняющие агенты можно использовать отдельно, то есть доставлять нуклеиновую кислоту в форме, которая более эффективно поглощается клеткой, или более предпочтительно в сочетании с одним или несколькими описанными выше векторами.

Другие типичные композиции, которые можно использовать для облегчения поглощения нуклеиновой кислоты, включают фосфат кальция и другие химические медиаторы внутриклеточного переноса, композиции для микроинъекций, композиции для электропорации и гомологичной рекомбинации (например, для встраивания нуклеиновой кислоты в заранее выбранное место в хромосоме клетки-мишени).

Указанные соединения можно вводить отдельно (например, в физиологическом растворе или буфере) или использовать любые векторы доставки, известные в данной области. Например, в научной литературе описаны нижеследующие векторы доставки: кохлеаты (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996), эмульсомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997), ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999), липосомы (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b), живые бактериальные векторы (например, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatteguerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998), живые вирусные векторы (например, вирус коровьей оспы, аденовирус, вирус простого герпеса) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999), микросферы (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989), вакцины на основе нуклеиновой кислоты (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997), полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998), циклические полимеры (Wyatt et al., 1998), протеосомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997), фторид натрия (Hashi et al., 1998), трансгенные растения (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995), виросомы (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998) и вирусоподобные частицы (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998).

Препараты по настоящему изобретению вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые могут содержать в фармацевтически приемлемых концентрациях соль, буферные агенты, консерванты, совместимые носители, адъюванты и необязательно другие лекарственные ингредиенты.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые пригодны для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин "носитель" означает природный или синтетический, органический или неорганический ингредиент, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения введения. Компоненты фармацевтических композиций также можно объединять с соединениями по настоящему изобретению и друг с другом так, чтобы исключить возможность взаимодействия, которое существенно ухудшает требуемую фармацевтическую эффективность.

Предназначенные для перорального введения соединения (то есть нуклеиновые кислоты, антигены, антитела и другие лекарственные средства) можно легко получить, объединяя активные соединения с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют получить из соединений по данному изобретению таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и тому подобные, предназначенные для перорального введения субъекту, подлежащему лечению. Фармацевтические препараты для перорального введения могут быть получены с использованием твердого наполнителя, при этом полученную смесь необязательно измельчают, при желании добавляют приемлемые вспомогательные вещества и производят обработку смеси гранул, получая при этом таблетки или сердцевины драже. Приемлемыми наполнителями являются, в частности, сахара, включающие лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (PVP). При желании могут быть добавлены агенты, улучшающие распадаемость, в частности поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Препараты для перорального введения могут быть необязательно получены в физиологическом растворе или буферах для нейтрализации кислотных условий или могут быть введены без каких-либо носителей.

На сердцевину драже наносят приемлемые покрытия. Для указанной цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, карбопольный гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакирующие растворы и приемлемые органические растворители или смеси растворителей. В покрытия таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или отличия разных комбинаций доз активного соединения.

Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают наполняемые желатиновые капсулы, а также мягкие, запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Наполняемые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающими веществами, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. Активные соединения, заключенные в мягкие капсулы, могут быть растворены или суспендированы в приемлемых жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Можно также использовать микросферы, предназначенные для перорального введения. Такие микросферы хорошо известны в данной области. Все препараты для перорального введения должны быть получены в дозах, приемлемых для такого введения.

Предназначенные для трансбуккального введения композиции могут быть в форме таблеток или лепешек, полученных известным методом.

Предназначенные для ингаляции соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде аэрозольного спрея, распыляемого из находящихся под давлением баллонов или ингалятора с использованием приемлемого пропеллента, такого как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой приемлемый газ. При использовании находящегося под давлением аэрозоля требуемая доза может быть определена при помощи клапана, распыляющего отмеренное количество препарата. Капсулы и картриджи, например, изготовленные из желатина и предназначенные для применения в ингаляторе или инсуффляторе, могут содержать порошкообразную смесь соединения и приемлемой порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Соединения, предназначенные для системного введения, могут быть получены в виде препарата для парентерального введения при помощи инъекции, например инъекции ударной дозы вещества, или непрерывного вливания. Препараты для инъекции могут быть получены в виде дозированной лекарственной формы, например, в ампулах или емкостях, рассчитанных на несколько доз, с добавлением консерванта. Указанные композиции могут представлять собой такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать такие агенты как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические препараты для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений можно получить в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Приемлемые липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры искусственных жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Указанная суспензия может необязательно содержать приемлемые стабилизаторы или вещества, повышающие растворимость соединений и обеспечивающие получение высококонцентрированных растворов.

Альтернативно, активные соединения могут представлять собой порошок, предназначенный для восстановления перед применением приемлемым носителем, например апирогенной водой.

Указанные соединения могут также входить в состав композиций для ректального или вагинального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Помимо вышеописанных препаратов указанные соединения могут быть также получены в виде депо-препаратов. Такие препараты пролонгированного действия могут содержать приемлемые полимерные или гидрофобные вещества (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), ионообменные смолы или медленно растворимые производные, например медленно растворимую соль.

Фармацевтические композиции могут также содержать приемлемые твердые или гелеобразные носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают, не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Приемлемые жидкие или твердые фармацевтические препараты представляют собой, например, водные или солевые растворы, предназначенные для ингаляции, микрокапсулы, содержимое ложки для приема лекарства, покрытия, наносимые на микроскопические частицы золота, липосомы, распылямые средства, аэрозоли, гранулы для имплантации в кожу или вещество, высушенное на остром предмете и вводимое в кожу через царапину. Фармацевтические композиции включают также гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытием, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных соединений, содержащие описанные выше наполнители и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как дезинтеграторы, связывающие вещества, покрывающие вещества, отдушки, смазывающие вещества, ароматизаторы, подсластители или солюбилизаторы. Указанные фармацевтические композиции пригодны для применения в разных системах доставки лекарственных средств. Для ознакомления с методами доставки лекарственных средств см. публикацию Langer R. (1990) Science 249:1527-1533, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Нуклеиновые кислоты и необязательно другие лекарственные средства и/или антигены могут быть введены per se (в чистом виде) или в форме фармацевтически приемлемой соли. Соли, предназначенные для использования в медицине, должны быть фармацевтически приемлемыми, но фармацевтически неприемлемые соли можно успешно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают, не ограничиваясь ими, соли, полученные из нижеследующих кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, малеиновая, уксусная, салициловая, п-толуолсульфоновая, винная, лимонная, метансульфоновая, муравьиная, малоновая, янтарная, нафталин-2-сульфоновая и бензолсульфоновая. Кроме того, такие соли можно получить в виде солей щелочных или щелочно-земельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, группы карбоновой кислоты.

