ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CEREUS B 3б ГКМ ВИЗР № 98 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/85 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде.

Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИК₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИК_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при pH от 4,5 до 8,5, см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность при низких значениях pH среды.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью при низких значениях pH среды.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus cereus В 3б, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов при pH от 3,0 до 8,5.

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) по номером 98 от 12.03.99 г. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980г.).

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы в поселке Кишкенай (Литовская республика) на территории Клайпедского филиала АО "ТОГ". Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку углеводородокисляющей активности в отношении нефти и нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки штамма:
Палочки размером 1,5 х (3,0 - 7,0) мкм, одиночные и в цепочках, образуют споры через 24 - 48 часов на МПА; споры овальные, спорангий не раздувается, расположены субтерминально. На МПА культура образует непрозрачные белые или светло-кремовые колонии с ровным краем, блестящие, слизистые, легко снимающиеся с поверхности агара. Штамм растет в диапазоне температур от (2 - 5)^oC до (45 - 50)^oC, оптимальная температура роста - (25-35)^oC; pH среды от 2,7 до 8,8, оптимальный - 3,4 - 7,5. Штамм хранят на косяках МПА при (2 - 5)^oC или в лиофилизированном виде в ампулах.

Физиолого-биохимические признаки штамма:
Грамположителен (по щелочи), факультативный анаэроб, растет анаэробно, не образует пигменты. Оксидазный тест положительный, каталазный тест положительный. Растет при 7%NaCI, при +55^oC рост отсутствует. Тест Фогес-Проскауэра положительный, pH среды теста Фогес-Проскауэра - 5,7. Образует ацетилметилкарбинол, потребляет цитрат, утилизирует пропионат. Обладает нитратредуцирующей способностью. Гидролизует желатин, казеин, крахмал; образует кислоту из глюкозы. Способен к восстановлению лакмуса, пептонизации и образованию творожистого осадка сычужного типа в тесте с лакмусовым молоком. Утилизирует многие источники азотного и углеродного питания: нитраты, соли аммония, пептон, аминокислоты, кукурузную и соевую муку, растительные экстракты и лизаты, глюкозу, сахарозу, крахмал.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную питательные среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7Н₂O - 0,5 г/л
FeCl₂ • 6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - до 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Затем глубинную культуру микроорганизма (10%) вносили в стерильный торф одновременно с минеральными добавками и проводили доращивание при Т = 3^oC в течение 120 часов.

В качестве минеральных добавок использовали:
карбамид - 0,6 мас.%;
двойной суперфосфат - 0,3 мас.%;
сульфат калия - 1,5 мас.%
Титр полученного биопрепарата - 1 • 10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы.

Пример 1
Биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus В 3б вносили в керамические сосуды, наполненные грунтом с pH от 3,0 до 8,5 и содержанием мазута 36,6 до 39,2 г/кг. Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oC в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2
Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus В 3б был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с содержанием сырой нефти 48,0 - 51,4 г/кг; pH колебалось от 3,0 до 8,5.

Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 94%), в том числе и при низком pH (до 92,5% при pH 3,0). При этом штамм эффективен в широком диапазоне температур (Т = 3 - 45^oC).

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован в ГКМ ВИЗР под номером 98. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, соевую муку, мелассу, при 28°С в течение 72 ч в аэробных условиях. Глубинную культуру микроорганизма (10%) вносят в стерильный торф с минеральными добавками и доращивают при 3°С в течение 120 ч. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов при рабочей концентрации 0,1% составила 91,5 - 94% в диапазоне рН 3,0 - 8,5. 2 табл.

Штамм бактерий Bacillus cereus В 3б ГКМ ВИЗР 98 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.