Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лечении инфекционных заболеваний.
К числу новейших продуктов, которые могут сыграть решающую роль в борьбе с инфекционными и раковыми заболеваниями, относятся так называемые имму- номодуляторы такие, как интерфероны, интерлекины и факто.р некроза опухоли. Они представляют собой белкосодержащие лекарственные средства, которые способны активизировать естественные защитные силы организма.
Цель изобретения - повышение естественных противовирусных реакций и укрепление иммунной системы в локализованных отделах организма человека.
Способ осуществляется следующим, образом.
РНК с двойной нитью, особенно рибонуклеиновые кислоты с неправильным связыванием, восстанавливают нормальную кинетику рибонуклеазы L и продуктов разложения. Более того, скорость восстановления нормального состояния с помощью двуниточной РНК может быть ускорена посредством предварительного воздействия лимфокинами.
Двуниточные РНК представляют собой синтетические полинуклеотидные комплексы, включающие по две парные нити, Под двуниточной РНК с неправильным связыванием подразумеваются такие кислоты, в которых водородные связи (упаковка оснований) между парными нитями являются сравнительно неповрежденными, т.е. прерывание имеет место в среднем в одной паре оснований на каждые 29 последующих групп. Неправильное связывание есть нарушение нормальной геометрической конфигурации двойной спирали РНК за счет провисания нитей внутрь (или наружу). Эти участки представляют собой точки повышенной чувствительности двуниточной РНК к биологической обработке рибонуклеаза- ми. Следует правильно понимать термин
сл
с
оо
СО
N
О
о со
Сд
двуниточная РНК с неправильным связыанием.
Двуниточная РНК может представлять обой комплекс полиинозинатз (поли 1) и олицитидилата (поли С), содержащий рациловые (У) или гуанидиновые (G) осования в определенных соотношениях, например, от 1:5 до 1:30 таких оснований
ПОЛИ I С4-29Х V ИЛИ G).
Двуниточная РНК может иметь общую фор-.
улу Г|п (Cl 1-14 /)пИЛИГ|п (С12 V)n.
Значение п меняется от 4 до 29. Другие подходящие примеры двуниточной РНК рассматриваются далее,
Основу двуниточной РНК с неправильным связыванием, использование которых является предпочтительным в соответствии с предлагаемым изобретением, составляют сополинуклеотиды, выбираемые из поли (Cn, G), где п - множитель, принимающий значения от 4 до 29. Эти РНК являются аналогами комплексов из полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образующимися путем модификации rln Cn в целях внедрения непарных оснований (урацило- вых или гуанидиновых) вдоль полирибоци- тидилатной нити (гСп). Альтернативным способом получения двуниточной РНК является модификация основной рибосильной нити полирибоиноциновой кислоты (г1п), например, за счет включения 2-0-метилрибо- сильных групп. Эти аналоги соединения rln г Cn, имеющие неправильное связывание, являются предпочтительными. Те из них, которые отвечают формулам г1п г(Сп- 14, V)n и rln г(Саэ, G)n, описаны Картером и Т оу в патентах США Ns 4130641 и № 4024222, упоминаемых здесь в форме ссылок на источник. Описанные в этих патентах двуниточные РНК, вообще говоря, пригодны для использования в соответствии с предлагаемым изобретением.
В предпочтительной модификации РНК с неправильным связыванием формулы rln(Ci2,V)n область, включающая непрерывный участок из 6-12 пар оснований, т.е. длиной от половины до полного витка спирали РНК, служит в качестве биотриггера, вызывающего выделение лимфокинов и в качестве внеклеточного софактрра ферментов, участвующих ва естественных противовирусных реакциях. -Области неправильного связывания, состоящие из урацильных групп, внедрены с определенной периодичностью в полипиримидйновую цепочку для ускорения гидролиза РНК и устранения таким образом токсичности.