Приемлемые буферные агенты включают уксусную кислоту и соль (1-2% мас/об), лимонную кислоту и соль (1-3% мас/об), борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас/об), фосфорную кислоту и соль (0,8-2% мас/об). Приемлемые консерванты включают хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас/об), хлорбутанол (0,3-0,9% мас/об), парабены (0,01-0,25%, мас/об) и тимерозал (0,004-0,02% мас/об).

Указанные композиции могут представлять собой дозированную лекарственную форму, которая может быть получена любыми методами, хорошо известными в фармакологии. Все методы включают стадию объединения соединений с носителем, который состоит из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Как правило, композиции получают в результате однородного смешивания соединений с жидким носителем, тонко измельченным твердым носителем или обоими, вместе с последующим формованием продукта в случае необходимости. Жидкие дозированные формы находятся во флаконах или ампулах. Твердые дозированные формы представляют собой таблетки, капсулы и суппозитории.

Другие системы доставки могут включать системы с хронометрированным высвобождением, отсроченным высвобождением или пролонгированным высвобождением лекарственного средства. Такие системы позволяют избежать повторных приемов соединений, являются более удобными для субъекта и лечащего врача. Существует много типов систем доставки, известных специалистам в данной области. Указанные системы включают системы на полимерной основе, такие как полилактидгликолид, сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы из вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны, например, в патенте США № 5075109. Системы доставки включают также неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включающие стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина, жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- или триглицериды, гидрогелевые системы, силастиковые системы, пептидные системы, покрытия из воска, прессованные таблетки, полученные с использованием обычных связывающих веществ и наполнителей, частично конденсированные имплантаты и тому подобные. Типичные примеры включают, не ограничиваясь ими: (а) разрушаемые системы, в которых средство по данному изобретению находится внутри матрицы, аналогичные описанным в патентах США №№ 4452775, 4675189 и 5736152, и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент проникает с регулируемой скоростью из полимера, аналогичные описанным в патентах США №№ 3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того, можно использовать насосные системы доставки, некоторые из которых адаптированы для имплантации.

Настоящее изобретение относится также к эффективным способам идентификации иммуностимулирующих соединений и оптимизации идентифицированных таким образом соединений и агентов. Методы скрининга обычно включают анализ соединений, подавляющих или усиливающих передачу сигнала при помощи определенного рецептора TLR. Для выполнения указанных методов необходим рецептор TLR, приемлемый контрольный лиганд для TLR и предполагаемое иммуностимулирующее соединение. Выбранный рецептор TLR вводят в соприкосновение с приемлемым контрольным соединением (лигандом TLR) и измеряют TLR-опосредованный контрольный сигнал. Выбранный рецептор TLR вводят также в соприкосновение с предполагаемым иммуностимулирующим соединением и измеряют TLR-опосредованный испытуемый сигнал. Испытуемый сигнал затем сравнивают с контрольным сигналом. Эффективное предполагаемое иммуностимулирующее соединение можно затем использовать в качестве контрольного соединения при выполнении данного анализа. Такие методы могут быть автоматизированы для выполнения высокопроизводительного скрининга предполагаемых соединений. Примеры таких высокопроизводительных методов скрининга описаны в патентах США №№ 6103479, 6051380, 6051373, 5998152, 5876946, 5708158, 5443791, 5429921 и 5143854.

В используемом здесь значении термин "передача сигнала рецептором TLR" означает способность полипептида TLR активировать путь передачи сигнала Toll/IL-1R (TIR), определяемый также в данном описании изобретения как путь трансдукции сигнала TLR. Изменение активности TLR можно измерить при помощи анализов, предназначенных для измерения экспрессии генов под контролем κВ-чувствительных промоторов и энхансеров. Такие гены могут быть естественными генами или генами, искусственно введенными в клетку. Естественные гены-репортеры включают гены, кодирующие IL-1β, IL-6, IL-8, субъединицу р40 интерлейкина 12 (IL-12 p40) и костимулирующие молекулы CD80 и CD86. Такие регуляторные элементы могут контролировать другие гены, благодаря чему они могут информировать об уровне передачи сигнала рецептором TLR.

Анализируемая смесь содержит предполагаемое иммуностимулирующее соединение. Обычно параллельно исследуют несколько анализируемых смесей с разными концентрациями агентов для получения разной реакции на разные концентрации. Одна из указанных концентраций обычно является отрицательной контрольной концентрацией, то есть нулевой концентрацией агента или концентрацией агента ниже предела обнаружения в данном анализе. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут относиться к разным классам химических веществ, хотя обычно они являются органическими соединениями. В некоторых вариантах осуществления изобретения предполагаемые иммуностимулирующие соединения являются мелкими молекулами РНК или низкомолекулярными органическими соединениями, то есть органическими соединениями с молекулярной массой больше 50, но меньше примерно 2500 Да. Полимерные предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут иметь более высокую молекулярную массу, например молекулярная масса олигонуклеотидов может находиться в пределах от около 2500 до около 12500. Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут также быть биомолекулами, такими как нуклеиновые кислоты, пептиды, сахариды, жирные кислоты, стерины, изопреноиды, пурины, пиримидины, производными или структурными аналогами вышеуказанных соединений, их комбинациями и тому подобными. Когда предполагаемое иммуностимулирующее соединение представляет собой нуклеиновую кислоту, такое предполагаемое иммуностимулирующее соединение обычно является молекулой ДНК или РНК, хотя в объем настоящего изобретения входят также модифицированные нуклеиновые кислоты, включающие искусственные связи или субъединицы.

Предполагаемые иммуностимулирующие соединения могут быть получены из целого ряда источников, включающих библиотеки природных, синтетических или полусинтетических соединений или любые их комбинации. Например, существуют разные способы произвольного и направленного синтеза целого ряда органических соединений и биомолекул, в том числе экспрессия рандомизированных олигонуклеотидов, комбинированные библиотеки синтетических органических соединений, библиотеки фагов рандомизированных пептидов и тому подобные. Альтернативно, существуют или могут быть легко созданы библиотеки природных соединений в форме бактериальных, грибных, растительных и животных экстрактов. Кроме того, библиотеки природных и синтетических соединений могут быть легко модифицированы известными химическими, физическими и биохимическими методами. Известные фармакологические средства могут быть подвергнуты направленной или произвольной химической модификации, такой как ацилирование, алкилирование, этерификация, амидирование и т.д., с образованием структурных аналогов предполагаемых иммуностимулирующих соединений.

