СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА РАСТВОРИМОГО ДИГИДРОКВЕРЦИТИНА Российский патент 2007 года по МПК C07D311/32 C07D311/40 

Изобретение относится к получению препаратов для сельского хозяйства, в частности биологических средств защиты растений от патогенов или кормовых добавок для животных.

Дигидрокверцетин (3,3,4,5,7-пентагидроскифлавон) флавоноид, полифенольное соединение - мелкокристаллический порошок кремового цвета, без запаха и вкуса, легко растворим в органических растворителях (этанол, этилацетат, ацетон, диметилсульфоксид), малорастворим в горячей воде, нерастворим в воде при комнатной температуре. Растворимость в 10% этаноле 0,055 мас.%, в воде существенно ниже.

Дигидрокверцетин обладает широким спектром биологической активности: противовоспалительным и радиозащитным действием (1. Т.Ю.Ильченок и др. Фармакология и токсикология, 1975, №5, с.607-612), проявляет антиоксидантные. капилляропротекторные, антигистаминныс свойства (2. Патент РФ 2014841, опубл. 30.06.1994). Дигидрокверцетин относится к низкомолекулярным антиоксидантам, обладающим Р-витаминной активностью и поэтому используется для лечения заболеваний сердца, гипертонической болезни, глазных кровоизлияний (3. Рогожкин В.В., Перстолчин Д.В. Материалы Третьего съезда общества биотехнологов России. М: Изд-во МАКС Пресс, 2005, с.178-179).

Дигидрокверцетин получают из древесины лиственницы (сибирской, даурской), содержание в которой достигает 1,4 мас.% от веса сухой древесины (4. Авт. свид. СССР №351847, опубл. 15.03.1975. 5. Патент РФ №2000797, опубл. 15.10.1993. 6. Патент РФ №2014841, опубл. 30.06.1994). Экстракты древесины лиственницы также обладают высокой антиоксидантной активностью, превышающей в 1,5-2 раза активность дигидрокверцетина, и могут быть без предварительного разделения и очистки использоваться в качестве биоантиоксидантов (7. Чупка Э.И. и др. Гидролиз и лесохимическая промышленность, 1992, №3, с.11-13). Вторым основным компонентом водного экстракта древесины лиственницы является полисахарид арабиногалактан (8. Odomazig P. et al. Carbohydr. Res., 1994, N252, P.317-324).

Экстракт лиственницы, содержащий дигидрокверцетин и арабиногалактан, обладает также способностью подавлять размножение вредных бактерий из группы Е.coli. Salmonella, Clostrodium в пищевых продуктах (9. Пат. US №6210678, опубл. 03.04.01 г.)

Известен способ выделения и растворения дигидрокверцетина из древесигы лиственницы (10. Авт. свид. СССР №351847, опубл. 15.03.1957) водной экстракцией опилок древесины лиственницы при нагревании, обработки водного экстракта полиамидным сорбентом, десорбции дигидрокверцетина с полиамида этилацетатом и кристаллизацией из водного экстракта. Выделение связано с потерями в процессе сорбции и адсорбции, а также с необходимостью регенерации дорогостоящего полиамидного сорбента.

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является способ выделения дигидрокверцетина (11. Пат. РФ №2034559, опубл. 10.05.1995.) В соответствии с ним выделение дигидрокверцетина и получение растворимого в воде препарата состоит из следующих операций:

1) предварительное обессмоливание измельченной древесины лиственницы неполярными углеводородами (гексан или бензин);

2) последующая экстракция полярным растворителем этилацетатом;

3) упаривание этилацетатного экстракта;

4) растворение сухого остатка в горячей воде и (при необходимости) выделение дигидрокверцетина кристаллизацией.

Основным недостатком прототипа является использование двух стадий обработки сырья с помощью органических растворителей и упаривание органических растворителей, которые резко удорожают технологический процесс, создают экологические проблемы, пожаро- и взрывоопасность. Количество извлеченного водой дигидрокверцетина лежит в интервале 0,8-1,2 мас.% (в пересчете на массу сухой древесины).

Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в повышении выхода дигидрокверцетина за счет более полного извлечения из древесного сырья без применения органических растворителей и упрощение способа за счет сокращения количества операций.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе, включающем измельчение древесного сырья и обработку его водой, растительное сырье дополнительно подвергают размолу и механохимической обработке в присутствии гидролизующего реагента при следующем соотношении компонентов, мас.%:

гидролизующий реагент0,5-10древесинаостальное

Предпочтительно в качестве гидролизующего реагента используют твердую щелочь: гидроксид натрия и карбонат натрия.