Другими примерами возможных модификаций двуниточных РНК с неправильным
связыванием, пригодных для использования в соответствии с предлагаемым изобретением, являются:
поли (I), поли (, V) поли (I), поли (Ст, V)
поли (I), поли (Ci3, V)
поли (I), поли (С22. V)
поли (I), поли (С20, G)
ПОЛИ (I), ПОЛИ (С29, G)
поли (I), поли (Ср/23 С р)
Обычно вводимые дозы двуниточной РНК составляют 0,1-1000 мкг на 1 мл жидкости в теле пациента. Термин изолированная жидкость тела относится к раствору
сывороточной жидкости, солей, витаминов и т.п., который циркулирует в организме, омывая ткани. Объем жидкости в теле пациента определяются по имеющимся медицинским таблицам, которые содержат
сведения о взаимосвязи веса реципиента с
объемом содержащейся в его или ее теле жидкости. Эта величинаа представляет собой суммарный объем содержащейся в теле пациента жидкости, который и является тем
объемом, который используют для установления необходимого для сохранения равновесия количества РНК с двойной нитью. Например, в теле пациента весом 60 или 70 кг содержится примерно 5-6 л жидкости.
При использовании обоих агентов (двуниточная РНК и лимфокин) их можно вводить в виде смеси, раздельно, но одновременно или раздельно в определенной последовательности.
К введению двуниточной РНК и лимфокина в комбинации относятся случаи, когда агенты вводятся вместе в виде терапевтической смеси, а также те процедуры, при которых два агента вводят раздельно, но
одновременно, например, одному и тому же пациенту по разным внутривенным путям. Способ введения в комбинации также включает раздельное введение лекарств, при котором сначала вводят одно, а спустя
короткий промежуток времени - другое ле- карственное средство.
П р и м ер 1. Вводят образцы двуниточной РНК с неправильным связыванием, представлявшей собой двуниточную РНК с
неправильным связыванием общей формулы rln r(Ci2, V)n в количестве 20-1000 г еженедельно группе лиц весом 40-70 кг и проводил анализ их сывороточных жидкостей, в частности, влагалищных секреций и
мужского эякулята на присутствие в них индуцированных двуниточных РНК защитных медиаторов реципиента. В ходе групповых клинических испытаний изучались аналогичные параметры на индивидах, которым было проведено вливание их интерферонов
или интерлейкинов, с целью выявления специфики процессов, если это имело место. С помощью световой микроскопии было установлено, что жидкость, взятая у пациентов, которым были сделаны вливания, содержали различные клетки, в т.ч. мононуклеарные, клетки сквомозного эпителия (образцы из жестких половых органов) и сперматозоиды (мужская семенная жидкость), а также аморфную массу клеточных остатков. В нижерасположенной таблице приводятся обобщенные результаты наблюдений за тремя пациентами при лечении их с помощью двуниточных РНК с неправильным связыванием в течение различных периодов времени.
В случае пациентов А и В отмечены высокие титры вируса иммунодефицита человека (HLV-III) из эякулятов. Измерения проводили при объеме эякулятов 2,0-4,0 см с помощью сокультуры. Для этого брали мононуклеарные клетки крови обычного донора, который подвергался стимуляции с помощью фиттогемагглютинина в течени 2- 4 дней, и выращивали культуру в течение 28 дней, а затем проводил измерения на присутствие внеклеточного вируса, методом иммуносорбентного анализа с. ферментной меткой. Титр сокультуры определяли по средней оптической плотности (оптическая плотность при 490 нм) образца для иммуносорбентного анализа после вычитания отрицательного контрольного значения (менее 0,1). У пациента С отмечено хроническое проявление вируса простого герпеса во влагалищных секрециях, связанных с формированием периональной визикулы. Вирус простого герпеса культивировали по способу Раппа с использованием конфлуентных клеток HEL, репродуцированных в питательных слоях чашки Петри толщиной 33 мм.. Анализ образцов жидкости пациента с помощью жидкостной хромотографии при высоком давлении после системного введе- ни я двуниточной РНК показывает, что произошло увеличение количества защитных медиаторов реципиента. Влагалищные и семенные жидкости пациентов анализировали на наличие различных компонентов естественной (21 - 5 - олиго А/рибонуклеаза А) противовирусной реакции в соответствии с ранее описанным мною применительно к периферическим мононуклеарным .клеткам крови.
Для оценки специфичности процесса проводили исследования на подобных пациентах (или животных), котрые проходили лечение высокими дозами (10 млн. IRV/d/) различных интерферонов и йнтерлекинов..