Вышеуказанная смесь может также содержать ряд других реагентов. Такие реагенты включают соли, буферы, нейтральные белки (например, альбумин), детергенты и т.д., которые можно использовать для облегчения оптимального связывания белок-белок и/или белок-нуклеиновая кислота. Такой реагент может также уменьшать неспецифические или фоновые взаимодействия реакционных компонентов. В состав смеси могут также входить другие реагенты, повышающие эффективность анализа, такие как ингибиторы протеазы, ингибиторы нуклеазы, антимикробные средства и тому подобные.

Можно легко определить порядок добавления компонентов, температуру инкубации, время инкубации и другие параметры анализа. Такое экспериментирование относится только к оптимизации параметров анализа, а не к основной анализируемой композиции. Температура инкубации обычно находится в интервале от 4 до 40°С, в частности равна примерно 37°С. Время инкубации предпочтительно является минимальным для облегчения быстрого, высокопроизводительного скрининга и обычно составляет от 1 минуты до 10 часов.

После инкубации любым методом, известным пользователю, детектируют уровень сигнала, передаваемого TLR. При выполнении бесклеточных анализов связывания часто осуществляют стадию разделения связанных компонентов от несвязанных. Стадия разделения может быть выполнена разными способами. Например, разделение можно произвести в растворе либо, по крайней мере, один из компонентов иммобилизуют на твердом субстрате, от которого можно легко отделить несвязанные компоненты. Твердый субстрат можно изготовить из разных материалов и разной формы, например в качестве субстрата можно использовать титрационный микропланшет, микрошарики, стержень, частицы смолы и т.д. Субстрат предпочтительно выбирают с целью максимального увеличения соотношения сигнал-шум, чтобы прежде всего минимизировать фоновое связывание, а также облегчить разделение и уменьшить затраты.

Разделение можно производить, например, путем удаления шарика или стержня из емкости, сбора или разведения содержимого емкости, такой как лунка титрационного микропланшета, промывания шарика, частицы, хроматографической колонки или фильтра промывочным раствором или растворителем. Стадия разделения предпочтительно включает несколько промывок. Например, когда твердым субстратом является титрационный микропланшет, лунки можно несколько раз промыть промывочным раствором, который обычно включает компоненты инкубируемой смеси, не участвующие в специфическом связывании, такие как соли, буфер, детергент, неспецифический белок и т.д. Когда твердым субстратом является магнитный шарик, такой шарик можно один или несколько раз промыть промывочным раствором и отделить при помощи магнита.

В качестве методов обнаружения можно применять любые известные методы клеточного анализа, такие как измерение индуцированного полипептида внутри клетки, на поверхности клетки или секретированного клеткой. Примеры методов обнаружения при помощи клеточных анализов включают сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), биолюминесценцию, флуоресценцию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), полимеразную реакцию синтеза цепи с обратной транскриптазой (RT-PCR) и тому подобные. Примеры методов обнаружения при помощи бесклеточных анализов включают биолюминесценцию, флуоресценцию, ELISA, RT-PCR и тому подобные.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Реакция клеток РВМС человека на G,U-содержащие олигорибонуклеотиды

У здоровых доноров удаляли мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека, которые культивировали в количестве 3 х 10⁵ клеток/лунку, стимулировали in vitro разными испытуемыми и контрольными иммуностимулирующими веществами в течение 16 часов и затем анализировали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen для секретированных цитокинов IL-12 р40 и TNF-α, в соответствии с инструкциями изготовителя. Кроме того, при выполнении анализа было использовано несколько отрицательных контрольных образцов, включая только среду и только DOTAP (10 мкг/200 мкл-культуральную лунку; "липосомы"). Контрольные иммуностимулирующие агенты включали имидазохинолон R-848 (2 мкг/мл), липополисахарид (LPS, 1 мкг/мл), Pam3Cys (5 мкг/мл), поли-IC (50 мкг/мл) и CpG-содержащую ДНК (50 мкг/мл). Указанные вещества являются репортерными лигандами соответственно для TLR7, TLR4, TLR2, TLR3 и TLR9. Испытуемые иммуностимулирующие агенты включали нижеследующие молекулы РНК в количестве 50 мкг/мл с использованием DOTAP или без него (всего 10 мкг, соответственно "с липосомами" и "без липосом"): только GUGUUUAC, только GUAGGCAC, GUGUUUAC в сочетании с GUAGGCAC, GUAGGA, GAAGGCAC, CUAGGCAC, CUCGGCAC и СССССССС. Указанные олигонуклеотиды РНК имели фосфортиоатную связь между предпоследним и 3'-концевым нуклеозидом.

На фиг. 1 показана реакция клеток РВМС человека на приведенные выше испытуемые и контрольные агенты, измеренная на основании секретированных количеств IL-12 p40 (пг/мл). Как показано на фиг. 1, клетки РВМС реагировали на R-848, LPS, Pam3Cys и поли-IC и не реагировали на используемое отдельно соединение DOTAP. Важное значение имеет то, что РВМС человека секретировали большое количество IL-12 р40 (10-20 нг/мл) под воздействием G,U-содержащих олигонуклеотидов РНК при использовании только GUGUUUAC, только GUAGGCAC, GUGUUUAC в сочетании с GUAGGCAC, CUAGGCAC и CUCGGCAC в сочетании с DOTAP. Важное значение имеет также то, что клетки РВМС человека не секретировали значительных количеств IL-12 р40 под воздействием олигонуклеотидов РНК, не содержащих G и U, GAAGGCAC и СССССССС. Иммуностимулирующее действие молекул G,U-содержащей РНК, по-видимому, значительно усиливалось при введении соединения DOTAP. В данном эксперименте G,U-содержащий 6-мер РНК GUAGGA, по-видимому, оказывал небольшое иммуностимулирующее действие, если такое действие вообще имело место, как при использовании DOTAP, так и без указанного соединения.

На фиг. 2 показана реакция клеток РВМС человека на приведенные выше испытуемые и контрольные агенты, измеренная на основании секретированных количеств TNF-α. Были получены такие же результаты, как и на фиг. 1, то есть клетки РВМС человека секретировали большие количества TNF-α (40-100 нг/мл) под воздействием G,U-содержащих олигонуклеотидов РНК при использовании только GUGUUUAC, только GUAGGCAC, GUGUUUAC в сочетании с GUAGGCAC, CUAGGCAC и CUCGGCAC в сочетании с DOTAP. Аналогично результатам, показанным на фиг. 1, клетки РВМС человека не секретировали значительных количеств TNF-α под воздействием олигонуклеотидов РНК, не содержащих G и U, GAAGGCAC и СССССССС или под воздействием G,U-содержащего 6-мера РНК GUAGGA. Иммуностимулирующее действие молекул G,U-содержащей РНК, по-видимому, значительно усиливалось при введении DOTAP.

