Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к применению микроорганизмов, в частности лактобацилл и бифидобактерий, для доставки веществ, полезных для реципиента, к специфическим заранее определенным частям его желудочно-кишечного тракта. В частности, данное изобретение относится к принимаемому внутрь носителю, содержащему микроорганизмы, предназначенные для лизиса в конкретных местоположениях кишечника, и к применению их для поддержания здоровья индивидуумов или для лечения и/или профилактики заболеваний.
Уровень техники
Желудочно-кишечный тракт является основным органом для поглощения материала, который должен использоваться индивидуумом для поддержания его целостности. Такой материал включает в себя любой источник энергии, такой как белки, липиды или углеводы, а также незаменимые компоненты, такие как витамины, незаменимые масла и т.д. Для выполнения его задачи желудочно-кишечный тракт организован для выполнения различных функций в различных его участках. Например, в желудке имеющийся кислый рН поддерживает раннее расщепление перевариваемого материала, тогда как в кишечнике этот материал будет далее расщепляться ферментами, секретируемыми присутствующими бактериями, и в конечном счете будет резорбироваться.
Кишечный тракт колонизируется микроорганизмами, такими как бактероиды, лактобациллы, бифидобактерий, а также Е. coli, одной из основных задач которых является защита индивидуума от атаки патогенами. Это достигается в основном конкуренцией с патогенами за места прикрепления и в конечном счете за местоположение для роста. Эти бактерии поддерживают также дополнительное расщепление пищевого материала, принимаемого индивидуумом.
В прошлом большое внимание привлекали к себе пробиотические организмы благодаря тому, что было обнаружено, что некоторые штаммы проявляют полезные свойства в отношении человека и животных при их приеме внутрь. Пробиотиками считают жизнеспособные микробы, которые улучшают здоровье индивидуума сохранением природной микрофлоры в кишечнике. Пробиотики могут прикрепляться к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, по меньшей мере, временно колонизируя желудочно-кишечный тракт и подобным образом препятствуя прикреплению вредных микроорганизмов в нем. Решающей предпосылкой для их действия является то, что они должны достигать слизистой оболочки кишечника в подходящей и жизнеспособной форме и не разрушаться в верхней части желудочно-кишечного тракта, в частности, под действием низкого рН, существующего в желудке. В частности, было обнаружено, что некоторые штаммы рода Lactobacillus или Bifidobacterium выдерживают кислый рН среды желудка при прохождении через него и способны колонизировать слизистую оболочку кишечника, причем их временное или непрерывное сохранение в кишечнике оказывает многочисленные позитивные эффекты на здоровье индивидуумов, включивших их. Эти полезные эффекты, в общем и целом, приписывались специфическим соединениям/метаболитам, которые пробиотики продуцируют и секретируют во время их пребывания в кишечнике.
В этом отношении, ЕР 0577903 раскрывает молочно-кислые бактерии, способные вытеснять Helicobacter pylori, признанную причину развития язвы и рака желудка, из желудочных клеток. Считается, что молочно-кислые бактерии, используемые в этом отношении, высвобождают некоторые соединения, вредные для роста Helicobacter, так что последующая или избыточная пролиферация этих патогенов уменьшается или даже предотвращается.
В WO 97/00078 раскрыт специфический штамм, названный Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103), в качестве такого пробиотика. Этот микроорганизм используют, в частности, в способе предупреждения или лечения индуцируемых пищей реакций гиперчувствительности таким образом, что его вводят реципиенту вместе с пищевым продуктом, который был подвергнут гидролитической обработке пепсином и/или трипсином. Этот выбранный штамм Lactobacillus описывается как проявляющий адгезивные и колонизирующие свойства и обнаруживающий систему протеазных ферментов, так что белковый материал, содержащийся в вводимом продукте питания, дополнительно гидролизуется протеазами, секретируемыми этим специфическим штаммом Lactobacillus. Способ, обсуждаемый в данном документе, будет в конечном счете приводить к поглощению кишечником белкового материала, который уже не будет иметь значительного количества аллергенного материала.