Однако в этих случаях не удалось обнаружить увеличения количества участвующих в борьбе с болезнью медиаторов в изолированных жидкостях. При комбинированном 5 системном введении лимфокинов и двуниточной РНК с неправильным связыванием скорость выявления медиаторов в этих изолированных жидкостях значительно возросла. Жидкостная хроматография при высоком
10 давлении в сочетании с методами радиационного связывания и радиоимунного анализа репродуцированной РНК подтвердила такую специфическую особенность, как выработка во всех частях тела нового 2 -5 -оли15 гоаденилата в результате применения двуниточной РНК, причем в количествах, достаточных для защиты организма от болезни.
Идентификацию методом жидкостной
0 хромотографии при высоком давлении проводили после подготовки образца с использованием трихлоруксусной кислоты и ацетонового осаждения. Использовали аналитическую колонку Уотерса Cie микрон
5 Бондапак, при этом создавали градиенты метанола и воды в буферном растворе из фосфагата аммония (50 мл) при рН 7.0. Тест, проводившийся с помощью метода жидкостной хромотографии, соответствует стан0 дартной калибровке с аутентичными РзАз и РзА4, которые были синтезированы ферментативным путем. На графике резко выделяются те пики, которые появились при проведении жидкостной хромотографии в
5 соответствии с данной схемой через 6,8- 7,0 мин или через 12 мин, поскольку именно они указывают на наиболее активные медиаторы, в частности соответствующие аутентичным РзАз и РзАз, являющихся соот0 ветственно тримером и тетрамером 2-5 олигоаденилатных медиаторов.
Обнаруживается, что механизм, обусловивший эти явления в локализованных отделах организма, включает, по крайней мере,
5 частично сигнальный трансдуктивный процесс, входе которого двуниточная РНК действует на окружение клеток или стенки расположенного вблизи кровеносного сосуда, вызывая волнообразный процесс вклю0 чения формирования медиаторов в самой локализованной секции.
Изобретатель установил, что уникальная структура двуниточной РНК с неправильным связыванием является наиболее
5 благоприятной для практического использования в качестве объекта изобретения. Это обусловылено тем фактом, что неправильное связывание в РНК с двумя нитями приводит к образованию слабых областей в относительно стабильном в остальной части
комплексе. Результатом этого является то, что маленькие биоактивные фрагменты двуниточной РНК, будучи более мобильными, получают доступ к специализированным отделам организма, обуславливая проявление в них локального высокоспецифичного им- муномодуляторного и противовирусного эффекта. Опыт свидетельствует о том, что получение доступа к другим изолированным отделам не является свойством большинства экзогенно применяемых двуниточных РНК.
С целью подтверждения предположения о том, что новые молекулярные разновидности двуниточной РНК, образующиеся в процессе биоразложения, способствуют созданию требующегося высокого уровня медиаторов естественной защитной системы (например, системы 2 -5 А) в различных биологических жидкостях (жидкости в теле пациента), проводили эксперименты как в лабораторных условиях, так и на живом организме. , А. Сравнение разложения поли I, поли С и двуниточной РНК с неправильным связыванием под действием нуклеазы.
Чувствительность двуниточных РНК к гидролизу нуклеазной изучалась с помощью радиоактивных поли I, поли С и двуниточных РНК с неправильным связыванием. По- лиинозиновая кислота (8- С) (спектральная активность 3,6 мк кюри (мкмоль) была куплена у фирмы Р-Брокемикалз, Эта маркированная полиинрзиновая кислота имела более 1000 оснований по длине молекулы. Полиинозиновую кислоту (8- С) смешивали с немаркированными поли , поли С или двуниточной РНК с неправильным связыванием, смесь подвергали тепловой денатурации и реданатурации с получением радиоактивных двуниточных РНК.
В первоначальных исследованиях определяли расщепление нуклеазой Si (Е. С.3.1.30. 1). Нуклеаза Si расщепляет нуклеиновые кислоты с одной нитью, оставляя сдвоенные области неповрежденными. Рас щепление с помощью нуклеазы Si поли I, поли С имело монофазнывй кинетический механизм, при этом скорость генерирования двуниточной РНКтрихлоруксусной кислоты достигала 1,4% в минуту. После тепловой денатурации скорость гидролиза увеличивалась до 1,8% в минуту.