Из данного примера следует, что возможно нижеследующее частичное самокомплементарное спаривание оснований, где, как показано, неоднозначные пары оснований G-U соединены точкой и пары оснований G-C и A-U соединены линией:

Пример 2. Реакция клеток РВМС человека на G,U-содержащие олигорибонуклеотиды в зависимости от дозы

Эксперименты, описанные в предыдущем примере, выполняли с использованием разных концентраций олигонуклеотидов РНК, чтобы оценить реакцию клеток РВМС человека в зависимости от дозы на G,U-содержащие олигонуклеотиды РНК по данному изобретению. В общей сложности 10, 3 или 1 мкг РНК добавляли к 10 мкг DOTAP и затем вводили в 200 мкл-культуральные лунки. Через 16 часов IL-12 р40 и TNF-α анализировали методом ELISA, описанным в примере 1.

На фиг. 3 показана реакция РВМС человека в зависимости от дозы на разные РНК, измеренная на основании секретированных количеств IL-12 р40 (нг/мл). Как показано на фиг. 3, клетки РВМС человека секретировали возрастающие количества IL-12 р40 в ответ на увеличивающиеся количества G,U-содержащих олигомеров РНК GUGUUUAC, GUAGGCAC, CUAGGCAC и CUCGGCAC в сочетании с DOTAP. На фиг. 3 также показано, что клетки РВМС человека, по-видимому, не секретировали IL-12 р40 под воздействием олигомеров РНК, не содержащих G и U, GAAGGCAC или СССССССС, используемых в любых испытанных количествах.

Соответствующую реакцию РВМС человека в зависимости от дозы на разные РНК измеряли на основании секретированных количеств TNF-α. Были получены такие же результаты, что и на фиг. 3, то есть клетки РВМС человека секретировали возрастающие количества TNF-α в ответ на увеличивающиеся количества G,U-содержащих олигонуклеотидов РНК при использовании GUGUUUAC, GUAGGCAC, CUAGGCAC и CUCGGCAC в сочетании с DOTAP. Аналогично результатам, показанным на фиг. 3, клетки РВМС человека, по-видимому, не секретировали значительных количеств TNF-α под воздействием олигонуклеотидов РНК, не содержащих G и U, GAAGGCAC и СССССССС, используемых в любых испытанных количествах.

Пример 3. Чувствительность последовательности оснований олигомеров РНК

Точковые мутации выполняли в олигонуклеотиде РНК GUAGGCAC, заменяя остаток А или С в выбранных положениях. Разные олигорибонуклеотиды включали нижеследующие последовательности: GUAGGCAC, GUAGGA, GAAGGCAC, AUAAACAC, AUAGACAC, AUAAGCAC, GUAAACAC, CUAGGCAC, CUCGGCAC и GUGUUUAC. Олигонуклеотиды титровали в клетках РВМС человека, выделенных у здоровых доноров, и культивировали в количестве 3 х 10⁵ клеток/лунку. В общей сложности 10 мкг РНК добавляли к 10 мкг DOTAP и затем вводили в 200 мкл-культуральные лунки. TNF-α человека измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Результаты показаны на фиг. 4.

Пример 4. Влияние DOTAP, оказываемое на реакцию клеток РВМС человека под воздействием разных стимулов

Чтобы далее исследовать влияние DOTAP на иммуностимулирующее действие G,U-содержащих олигомеров РНК, наблюдаемое в предыдущих примерах, клетки РВМС человека, полученные у здоровых доноров, культивировали в количестве 3 х 10⁵ клеток/лунку и стимулировали в присутствии известных лигандов TRL с использованием DOTAP или без него (соответственно "с липосомами" или "без липосом"). Известными исследованными лигандами TLR были общая РНК, полученная из гифы, общая РНК, полученная из дрожжей, общая РНК, полученная из линии промиелоцитов HL-60 (HL60), транскрибированная in vitro рибосомная РНК для Sp6 E. coli, транскрибированная in vitro рибосомная РНК для T7 E. coli, LPS, поли-IC, Pam3Cys и R-848. В качестве отрицательных контрольных образцов использовали только среду и только DOTAP. Кроме того, использовали панель РНК из предыдущих примеров вместе с DOTAP в количестве 10 мкг/мл и без DOTAP.

Общую РНК выделяли из линии промиелоцитов человека HL-60 при помощи тризола (Sigma). До выделения клетки в течение 4 часов обрабатывали 500 мкМ пероксида водорода (Н₂О₂), который вызывает апоптоз клеток указанной линии (HL60 500). Необработанные клетки служили в качестве контрольного образца (HL60 0).

РНК Candida albicans выделяли из дрожжей или гифы (индуцированных в результате 4-часовой инкубации с 10% фетальной телячьей сыворотки). Клетки из 100 мл культуры осаждали центрифугированием, промывали и вновь суспендировали в 10 мл Трис-буфера с EDTA (10 мМ, 1 мМ). РНК выделяли путем экстракции горячим кислым фенолом методами, описанными в публикации Ausubel F.M. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York.

Геномный фрагмент РНК 16S E. coli амплифицировали при помощи затравок 5'-ATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACG-3' (SEQ ID NO:5) и 5'-TAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCC-3' (SEQ ID NO:6), полученных из геномной ДНК Е. coli, и клонировали в вектор pGEM T Easy. Транскрипцию in vitro выполняли, используя РНК-полимеразу Т7 или Sp6. Транскрибированную РНК далее очищали путем экстракции хлороформом/фенолом, осаждали и использовали в количестве 10 мкг.

После инкубации в течение 16 часов выполняли анализ ELISA, как было описано выше, для оценки секреции IL-12 p40 и TNF-α. Типичные результаты показаны на фиг. 5.

На фиг. 5 показано влияние DOTAP на количество IL-12 p40, секретированное клетками РВМС человека, после инкубации с DOTAP и без него. Как показано на фиг.5, нижеследующие стимулы, по-видимому, вызывают повышение иммуностимулирующего действия в присутствии DOTAP по сравнению с его отсутствием: гифы, дрожжи, Sp6 E. coli и Т7 E. coli. Нижеследующие стимулы, по-видимому, вызывают снижение иммуностимулирующего действия в присутствии DOTAP по сравнению с его отсутствием: LPS, поли-IC. Нижеследующие стимулы, по-видимому, вызывают примерно такое же иммуностимулирующее действие как в присутствии, так и в отсутствие DOTAP: HL60, Pam3Cys и R-848.