В ЕР 0768375 раскрыты дополнительно специфические штаммы рода Bifidobacterium, которые способны внедряться во флору кишечника и могут прикрепляться к клеткам кишечника. Сообщается, что эти бифидобактерии способствуют иммуномодуляции, будучи способными конкурентно исключать адгезию патогенных бактерий к клеткам кишечника, способствуя тем самым поддержанию здоровья человека.
Таким образом, в течение нескольких последних лет исследование сосредоточилось на обеспечении дополнительных микроорганизмов этого рода, все из которых имеют то общее, что они предназначаются для вселения в желудочно-кишечную микрофлору с колонизацией желудочно-кишечного тракта в течение определенного периода времени и проявления их действия в зоне или в местоположении, в которых они находятся.
Хотя пробиотики вызывают много полезных эффектов для индивидуума, включающего их, недостатком является то, что указанные микроорганизмы будут проявлять их действие только при колонизации кишечника и секреции соединений, участвующих в индукции этого эффекта/эффектов. Кроме того, поскольку секреция соответствующего соединения является биологическим процессом, на который влияют различные параметры, количество доступного соединения/метаболита будет широко варьировать. Кроме того, поскольку эти микроорганизмы будут колонизировать только ограниченную часть кишечника, которая обеспечивает благоприятные условия для их роста, можно ожидать, что это действие будет проявляться только в этой части кишечника.
Таким образом, целью данного изобретения является устранение недостатков предшествующего уровня техники и обеспечение улучшенных средств для доставки веществ индивидууму, для которого они являются полезными.
Раскрытие изобретения
Во время интенсивных исследований, приведших к данному изобретению, авторы данного изобретения поняли, что вышеупомянутая цель может быть достигнута применением новой концепции, полностью противоположной используемому до сих пор представлению.
Таким образом, согласно данному изобретению, микроорганизмы, подлежащие использованию, не предназначаются для выживания в желудочно-кишечном тракте и колонизации его, как это имеет место в случае пробиотиков, а скорее данное изобретение предлагает применение микроорганизмов для доставки веществ, полезных для хозяина, к специфическим частям его желудочно-кишечного тракта, причем этот микроорганизм находится в состоянии, готовом к высвобождению этого вещества или этих веществ, соответственно, в заранее заданном местоположении желудочно-кишечного тракта (так называемое целевое высвобождение).
Для достижения такой направленной доставки и/или высвобождения представляющих интерес соединений используемые микроорганизмы будут находиться в таком состоянии, что они будут высвобождать их внутриклеточный материал в желаемом местоположении.
Осуществление изобретения
Такое состояние, т.е. способность высвобождать представляющий интерес биологический материал в заранее заданном местоположении в кишечнике, может быть присущим ему свойством самого микроорганизма, которое может происходить из чувствительности к условиям среды, существующим в указанном определенном местоположении в желудочно-кишечном тракте. В этом отношении, микроорганизм, содержащий соответствующее вещество (вещества), будет лизироваться в конкретном местоположении кишечника и высвобождать весь его внутриклеточный материал, в том числе представляющее интерес вещество.
Подобным образом, такая способность высвобождения представляющего интерес биологического материала может также являться результатом подходящей предобработки данного микроорганизма перед его введением реципиенту. Такая предобработка может включать в себя ослабление жизнеспособности микроорганизмов для уменьшения их общего роста или эффективности сопротивляемости. С другой стороны, такая предобработка может также включать в себя усиление жизнеспособности и/или сопротивляемости соответствующих микроорганизмов, которое может, например, достигаться посредством инкапсуляции таким образом, чтобы, например, сделать микроорганизм устойчивым к желудочному соку и/или желчи.
Например, подходящая предобработка может осуществляться подверганием микроорганизмов шоковой обработке, например, подверганием их специфическим условиям нагревания, низкой температуры или низких или высоких величин рН, соответственно, инкубированием их с фагами или введением рекомбинантных конструкций в эти микроорганизмы, которые влияют на ранний лизис этих клеток, использованием микроорганизмов, о которых известно, что они содержат профаги, подверганием их конкретным ферментативным условиям, неблагоприятным для роста, индукцией бактериальной SOS-реакции или инактивацией внутренних защитных систем стрессового ответа, которые восстанавливают поврежденные внутриклеточные белки на уровне регуляции или на уровне экспрессии генов, так что полученные микроорганизмы будут в конечном счете проявлять уменьшенную жизнеспособность и/или устойчивость к условиям/изменениям окружающей среды в кишечнике.