Аналогичные эксперименты с использованием маркированных двуниточных РНК с неправильным связыванием продемонстрировали, что в этом случае кинетический мэ- ханизм был бифазным. Исходная двуниточная РНК с-неправильным связыванием имели быстро разлагающийся компонент (3,2% в минуту), за разложением которого следовала фаза расщепления боле медленно разлагающегося компонента (0,5% в минуту). Денатурированная двуниточная
РНК с неправильным связыванием разлагалась сравнительно быстро (4,5% в минуту). Степень общего разложения исходных поли I. поли Си двуниточной РНК с неправильным связыванием спустя 45 мин, после
начала эксперимента была примерно одинаковой. Как сообщалось ранее, скорость гидролиза двуниточной РНК с неправильным связванием изначально была больше, чем поли I. поли С. Однако двухфазный кинетический механизм расщепления двуниточной РНК с неправильным связыванием свидетельствует о явном физическом различии между этими материалом и хорошо фиксированными (полностью спаренными по
основаниям) молекулами поли I, поли С. Результаты указывают на наличие существенного отличия во вторичной и третичной структурах, которое приводит к неодинаковой чувствительности этих двуниточных
РНК к нуклеазе и обуславливает получение неожиданных биологических результатов, описанных в предлагаемой патентной заявке. Кроме того, значительное, т.е. шестикратное уменьшение скорости гидролиза
компонентов определенной двуниточной РНК во второй фазе по сравнению с первой и сравнительно слабый гидролиз медленно расщепляющегося компонента указывают на то, что в двуниточных РНК этого типа
существует ядро, обладающее относительной стойкостью по отношению к нуклеазе. Это не имеет места в случае поли I, поли С. Разложение двуниточной РНК с неправильным связыванием под действием нуклеазы проводили с использованием стандартной тканевой питательной среды. (RPMI 1640), дополненной дезактивированной теплом сывороточной жидкостью эмб- .риона теленка или человека в количестве
10%. Эта.сывороточная жидкость является
источником рибонуклеаз. Разложение двуниточной РНК с неправильным связыванием в этой среде происходило быстро, примерно 40% этой двуниточной РНК дало
растворимую трихлоруксусную кислоту в течение 3 мин. При дальнейшем расщеплении в течение почти двух часов не отмечалось дополнительной деградации в значительной степени. Серийное разбавление среды
после трехминутной инкубации вс присутствии двухниточной РНК с неправильным свя- зыванием снова продемонстрировало высокую степень разложения - примерно 50% при разбавлении 1:16, которая не возрастала при использовании более концентрировэнной сывороточной жидкости. Поскольку количество осаждаемого трехук- сусной кислотой материала остается относительно постоянным в течение длительных периодов времени и при различных степенях разбавления, то пролонгированная стабильность осаждаемого трехуксус- ной кислотой материала, вероятно, не связана с его преимущественной деградацией. Эти результаты также подтверждают .наличие в молекуле двуниточной РНК с неправильным связыванием ядра резистент- ности по отношению к нуклеазе.
Б. Молекулярный вес резистентного по отношению к нуклеазе ядра двуниточной РНК с неправильным связыванием.
Молекулярный вес определяли путем установления коэффициентов седиментации. Необработанные образцы двуниточной РНК анализировали в ультрацентрифуге Бекмэн модел Е при скорости 48000 оборотов в минуту и 20°С. Коэффициенты седиментации рассчитывали по пяти точкам,при интервале в 8 мин. Образцы двуниточной РНК разбавляли гак, чтобы оптическая плотность (OD26o) e буферном растворе А/0.15 молей NaCI 0,01 моль фосфата натрия, 0,001 мольМдС а рН 7,2/ достигала 0,63. Образцы двуниточной РНК, обработанные нуклеазой Si, анализировали при скорости 52000 оборотов в минуту, 20°С в буферном растворе с OD260 0,65. Коэффициенты седиментации рассчитывали методом полувысот и второго момента.
Коэффициенты седиментации, двуниточной РНК, определенные методом полувысот и второго момента, составляли соответственно 12,74 и 13,29. После гидролиза в присутствии нуклеазы Si коэффициенты седиментации двуниточной РНК, определявшиеся методом полувысот, снизились до 6,18, а полученные методом второго моменте, уменьшились до 7,21. Эти данные показывают, то при обработке нук- лазрй Si двуниточная РНК с неправильным связыванием расщепляется на низкомолекулярные фрагменты.