Пример 5. Иммуностимулирующее действие G,U-содержащих олигомеров РНК в зависимости от вида и MyD88

Нижеследующие клетки мыши выделяли и инкубировали с разными РНК и другими известными лигандами TRL для оценки их специфичности в зависимости от вида, типа клеток и пути передачи сигнала: макрофаги дикого типа в присутствии IFN-γ, макрофаги без МуD88 в присутствии IFN-γ, J774 (линия макрофагов мыши) и RAW 264.7 (линия макрофагов мыши, например, АТСС TIB-71). Макрофаги костного мозга мыши были получены у мышей дикого типа или мышей C57BL/6 без МуD88 путем культивирования клеток костного мозга с 50 нг/мл M-CSF в течение 5 дней. Клетки высевали в количестве 25000 клеток/лунку и обрабатывали 20 нг/мл IFN-γ в течение 16 часов. Линии макрофагов мыши RAW и J774 высевали в количестве 10000 клеток/лунку.

Исследовали нижеследующие испытуемые и контрольные вещества: R-848 (2 мкг/мл), ODN 1668 (CpG-содержащая ДНК: 5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3', SEQ ID NO:7), LPS (1 мкг/мл), поли-IC (50 мкг/мл), Pam3Cys (5 мкг/мл), иономицин/ТРА, нижеследующие молекулы РНК, используемые с ("+ липосомами") и без DOTAP (10 мкг/200 мкл-культуральную лунку): только GUGUUUAC (РНК1), только GUAGGCAC (РНК2), GUGUUUAC в сочетании с GUAGGCAC (РНК1/2), UCCGCAAUGGACGAAAGUCUGACGGA (РНК6; SEQ ID NO:8), GAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUU (РНК9; SEQ ID NO:9), и нижеследующие молекулы ДНК, соответствующие РНК1, РНК2 и РНК1/2: только GTGTTTAC (ДНК1), только GTAGGCAC (ДНК2) и GTGTTTAC в сочетании с GTAGGCAC (ДНК1/2). Указанные олигонуклеотиды РНК и ДНК имеют фосфортиоатную связь между предпоследним и 3'-концевым нуклеозидом. РНК6 и РНК9 имеют также фосфортиоатную связь между предпоследним и 5'-концевым нуклеозидом. РНК6 соответствует стволовой петле рибосомной РНК, выделенной из Listeria monocytogenes. РНК9 соответствует стволовой петле, выделенной из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, РНК-ретровирус). Клетки культивировали в течение 12 часов и собирали супернатанты. IL-12 р40, IL-6 и TNF-α мыши измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты показаны на фиг. 6.

В блоке А на фиг. 6 показано, что макрофаги мыши дикого типа в присутствии IFN-γ секретируют значительные количества IL-12 p40 под воздействием R-848, ODN 1668 (CpG-содержащая ДНК), LPS, поли-IC, Pam3Cys и G,U-содержащих олигомеров РНК GUGUUUAC в сочетании с GUAGGCAC (с DOTAP). В отличие от этого в блоке В на фиг. 6 показано, что макрофаги мыши без MyD88 в присутствии IFN-γ секретируют небольшое количество или вообще не секретируют IL-12 p40 под воздействием любых исследованных испытуемых и контрольных веществ, что указывает на зависимость от МуD88 иммуностимулирующей реакции на данные соединения. Такой результат совместим с участием TLR в возникновении иммуностимулирующей реакции на любые из указанных соединений, включающих, в частности, G,U-содержащие олигонуклеотиды РНК по данному изобретению. В блоках С и D на фиг. 6 показаны реакции линий макрофагов мыши J774 и RAW 264.7, которые, хотя и являются несколько ослабленными, аналогичны реакциям макрофагов мыши дикого типа в присутствии IFN-γ, как показано в блоке А. По существу аналогичные результаты были получены при выполнении параллельных анализов ELISA по измерению IL-6 и TNF-α.

При выполнении дополнительных исследований с использованием клеток МуD88 дикого типа было установлено, что добавление бафиломицина в значительной степени или полностью аннулирует иммуностимулирующее действие олигомеров РНК. Наряду с наличием зависимости от МуD88 указанное наблюдение свидетельствует об участии в возникновении реакции, по крайней мере, одного рецептора TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9.

Пример 6. Применение сложного холестерилового эфира вместо катионного липида

Для исследования возможности использования олигомера РНК, модифицированного сложным холестериловым эфиром, вместо олигомера РНК с катионным липидом был получен олигомер РНК GUGUGUGU с (R 1058) и без (R 1006) в виде 3'-концевой модификации сложным холестериловым эфиром. Два указанных олигомера РНК вместе с DOTAP и без него добавляли в разных концентрациях к культивируемым в течение ночи клеткам РВМС человека. Супернатанты культур собирали и TNF-α, IL-12 p40 и IFN-α человека измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты, полученные в экспериментах с использованием DOTAP, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Модификация сложным холестериловым эфиром вместо использования DOTAPИдентифицирующий номерTNF-α
+DOTAPTNF-α
-DOTAPIFN-α
+DOTAPIFN-α
-DOTAP ЕC50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млR 10062,8400007,822004,55000--R 10580,2750001,030000,538000,51500

Результаты показывают, что R 1058 в результате модификации сложным холестериловым эфиром оказывает более сильное действие, чем R 1006, имеющий такую же последовательность оснований, но без холестерина, как с использованием DOTAP, так и без указанного соединения.

Пример 7. Влияние длины цепи олигомера

Олигомеры РНК GUGUGUGU, GUGUGUG, GUGUGU, GUGUG, GUGU, GUG и GU, используемые с DOTAP или без него, добавляли в разных концентрациях к культивируемым в течение ночи клеткам РВМС человека. Супернатанты культур собирали и TNF-α, IL-12 p40 и IFN-α человека измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты, полученные при выполнении экспериментов с использованием DOTAP, приведены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние длины цепи олигомера РНКИдентифицирующий номерПоследовательностьTNF-αIL-12 p40IFN-α  ЕC50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млR 1006GUGUGUGU2,8400001,670004,55000R 1048GUGUGUG2,2300002,6100004,62700R 1049GUGUGU6,7300002,180004,83400R 1050GUGUG7,6400003,9140006,9400R 1051GUGU-->2014000--R 1052GUG-->2060005,5800R 1053GU-->205000--

Пример 8. Эффект стабилизации межнуклеозидных связей

Олигомеры РНК GUGUGUGU синтезировали с созданием специфических фосфортиоатных и фосфодиэфирных связей, показанных в таблице 3, где "*" означает фосфортиоат и "_" означает фосфодиэфир. Олигомеры РНК вместе с DOTAP или без него добавляли в разных концентрациях к культивируемым в течение ночи клеткам РВМС человека. Супернатанты культур собирали и TNF-α, IL-12 p40 и IFN-α измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты, полученные при выполнении экспериментов с использованием DOTAP, приведены в таблице 3.