Предпочтительно в качестве гидролизующего реагента используют целлюлозолитический фермент.

Предпочтительно механохимическую обработку ведут в шаровых мельницах планетарного, виброцентробежного, вибрационного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих шаров от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 10 до 1 минуты соответственно.

Применение карбонатов щелочных металлов по сравнению с гидроксидами требует большего расхода реагента, но обладает техническими преимуществами - меньшим пылеобразованием и простотой дозирования порошкового щелочного реагента. Используются реагенты квалификаций «ч» и «чда».

Существенными отличительными признаками изобретения являются:

- растительное сырье дополнительно подвергается механохимической обработке;

- механохимическую обработку ведут в присутствии гидролизующего реагента;

- механохимическую обработку проводят при следующем соотношении компонентов, мас.%:

гидролизующий реагент0,5-10древесинаостальное

Способ осуществляется следующим образом.

Древесное сырье (опилки, щепа и т.д.) с влажностью менее 15 мас.% смешивают с твердой щелочью (едкая щелочь, карбонаты щелочных металлов) или ферментным целлюлозолитическим препаратом целловиридином и подвергают обработке в шаровых мельницах планетарного, виброцентробежного, вибрационного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих шаров от 60 до 400 м/с². В результате обработки происходит измельчение древесного сырья до размеров частиц 6-40 мкм и разрушение клеточных стенок древесины. Вещества, содержащиеся в клетках, в процессе механохимической обработки контактируют с гидролизующим реагентом. При этом происходит частичный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлозы древесины и разрушение связанных форм дигидрокверцетина. За счет повышения в сырье концентрации свободных форм дигидрокверцетина обеспечивается увеличение выхода продукта при обработке водными растворами.

Порошковые частицы после механохимической обработки представляют собой механокомпозит, то есть композитный материал, состоящий из отдельных участков сырья и реагента, отличающийся от смеси порошков увеличенной площадью поверхности границы раздела между участками древесины и реагента. Поскольку площадь контакта между твердыми реагентами увеличена по сравнению со смесью порошков, композиты обладают повышенной реакционной способностью в гидролитических реакциях.

Механохимическая обработка смеси обеспечивает следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

- разрушение клеточных стенок в частицах древесины позволяет наиболее полно выделить дигидрокверцетин;

- образование механокомпозитных частиц из сырья и реагента с развитой поверхностью контакта фаз обеспечивает высокую реакционную способность механохимического продукта при обработке водой;

- вследствие гидролитических реакций происходит выделение дигидрокверцетина из связанных форм в растительном сырье и повышение выхода продукта.

Таким образом, предлагаемый способ состоит из 2 (вместо 4 по прототипу) операций:

1) механохимическая обработка смеси сырья с реагентом;

2) экстракция растворимых форм дигидрокверцетина водой, отделение раствора и (при необходимости) выделение дигидрокверцетина кристаллизацией.

Полученный в результате осуществления твердофазного механохимического способа порошковый препарат может рассматриваться в качестве готовой сухой формы дигидрокверцетина, содержащей растворимый дигидрокверцетин, обладающей улучшенным биологическим эффектом и потребительскими свойствами. Товарный продукт легко тарировать, хранить и транспортировать. В некоторых случаях возможно прямое использование порошкового продукта, например, в качестве биологических средств защиты растений или кормовых добавок.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Опилки древесины лиственницы (с влажностью 15 мас.%) смешивают с 5 мас.% едкого натра NaOH. Смесь обрабатывают в механохимической мельнице-активаторе виброцентробежного типа ВЦМ при ускорении шаров 120 м/с² и времени пребывания смеси в зоне обработки 2 минуты до размера частиц менее 40 мкм (90% от всей массы частиц).

Полученный порошковый препарат обрабатывают водой и определяют содержание водорастворимых форм дигидрокверцетина следующим образом. Образцы выдерживают в дистиллированной воде (соотношение жидкость - твердая фаза 4:1) при комнатной температуре в течение 12 часов. С помощью аппарата Сокелета из образцов при 70°С полностью удаляют растворимые компоненты. Осадок сушат при 105°С до постоянного веса. Выход растворимых веществ определяют как по весу высушенного экстракта, так и по разнице навески исходного порошка и веса высушенного осадка.

Концентрацию дигидрокверцетина определяют хроматографически с помощью прибора высокоэффективной жидкостной хроматографии Миллихром (Россия), колонка ПронтоСИЛ С 18, подвижная фаза 2,0% LiClO₄ 3Н₂O; 0,5:100 HClO₄ (70%). В качестве стандарта использовались растворы дигидроквертицина (12. ТУ ОП-13-0279488-02-92, Иркутский институт органической химии СО РАН). Электронный спектр совпадал с ранее сообщавшимся и характеризовался максимумом поглощения при 290 нм.