С. Биологическая активность резистентного по отношению к нуклеазе ядра двуниточной РНК.Биологическая активность расщепленной нуклеазой двунитотчной РНК испытывалась с помощью стандартного анализа на выявление замедления роста культуры опухолевой ткани. Двуниточную РНК инкубировали с нуклеазой Si в течение 120 мин, а затем использовали для ингибирования роста культуры клеток человеческой фибро- сэркомы НТ 1080 С14. Через 72 ч обработки двуниточной РНК с неправильным связыванием, расщепленной нуклеазой, в количестве 50 мкг/мл отмечался определенный рост необработанных контрольных клеток. Замедление роста клеток необработанной 5 двуниточной РНК составляло примерно 50%. Аналогичное замедление наблюдалось и в случае использования двуниточной РНК с неправильным связыванием, обработанной нуклеазой Si. причем вне заяисимо10 сти от степени обработки нуклеазой Si. Тепловая денатурация в сочетании с обработкой нуклеазой Si приводила к исчезновению антипролиферативного влияния двуниточной РНК с неправильным связыва15 ниемГ
Эти результаты указывают на то, что антипролиферативная активность двуниточной РНК с неправильным .связыванием сохраняется даже при длительной обработ0 ке нуклеазой. В связи с тем, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро формируется в этой системе в первые 15-20 мин расщепления, то в последующие моменты времени торможение роста указыва5 ет на сохранение антипрофилеративной активности в резистентном по отношению к нуклеазе ядре двуниточной РНК. Это, в свою очередь, может являться причиной удивительно интенсивной выработки биоло0 гически активных медиаторов в различных отделах организма,
С целью дальнейшего изучения биологической активности резистентного по шению к нуклеазе ядра, проводили
5 расщепление двуниточной РНК с помощью нуклеазы Si в течение 60 мин. Аликвоту этого материала затем подвергали осаждению метанолом с целью удаления низкомолекулярных продуктов расщепления, которые не
0 могут быть осаждены с помощью такой процедуры. Для определения биологической активности культуру клеток глиомы человека линии А 1235 обрабатывали нерасщеппен- ной двуниточной РНК в количестве 200
5 ммкг/мл, рэсщепленннойнуклеа,зой и осажденной этанолом двуниточной РНК и расщепленным нуклеаэой Si Амплигеном. Через 72 часа в культуре клеток линии А 1235 торможение в случае Амплигена составило 99,8%. при
0 использовании обработанного нуклеазой Si Амплигена - 78,4%, а для Амплигена.обрабо- танного нуклеазой и осажденного этанолом - 84,4%. Таким образом,, антипролиферативная активность двуниточной РНК сохранялась при
5 различных видах обработки.
Оценивали также способность этих пре- паратов индуцировать 2-5А синтетазу {АТФ:(2. 51 - олиго (А) аденилил-трансфера- за) (ЕС 2.7.7.19) в этих клетках линии А 1235. Осадок клеток после центрифугирования
промывали фосфатно-солевым раство- ром,ресуспендировали в 5 мл растворяющего буферного раствора (20 миллимолей Трис, рН 7,5; 0,1 миллимолей этилендиа- минтетрауксусной кислоты, 0.25 моля сахарозы, 50 миллимолей KCI 2 миллимоля MgCte и 1 милливоль DTT) и выдерживали на льду в течение 5 мин. После двукратного промывания фосфатносолевым буферным раствором осадки клеток ресуспендировали в 0,1 мл буферного раствора В (20 миллимолей HEPES, рН 7,5; 5 миллимолей MgCb. 120 миллимолей DTT и 10% глицерина), содержащего 0,5% Monldet - Р40, и выдерживали на льду для растворения клеток. Цитоплазменные экстракты получали центрифугированием в течение 6 мин (8000 г) и хранили в виде 50-миллилитровых аликвот при-70°С.
2-5А синтетазу анализировали в соответствии с описанным методом (Оухадоль- ник и др., Biochemistry 22: 4153, 1983). Оттаявший экстракт (эквивалент 25 мг белка) смешивали с 30 мл упакованной поли (rl). поли (гС) - агарозой и инкубировали при 25°С в течение 20 мин. Несвязанный белок удаляли двукратным промыванием в 0,4 мл буферного раствора В. Ферментативный синтез 2-5-олигоаденилатов (2-5А) инициировали добавлением 10 мл буферного раствора В, содержащего 2,5 миллимоля ( р) аденазин - 5 - трифосфата (0,12 Кюри) мил- лимоль), 2,5 миллимоля DTT, 3 единицы (мл креатиновой фосфокиназы и 10 молей креа- тинового фосфата). После 20-часовой инкубации при 30°С агарозу отделяли центрифугированием (3 мин., 8000 г, 25°С). Смесь олигомеров 2-5А во всплывшем отстое анализировали в колонке для диэтила- миноэтилцеллюлозной хромотографии в соответствии с описанием Доетша и др. (Nature:291:355, 1981). Образование продукта устанавливали по величине изменения радиоактивности при замещении материала в колонке для д иэтиламиноэтил- целлюлозной хроматографии буферным раствором, содержащим 0,35 моля KGI, деленнойна общую величину полученной радиоактивности.