Таблица 3
Эффект стабилизации межнуклеозидных связейИдентифицирующий номерПоследовательностьTNF-αIFN-α  ЕC50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млR 1006G*U*G*U*G*U*G*U2,8400004,55000R 1054G*U_G*U*G*U*G*U5,6400006,73700R 1055G*U_G*U_G*U*G*U>2020000--R 1056G*U_G*U_G*U_G*U>2012000--R 1057G_U_G_U_G_U_G_U--0,16000

Аналогичным образом синтезировали 40-мер со всеми фосфодиэфирными связями, способный образовывать структуру со стволовой петлей и имеющий нижеследующую последовательность оснований: 5'-CACACACUGCUUAAGCGCUUGCCUGCUUAAGUAGUGUGUG-3' (R 1041; SEQ ID NO:10), который испытывали с культивируемыми в течение ночи клетками РВМС человека. Было установлено, что данный олигомер РНК обладает очень сильной способностью индуцировать IFN-α при значении ЕС50, равном <0,1 мкМ, и максимальном значении, равном 5000 пг/мл.

Пример 9. Конъюгаты ДНК:РНК

Была получена серия конъюгатов ДНК:РНК, каждый из которых содержал последовательность РНК GUGUGUGU и последовательность поли-dT или поли-dG. Олигомеры имели нижеследующие последовательности, где "*" означает фосфортиоат и "_" означает фосфодиэфир:

Клетки РВМС человека культивировали в течение ночи в присутствии добавленного конъюгата ДНК:РНК с использованием DOTAP или без него. Супернатанты культур собирали и TNF-α, IL-6, IL-12 p40, IP-10 и IFN-α измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты, полученные при выполнении экспериментов с использованием DOTAP, приведены в таблице 4.

Таблица 4
Иммуностимулирующие конъюгаты ДНК:РНКИдентифицирующий номерTNF-αIL-6IP-10 ЕC50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млЕС50, мкМмакс. пг/млR 10604,920000----R 10614,320000>20100001,1180R 10620,3800000,4280000,1400R 10630,3600000,8280000,1250

Пример 10. Транспортная РНК

Клетки РВМС человека культивировали в течение ночи в присутствии разных концентраций (1, 3 и 10 мкг/мл) тРНК, полученной из проростков пшеницы, крупного рогатого скота, дрожжей и E. coli, и вводили в культуральную среду, содержащую и не содержащую DOTAP. Супернатанты культур собирали и TNF-α и IL-12 p40 человека измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. тРНК дрожжей и E. coli и в меньшей степени тРНК крупного рогатого скота индуцировали TNF-α и IL-12 p40 в присутствии DOTAP. Кроме того, тРНК E. coli в концентрации 3 и 10 мкг/мл индуцировала незначительные количества обоих цитокинов даже при отсутствии DOTAP.

Пример 11. РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)

Клетки РВМС человека инкубировали в течение ночи с двумя основными последовательностями с высоким содержанием G и U, а именно 5'-GUAGUGUGUG-3' (SEQ ID NO:2) и 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEQ ID NO:3), соответствующими нуклеотидам 99-108 и 112-123 штамма ВН10 ВИЧ-1, в присутствии DOTAP и без него. Супернатанты культур собирали и IL-12 p40 и TNF-α человека измеряли методом ELISA, используя подобранные пары антител компании BD-Pharmingen, в соответствии с инструкциями изготовителя. Типичные результаты приведены на фиг. 7. На фиг.7 показано, что обе молекулы РНК в микромолярных концентрациях в присутствии DOTAP индуцировали 50-100 нг/мл TNF и 50-200 нг/мл IL-12 p40.

Пример 12. Реакция клеток РВМС человека на фактор реакции, обусловленной недостатком средств

Когда бактерии голодают, у них возникает запрограммированная реакция, именуемая обусловленной недостатком средств реакцией. Указанная реакция включает продуцирование алармонов нуклеиновой кислоты и утрату рибосом. Бактерии, растущие с высокой скоростью, содержат 70000-80000 рибосом, составляющие 50% их сухого веса. При замедлении роста ненужные рибосомы гидролизуются. Существует гипотеза, что быстро растущие клетки в ранней стационарной фазе содержат большие количества олигорибонуклеотидов, которые высвобождаются в среду, когда клетки попадают в окружение с нейтральным показателем рН.

На фиг. 10 показана реакция клеток РВМС человека на фактор обусловленной недостатком средств реакции (SRF). SRF продуцирован быстро растущими бактериями (в данном случае Listeria monocytogenes) в богатой среде до достижения поздней лог-фазы. Бактерии осаждали и вновь суспендировали в равном объеме PBS в течение 24 часов. Смесь центрифугировали для удаления бактерий. Супернатант стерилизовали, пропуская через 0,2 мкм-фильтр. Стерилизованный раствор пропускали через молекулярный фильтр, задерживающий молекулы с М.м. 10 кДа. Указанную фракцию отделяли в колонке С18 и испытывали элюент. При концентрации 5 мкг/мл SRF индуцировал образование TNF в клетках РВМС человека. При обработке SRF любой из трех РНКаз данная активность прекращалась. Указанная активность была присуща только РНК, так как обработанный РНКазой SRF обладал почти фоновой стимулирующей способностью. Индуцированная активность была вызвана РНК.

Пример 13. Реакция клеток РВМС человека на ванадильные комплексы рибонуклеозидов

В процессе исследования SRF было обнаружено, что ингибиторы РНКазы, ванадильные комплексы рибонуклеозидов (RVC), могут стимулировать продуцирование TNF (фиг. 11) и IL-6 клетками РВМС человека.

На фиг. 11 показана реакция клеток РВМС человека на ванадильные комплексы рибонуклеозидов (RVC). В процессе испытания ингибиторов РНКазы весьма неожиданно было обнаружено, что RVC оказывали стимулирующее действие на клетки РВМС человека. 2 мМ RVC индуцировали высвобождение значительного количества TNF. Кроме того, было произведено испытание антивирусного имидазохинолина, резихимода (R-848), обозначенного символом Х, который использовали в количестве 0,1 мкг/мл.

Пример 14. Реакция рецепторов TLR7 и TLR8 человека на рибонуклеозиды

Наблюдения, сделанные в примере 13, могут быть перенесены на клетки 293, генетически восстановленные при помощи TLR7 и TLR8, но не на нетрансфицированные клетки 293 (фиг. 12). При выполнении анализа ванадильных комплексов отдельных рибонуклеозидов весьма неожиданно было установлено, что смесь рибонуклеозидов А, U, C и G или одного рибонуклеозида G при отсутствии ванадата эффективно стимулировала продуцирование TNF клетками РВМС и активацию NF-kB рецепторами TLR7 или TLR8 (фиг. 12).