Кроме дигидрокверцетина обнаружены примеси других флаваноидов (дигидрокемпферол, нарингенин) в сумме 5 мас.%. Выход дигидрокверцетина составил 1,2-1,4 мас.% от веса сухой древесины.

Пример 2.

Осуществляют в условиях примера 1. В качестве гидролизующего агента используют ферментный препарат целловиридин (Бердское ПО Сиббиофарм, активность 2000 ед/г) в количестве 1,5 мас.%. Аналитическое определение проводят аналогично примеру 1. Выход дигидрокверцетина составил 1,1-1,3 мас.% от веса сухой древесины.

Заявленное соотношение концентраций гидролизующих реагентов определяется следующими эффектами.

Введение реагента в концентрации менее 0,5 мас.% приводит к резкому увеличению времени механохимической обработки до технологически неприемлемых величин и не обеспечивает полноту извлечения дигидрокверцетина из древесины. Применение смесей, содержащих более 10 мас.% реагента, становится неэффективным с экономической точки зрения - затраты на увеличение выхода не окупаются стоимостью дополнительно выделенного продукта.

Режим механохимической обработки с ускорением шаров менее 60 м/с² не обеспечивает протекания гидролитической реакции. При ускорении более 400 м/с² наблюдается разложение исходного сырья, включая дигидрокверцетин.

Биологическая активность определялась в процессе стимулирования устойчивости мягкой пшеницы Новосибирская 89 к патогенам. Исследовалось влияние препаратов на рост в культуре бактерий Pstudomonas fluorescens, являющихся антагонистами патогенов, и на заселенность корней пшеницы естественной микрофлорой. Показано увеличение титра клеток культуры на 41+4%. Стимулирующий эффект превышает действие имеющихся на рынке препаратов. Плотность заселения корней пшеницы бактериями (ед. × 10000/мг корней) составила 27,0+9,6, или 540% к контролю и соответствовала достигаемой плотности при использовании наиболее эффективных коммерческих препаратов.

В Таблице приведены экспериментальные данные по выходу дигидрокверцетина из древесины лиственницы при изменении условий осуществления способа. Как видно из примеров 1-12, проведение механохимической обработки в виброцентробежной мельнице ВЦМ позволяет совместить процессы измельчения, гидролиза и повысить выход дигидрокверцетина до 1,2-1,4 мас.%.

ТаблицаЗависимость выхода дигидрокверцетина от условий получения препарата из древесины лиственницы№ п/пВремя механохимической обработки, минКонцентрация щелочи, мас.%Концентрация целловиридина, мас.%Выход дигидрокверцетина, мас.% от сухой древесины12-0,500,9022-1,01,1132-1,51,2842-2,01,30522NaOH-1,01623NaOH-1,20725NaOH-1,40827NaOH-1,419210NaOH-1,431015NaOH-0,911145NaOH-1,4212105NaOH-1,4313210Na₂CO₃-1,2714410Na₂CO₃-1,31

Изобретение относится к способу получения дигидрокверцетина, который включает измельчение древесного сырья, обработку его водой, при этом растительное сырье подвергают дополнительно механохимической обработке в присутствии гидролизующего реагента при следующем соотношении компонентов, мас.%: гидролизующий агент - 0,5-10, древесина - остальное. Предпочтительно в качестве гидролизующего реагента используют твердую щелочь: гидроксид натрия, карбонат натрия. Предпочтительно в качестве гидролизующего реагента используют целлюлозолитический ферментный препарат - целловиридин. Предпочтительно механохимическую обработку проводят в шаровых мельницах планетарного, виброцентробежного, вибрационного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 10 до 1 минуты соответственно. Технический результат - повышение выхода дигидрокверцетина за счет более полного извлечения из древесного сырья без применения органических растворителей. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения препарата растворимого дигидрокверцетина, включающий измельчение древесного сырья, обработку его водой, отличающийся тем, что растительное сырье дополнительно подвергают механохимической обработке в присутствии гидролизующего реагента при следующем соотношении компонентов, мас.%: гидролизующий реагент - 0,5-10, древесина - остальное.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидролизующего реагента используют твердую щелочь: гидроксид натрия, карбонат натрия.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидролизующего реагента используют целлюлозолитический ферментный препарат целловиридин.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что механохимическую обработку проводят в шаровых мельницах планетарного, виброцентробежного, вибрационного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 10 до 1 мин, соответственно.