Синтез 2-5А олигомеров путем инкубирования с освобождением из клеток экстрактом двуниточной РНК, обработанным нуклеазой. после осаждения, показал, что переход аденазин - 5 -трифосфата в 2-5А олигомер зависит от времени. Получено несколько удивительных результатов. Во-первых, через 18 часов инкубации освобожденных от клеток экстрактов с необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием удельная активность 2-5А синтетазы
составила 41,5. Во-вторых, после обработки нуклеазой Si было отмечено заметное увеличение конверсии аденозин-5 -трифосфата в 2-5А синтетазу. Например, после 18 часов
инкубации удельная активность достигала 284, что почти в 7 раз больше, чем в случаев необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием. В-третьих, при использовании двуниточной РНК, обработайной нуклеазой Si после осаждения, максимальный выход синтетазы 2-5А наблюдался после 12-часовой инкубации. Эти данные показывают, что ферментативный синтез тримеров, тетрамеров и более сложных олигомеров 2-5А значительно увеличивается после обработки двуниточной РНК с неправильным соединением нуклеазой Si. Позитивная связь увеличения ферментной активности с уменьшением размеров двуниточной РНК является свидетельством того, что здесь может иметь место взаимодействие с аллостериновым модификатором, т.е. частично расщепленной двуниточной РНКс неправильным соединением, которое
может приводить к его связыванию и улучшению активации синтетазы 2-5А по сравнению со случаем необработанной двуниточной РНК с неправильным связыванием. Терапевтическое значение таких наблюдений является очевидным. В тех случаях, когда низкомолекулярные продукты разложения обработанной нуклеазой Si, двуни- тотчной РНК с неправильным связыванием удаляли путем осаждения, максимально высокий синтез 2-5А синтетазы наблюдали после 12 часов инкубации. Максимально активное формирование синтетазы 2-5А при использовании двуниточной РНК, обработанной нуклеазой Si после осаждения указывает на то, что резистентное по отношению к нуклеазе ядро может активизировать 2-5А синтетазу точно так же, как это происходит при активации с помощью двуниточной РНК с неправильным связыванием, обработанной нуклеазой после 18-часовой инкубации.
Эти данные подтверждают наличие в двуниточной РНКс неправильным связыванием биологически активных фрагментов и
. служат объяснением физической основы терапевтической активности этих фрагментов в биологической жидкости. Эти данные же свидетельствуют о том, что биологическая активность этих фрагментов больше.
чему исходного соединения.
Пример 2. Другим примером практического применения изобретеник является предотвращение заболеваний, распространяемых половым путем, например, таких,
как цитомегаловирусные инфекции. Цито- мегаловирус (ЦМВ). входящем в семейство вирусов герпеса, только в США заражено более 1 млн. человек. У людей с ослабленной иммунной системой он может вызывать желудочно-кишечные расстройства или слепоту (обе серозные поверхности легко инфицируются вирусами, а вместе с тем не отличаются доступностью для многих системно применяемых противовирусных аген- тов).ЦМВ передается половым путем. Более высокая степень торможения (ингибирова- ни) может быть достигнута путем генерирования с течением времени биоактивных фрагментов (например, при введении двуниточной РНК с неправильным связыванием (Амплиген). Например, показано, что ингибирование ЦМВ после 24-часового воздействия фрагментов Амплигена достигает 100%. Такое регулируемое выделение биоактивного материала, как происходит при использовании двуниточной РНК относительно нетоксичного типа, не может быть легко достигнуто в случае применения мазей местного действия и подобных средств.