На фиг. 12 показана реакция рецепторов TLR7 и TLR8 человека на рибонуклеозиды. Установлено, что реакция клеток РВМС человека на РНК или RVC была опосредована TLR7 или TLR8 и что указанная реакция могла быть вызвана только рибонуклеозидами. Клетки 293 человека псевдотрансфицировали или трансфицировали рецепторами TLR7 или TLR8 человека и контролировали реакцию на рибонуклеозиды. Открытые рамки считывания TLR7 человека (hTLR7) и TLR8 человека (hTLR8) амплифицировали при помощи PCR из библиотеки кДНК клеток РВМС человека, используя пары затравок: 5'-CACCTCTCATGCTCTGCTCTCTTC-3' (SEQ ID NO:15) и

5'-GCTAGACCGTTTCCTTGAACACCTG-3' (SEQ ID NO:16) для TLR7 и

5'-CTGCGCTGCTGCAAGTTACGGAATG-3' (SEQ ID NO:17) и

5'-GCGCGAAATCATGACTTAACGTCAG-3' (SEQ ID NO:18) для TLR8.

Информация о последовательности для выбора затравок была получена из банка генов под номерами доступа AF240467 и AF245703. Все фрагменты непроцессированного TLR клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega, Mannheim, Germany), вырезали NotI, клонировали в экспрессирующий вектор pcDNA 3.1(-) (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и секвенировали. Последовательности кодирующей области hTLR7 и hTLR8 соответствуют последовательностям под номерами доступа AF240467 (SEQ ID NO:25) и AF245703 (SEQ ID NO:29).

Для исследования временной активации NF-κB 3 х 10⁶ клеток 293 НЕК (АТСС, VA, USA) электропорировали при 200 В и 960 мкФ 1 мкг TLR-экспрессирующей плазмиды, 20 нг репортерной плазмиды люциферазы NF-κB и 14 мкг плазмиды pcDNA 3.1(-), используемой в качестве носителя, в 400 мкл среды RPMI, содержащей 25% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Клетки высевали в количестве 10⁵ клеток/лунку, культивировали в течение ночи и затем в течение 7 часов культуру стимулировали R-848 (обозначен на фиг. 12 символом Х, коммерчески синтезирован компанией GLSynthesis Inc., Worcester, MA, USA), RVC или рибонуклеозидами. Стимулированные клетки лизировали, используя буфер для лизиса репортерной плазмиды (Promega, Mannheim, Germany), и лизат анализировали в отношении активности люциферазы при помощи люминометра Бертхолда (Wildbad, Germany).

Как показано на фиг. 12, трансфектанты TLR7 реагировали на R-848, RVC, смесь рибонуклеозидов (А, G, C, U при 0,5 мМ) и гуанозин рибонуклеозида. Для TLR8 была характерна аналогичная реакция.

Пример 15. Реакция рецепторов TLR7 и TLR8 на смеси двух рибонуклеозидов

На фиг. 13 показана реакция рецепторов TLR7 и TLR8 на смеси двух рибонуклеозидов. В эксперименте, выполненном аналогично показанному на фиг. 11, было установлено, что TLR8 лучше всего реагирует на комбинацию рибонуклеозидов G и U, при этом TLR7 лучше всего реагирует отдельно на G. Кроме того, обнаружено, что незначительную реакцию вызывала комбинация С и U. Указанные данные показывают, что рибонуклеозиды соответствующего состава служат в качестве лигандов для TLR7 и TLR8. Неспецифический стимул ТРА служил только в качестве контрольного стимула. Х означает R-848.

Пример 16. Реакция клеток РВМС человека на смесь рибонуклеозидов G и U

На фиг. 14 показана реакция клеток РВМС человека на смесь рибонуклеозидов G и U. Очевидно, что рибонуклеозиды G и U оказывают синергичное действие, индуцируя образование TNF клетками РВМС человека. В данном примере оптимальным было соотношение G:U, равное 1:10.

Пример 17. Реакция клеток РВМС человека на олигорибонуклеотиды с высоким содержанием G и U

На фиг. 15 показано, каким образом клетки РВМС человека реагируют на олигонуклеотиды РНК с высоким содержанием G и U. Олигонуклеотиды РНК и ДНК с последовательностью 5'-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3' (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:19) испытывали в количестве 30 мкМ с использованием клеток РВМС человека и контролировали продуцирование TNF. Клетки РВМС человека реагировали на олигонуклеотиды РНК с высоким содержанием G и U и не реагировали на олигонуклеотиды ДНК с высоким содержанием G и U.

Пример 18. Реакция клеток РВМС человека на окисленную РНК

На фиг. 16 показана реакция клеток РВМС человека на окисленную РНК. Рибосомную РНК 16S выделяли из E. coli и подвергали химическому окислению. Обработку (модификация А) производили 0,2 мМ аскорбиновой кислоты с 0,2 мМ CuCl₂ в течение 30 минут при 37°С или (модификация В) 0,2 мМ аскорбиновой кислоты с 0,02 мМ CuCl₂ в течение 30 минут при 37°С. Указанная обработка вызывает окисление гуанозина в положении 8 и индуцирует разрывы цепи у 3'-конца модифицированного гуанозина. Показано, что рибосомная РНК индуцировала продуцирование TNF клетками РВМС человека. Кроме того, очевидно, что окисление рибосомной РНК значительно усиливает реакцию.

Пример 19. Реакции рецептора TLR7 человека на окисленный гуанозинрибонуклеозид

На фиг. 17 показана реакция TLR7 и TLR8 на окисленный гуанозинрибонуклеозид. Клетки, которые псевдотрансфицировали или трансфицировали TLR7 или TLR8 человека аналогично примеру 14, испытывали в отношении реакции на 7-аллил-8-оксогуанозин (локсорибин) в количестве 1 мМ. Совершенно точно установлено, что TLR7 человека реагирует на 7-аллил-8-оксогуанозин. Таким образом, очевидно, что лигандом для TLR7 являются окисленные нуклеиновые кислоты.

Пример 20. Реакции рецептора TLR7 человека на другие модифицированные гуанозинрибонуклеозиды

На фиг. 18 показаны реакции TLR7 человека на другой модифицированный гуанозинрибонуклеозид. Клетки, трансфицированные TLR7 человека аналогично примеру 14, испытывали в отношении реакции на 7-аллил-8-оксогуанозин (локсорибин) в зависимости от дозы. Кроме того, испытывали другие модифицированные гуанозины. Совершенно точно установлено, что TLR7 человека реагирует на 7-аллил-8-оксогуанозин в зависимости от дозы. Как было показано выше, TLR7 человека реагирует на гуанозин; однако на фиг. 18 также показано, что TLR7 человека слабо реагирует на дезоксиформу гуанозина, а также на 8-бромгуанозин.

Пример 21. Распределение рецепторов TLR человека

На фиг. 19 показано распределение рецепторов TLR1-TLR9 человека. Разные очищенные иммунные клетки человека исследовали в отношении экспрессии рецепторов TLR1-TLR9 при помощи PCR. Установлено, что лимфоидные CD123+ дендритные клетки (DC) человека положительно реагируют на TLR9 и TLR7 и слабее реагируют на TLR8. Однако обратный результат был получен для миелоидных CD11c+ дендритных клеток. Такой результат является весьма обоснованным, так как дендритные клетки двух типов выполняют совершенно разные функции в иммунной системе. На фиг. 19 также показано, что нейтрофилы человека положительно реагируют на TLR8 человека, очень слабо реагируют на TLR9 и не реагируют на TLR7. Такой результат также является обоснованным, так как нейтрофилы очень часто являются первыми клетками, которые соприкасаются с инфекционными патогенами и, как считается, инициируют реакции.

Пример 22

Клетки НЕК-293 устойчиво трансфицировали рецепторами TLR7 или TLR8 человека. Кроме того, указанные клетки устойчиво трансфицировали репортерной конструкцией NF-κВ-люциферазы. Клетки титровали разными количествами олигонуклеотидов РНК и культивировали в течение 16 часов. Активность люциферазы измеряли стандартными методами и нормализовали относительно псевдостимулированных трансфектантов. Активность люциферазы, измеренную для псевдостимулированного трансфектанта, задавали в качестве значения, соответствующего однократной индукции NF-κВ. Результаты показаны на фиг. 20, где старая кривая для NF-κВ, индуцированного стимулирующим олигонуклеотидом РНК, построена в зависимости от концентрации испытуемого рибонуклеотида. Результат стимуляции GUGUGUGU показан для TLR8 человека. Результат стимуляции GUAGUCAC показан для TLR7 и TLR8 человека.

Эквиваленты

Приведенное выше описание изобретения считается достаточным для осуществления настоящего изобретения специалистом в данной области. Настоящее изобретение не ограничивается приведенными примерами, так как указанные примеры приведены в качестве иллюстрации только одного варианта осуществления изобретения, в то время как в объем изобретения входят другие функционально эквивалентные варианты осуществления изобретения. Специалистам в данной области должны быть очевидны разные модификации изобретения помимо рассмотренных в данном описании изобретения, которые входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все преимущества и объекты данного изобретения необязательно рассмотрены в каждом варианте осуществления изобретения.

Все справочные материалы, патенты и публикации патентов, приведенные в описании изобретения, полностью включены в данную заявку в качестве ссылки.

Изобретение относится к композициям, содержащим иммуностимулирующие олигомеры РНК, и способам их применения. Заявленные молекулы иммуностимулирующей РНК с длиной цепи 5-40 нуклеотидов и включающие по крайней мере один гуанин и по крайней мере один урацил, обладают иммуностимулирующими свойствами и являются естественными лигандами одного или нескольких Toll-подобных рецепторов, включающих Toll-подобный рецептор 7 (TLR7) и Toll-подобный рецептор 8 (TLR8). Указанные композиции и способы обеспечивают стимуляцию активации иммунного ответа. 21 н. и 99 з.п. ф-лы, 24 ил., 4 табл.

1. Иммуностимулирующая композиция, включающая выделенный олигомер РНК с длиной цепи 5-40 нуклеотидов, имеющий последовательность оснований, включающую по крайней мере один гуанин (G) и по крайней мере один урацил (U), где указанный олигомер участвует в TLR пути и, необязательно, катионный липид.2. Композиция по п.1, в которой выделенный олигомер РНК является РНК с высоким содержанием G и U.3. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-RURGY-3', где R означает пурин, U означает урацил, G означает гуанин и Y означает пиримидин.4. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUAGU-3', где А означает аденин.5. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUAGUGU-3'.6. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUUGB-3', где В означает U, G или С, где С означает цитозин.7. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUGOG-3'.8. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUGUUUAC-3'.9. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-GUAGGCAC-3'.10. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований включает 5'-CUAGGCAC-3'.11. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований содержит 5'-CUCGGCAC-3'.12. Композиция по п.1, в которой цепь олигомера состоит из 5-12 нуклеотидов.13. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований не содержит динуклеотид CpG.14. Композиция по п.1, в которой последовательность оснований по крайней мере на 50% является самокомплементарной.15. Композиция по п.1, в которой олигомер состоит из множества олигомеров.16. Композиция по п.15, в которой множество олигомеров включает олигомер с первой последовательностью оснований, и олигомер со второй последовательностью оснований, причем первая последовательность оснований и вторая последовательность оснований комплементарны по крайней мере на 50%.17. Композиция по п.15, в которой множество олигомеров включает олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUGUUUAC-3', и олигомер с последовательностью оснований, включающей 5'-GUAGGCAC-3'.18. Композиция по п.1, в которой олигомер содержит неприродную связь в остове.19. Композиция по п.18, в которой неприродная связь в остове является фосфортиоатной связью.20. Композиция по п.1, в которой олигомер включает модифицированное основание, выбранное из группы, включающей 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 5-метилурацил и псевдоурацил.21. Композиция по п.1, в которой олигомер включает модифицированный сахар.22. Композиция по п.1, в которой катионный липид является метилсульфатом N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP).23. Композиция по п.1, которая дополнительно включает антиген.24. Композиция по п.23, в которой антиген является аллергеном.25. Композиция по п.23, в которой антиген является раковым антигеном.26. Композиция по п.23, в которой антиген является микробным антигеном.27. Композиция по п.1, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.28. Способ активации иммунной клетки, который предусматривает приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством композиции по любому из пп.1-27 для индукции активации иммунной клетки.29. Способ по п.28, в котором активация иммунной клетки предусматривает секрецию цитокина или хемокина иммунной клеткой.30. Способ по п.29, в котором цитокин выбран из группы, включающей интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерферон (IFN) и фактор некроза опухоли (TNF).31. Способ по п.29, в котором хемокин является белком 10, индуцируемым гамма-интерфероном, (IP-10).32. Способ по п.28, в котором активация иммунной клетки предусматривает активацию МyD88-зависимого пути трансдукции сигнала.33. Способ по п.32, в котором MyD88-зависимый путь трансдукции сигнала ассоциирован с Toll-подобным рецептором (TLR).34. Способ по п.33, в котором TLR является TLR8.35. Способ по п.33, в котором TLR является TLR7.36. Способ индукции иммунного ответа у больного, который предусматривает:

введение больному композиции по любому из пп.1-27 в эффективном количестве для индукции иммунного ответа у указанного больного.

Приоритет от 04.04.2002 по пп.48-120. Приоритет от 29.10.2002 по пп.1-47.