Генерирование биоактивных фрагментов двуниточной РНК подтверждают исследования культуры тканей с ЦВМ. Часто поражения ЦМВ называют цетамега- ловирусными инкулузиями, последние представляют собой обнаруживаемые в увеличенных клетках, пораженных вирусом, включения. Цетамегаловирусы человека составляют подгруппу вирусных агентов, тесно связанных или входящих в группу вирусов герпеса. Несмотря на повсеместное распространение, число лиц, пораженных ЦМВ, переданным половым путем в США, по оценкам, достигло в 1988 г. 1 илн. человек. Инфицирование обычно является бессимптомным, однако, у лиц с ослабленной иммунной системой могут возникать желудочно-кишечные расстройства или слепота. Особенно чувствительны к ЦМВ новорожденные, этот вирус-также может быть причиной выкидышей, мертворождения и послеродовой смерти.
В данном эксперименте использовали следующие процедуры и материалы.
Извлекали фибропласты крайней плоти человека у новорожденных и выдерживали при низкой пассировке(20) в физиологическом растворе с солями Эрла,.куда добавляли 10% сывороточной жидкости эмбриона быка, 2 миллимоля L-глютамина, 1 миллимоль пи рувата натрия, 20 миллимо- лей буфера HEPES и антибиотики. После слияния клеток их выдерживали в вышеописанном растворе, из которого было удалено
5% сывороточной жидкости эмбриона быка. Ежедневно проводили анализы клеток на бактериальное или микоплазменное загрязнение.
5В исследованиях использовали штамм
человеческого цетамегаловируса (ЦМВ ATpC/VR - 538. ветвь AD 169). Он состоял из второго посева в фибропласт крайней плоти человека, который собирали, когда действи- 10 ем ЦМВ было охвачено 75% реципиентных клеток. Освобожденный из клеток штамм вируса помещали в трубки для хранения и держали при -120°С. Тесты на бактериальную и микоплазменную стерильность дали
5 отрицательные результаты. Титр инфекционной активности препаратов шиамма ЦМВ определяли на клетках фиброшпста крайней плоти человека.он составлял 4x10 флю- орисцентообразующих инклуэий на
0 миллилитр (см.далее).
Использовали лиофлизид - клинический сорт Амплигена (двуниточная РНК с неправильным связыванием, поли I, поли Ci2, V фирма Нем рисерч, Роквилл, шт.
5 Мэриленд, США). В соответствии с инструкциями производителя Амплиген был реструктурирован, аликвотирован и хранилося при -120°С.Для каждого эксперимента проводили размораживание свежей аликвоты
0 путем вращения в водяной бане при 50°С и разводили в вышеописанной тканевой питательной среде до нужных концентраций.
Лекарственное средство инкубировали с клетками фибропластов крайней плоти че5 ловека при различных условиях. К числу изменяемых параметров относились: (1) концентрация Амплигена; (2) последовательность воздействия Амплигеном на вирусные инклузии; (3) продолжительность
0 воздействия Амплигена на эти клетки фибропласта. Жизнеспособность обработанных Амплигеном клеток фибропласта краййей плоти человека была такой же, как и в случае необработанных клеток, что опре5 деляли по инклузии голубого трипана (т.е. 99%). Конфлуентные клетки фибропластова крайней плоти человека культивировали на круглых покровных стеклах в ампулах с кожухом емкостью 3,7 мл (1 драхма). Вирусную
0 инфекцию инициировали инкубированием этих ампул с 0,25 мл культуры ЦМВ соответствующего разбавления. Клетки крайней плоти человека подвергали воздействию ЦВМ в течение одного часа (700 кг, 37°С)
5 для обеспечения поглощения вируса. Ампулы промывали 2-3 раза для устранения внеклеточного вируса. Затем в ампулы снова помещали 1 мл тканевой питательной среды и обычно инкубировали их 18-24 часа, при37°С-72 часа.
Репликацию ЦМВ измеряли следующим образом. Вирусную репликацию останавливали, фиксируя фибропласты крайней плоти человека в 100%-ном ацетоне. Покровные стекла, на которых находились прилипшие клетки этих фибропластов, промывали и инкубировали с моноклональным антителом мыши (Дюпон) антицетамега- ловирусного типа, специфичным для непосредственного предшествующего белка массой 72 килодальтона. Связанное антитело детектировали путем добавления антиагента IgGF /ab/2/э IGMA/ марки FITC. Инфицированные вирусом клетки давали яблочно-зеленое ядерное флюоресцентное свечение при рассмотрении в эпифлюорес- центном микроскопе с 250-кратным увеличением. В микроскопе осуществлялся подсчет числа инфицированных клеток (т.е. тех, что; содержали дающие ядерное флюо- рисцентное свечение инклузии). Препарат позитивного штамма разбавляли так, чтобы в отсуствие Амплигена он позволял получать 200-1200 зараженных ЦМВ клеток в расчете на одно предметное стекло через 24 часа инкубирования. Это достигалось при мультиплетности инфекции 0,04.
Определяли среднее число инклузии ЦМВ для репликатиых покровных стекол в условиях всех экспериментов и сравнивали результаты с данными для позитивных контрольных клеток, не получавших Амплиген. Параллельно оценивали негативные контрольные образцы, которые не подвергали воздействию Амплигена или ЦМВ. Противовирусная активность Амплигена рассчитывалась в соответствии со следующей формулой:.
% ингибирования инклузии ЦМВ-среднее число инклузий ЦМВ/покровное стекло для обработанных Амплигеном клеток НГГ 100% - среднее число инклузии ЦМВ/покровное стекло для необработанных контрольных клеток НГГ
Данные о влиянии продолжительности предварительной обработки Амплигеном на инфицирование фибропластов крайней плоти человека с цетэмегаловирусом. Репли- катные монослои фибропластов крайней плоти человека подвергали: предварительной обработке 10 мкг/мл Амплигена или предварительной обработке. 100 мг/мл Амплигена в течение указанных промежутков времени до поглощения ЦМВ. Степень инфицирования ЦМВ определяли через 24 часа после поглощения вируса описанным методом IFA. Среднее число инклузии ЦМВ на одно покровное стекло для обработанных Амплигеном культур сравнивали с контрольыми результатами для необработанных лекарством культур. Полученные результаты свидетельствуют о том, что степень ингибирования цетамегаловирусной инфекции прямо пропорциональна продолжительности предварительной обработки Амплиге- ном. Максимальное ингибирование наблюдалось при предварительной обработке клеток HFF Амплигеном в течение 24 часов.
Данное исследование демонстрирует способность двуниточной РНК с неправильным связыванием оказывать противовирусное действие по отношению к ЦМВ, которое возрастает с течением времени, и чувствительность ЦМВ к двуниточной РНК с неправильным связыванием вне зависимости от использованной концентрации остается с течением времени на уровне, который не достижим при местном применении двуниточных РНК относительно нетоксичной группы.
Процедуры также эффективны для снижения до предела потогенности фильтруемых агентов, выделяемых биологических
жидкостях, например, фильтруемых агентов, найденных в биологических жидкостях, таких как спинномозговая (цереброспинальная.) жидкость, особенно агентах, имеющих место при болезни Альцхеймера и
других медленно прогрессирующих болезнях, или медленных вирусов, вызывающих медленно прогрессирующее умственное ухудшение.
Формула из обретения
Способ лечения вирусных инфекций, путем введения в организм больного иммуно- модулирующего препарата, отличающи- й с я тем, что, с целью повышения естественных противовирусных реакций и укрепления иммунной системы в покализованных отделах организма, в качестве иммуномоду- лятора используют препараты двуниточной РНК с неправильным связыванием, представляющих собой комплекс полиинозината
и полицитидилата, содержащего от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы Г|п KC12-C14, V)n ИЛИ
rln(C29,G)n и вводят его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл.
Влияние системной обработки с помощью двуниточной РНК на уровень извлекаемого вируса в изолированной биологической жидкости (жидкостях)
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для активации естественных защитных сил организма. Цель - повышение естественных противовирусных реакций и крепления иммунной системы в локализованных отделах организма. В качестве иммуномодулятора используют препараты двунитчатой РНК с неправильным связыванием, представляющий собой комплекс полиинозината и полицитидилата. содержащий от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы rln r(Ci2-i4 V)n или rln(C29. G)n и вводят его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл. Способ позволяет повысить резистентность организма к вирусной инфекции.1 табл.
Пациент
Время
екцией
екцией
инфекостого
Предварительная обработка4 недели 30 недель
Предварительная обработка8 недель 40 недель
Предварительная обработка
8 недель 36 недель
Нагрузка вируса со- культурой
0,6; 0,8; 0.5 0.3; 0.25; 0,25 0,2; 0,15; 0,15
| ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ ПОВОЗКА | 1931 |
|
SU28224A1 |