Должно быть понятно, что указанные уменьшенная жизнеспособность и/или уменьшенная резистентность к условиям/изменениям окружающей среды будет в значительной степени зависеть от используемого способа, чувствительности к ним соответствующих микроорганизмов и режима, в котором применялся данный способ.
Как упоминалось выше, микроорганизмы могут быть также сделаны более резистентными к конкретным условиям, например, посредством инкапсулирования или запуска систем позитивного и увеличенного внутреннего защитного ответа на стресс, которые восстанавливают поврежденные внутриклеточные белки на регуляторном уровне или на уровне экспрессии генов, так что используемые микроорганизмы будут сохраняться в течение пролонгированного времени и не будут лизироваться непосредственно при вхождении в желудочно-кишечный тракт реципиента (например, в желудок с его низким рН) и в конечном счете будут доставлять их груз к местоположению, удаленному от места вхождения в кишечник реципиента (осуществлять целевое высвобождение).
В принципе, используемыми микроорганизмами могут быть любые микроорганизмы, невредные для индивидуума, которому их вводят, такие как микроорганизмы, обычно используемые для приготовления пищевых продуктов, например молочнокислые бактерии, например лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки, педиококки и т.д., и/или микроорганизмы, обычно колонизирующие желудочно-кишечный тракт, такие как бактероиды, Е. coli и т.д. В соответствии с предпочтительным вариантом используемые микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из лактобацилл и бифидобактерий и их пробиотических вариантов. Предпочтительными примерами таких микроорганизмов являются Bad 4, В128, В129 или Lal, все из которых доступны из банков-депозитариев под номерами доступа CNCM I-2168, CNCM I-2169, CNCM I-2170 или CNCM I-1225 соответственно.
Используемые микроорганизмы содержат, по меньшей мере, одно вещество, высвобождение которого в конкретном местоположении будет приводить к полезному эффекту для реципиента. Такое вещество может быть, в принципе, любым веществом, о котором известно, что оно вызывает желаемое действие, таким как соединения, влияющие на иммунную систему благоприятным образом, например стимулируя ее или уменьшая воспалительные реакции, или веществами, предотвращающими рост или избыточный рост, соответственно, патогенов в желудочно-кишечном тракте относительно собственных микроорганизмов реципиента, или любым веществом, благоприятным для функций кишечника, таких как абсорбция, моторная функция кишечника.
Данное изобретение рассматривает также вещества, которые сконструированы или о которых известно, что они лечат заболевания, такие как соединения, продуцируемые определенными микроорганизмами, например антибиотики или другие биологически активные молекулы, такие как полипептиды, углеводы или определенный жир.
Примерами таких веществ являются, например, иммуномодулирующие соединения, такие как, например, иммуноглобулины или интерлейкины, или соединения, которые организм не может продуцировать самостоятельно, такие как незаменимые жирные кислоты, соединения, о которых известно, что они могут уничтожать патогены, такие как противогрибковые агенты, и т.д. Другие соединения являются бактерицидными молекулами, такими как, например, бактериоцины, аутолизины, липотейхоевые кислоты, липополисахариды, или соединения, которые организм не может продуцировать самостоятельно, такие как незаменимые жирные кислоты.
Примерами специфической доставки в тонкую кишку являются, например, вещества, которые взаимодействуют локально со слизистой оболочкой хозяина, агрегируют патогены и облегчают их элиминацию промывающими слизистую веществами, которые усиливают абсорбцию питательных веществ, образуя комплексы со специфическими питательными веществами и модифицируя их профиль абсорбции, или вещества, например ферменты, которые способны расщеплять факторы вирулентности патогенов (такие как энтеротоксины).
Примерами для доставки в ободочную кишку являются, например, вещества, которые обладают свойствами детоксикации, вещества, которые обладают свойством регулировать профиль моторики специфических частей кишечника, вещества, которые обладают способностью благоприятствовать дифференцировке кишечных клеток, вещества, которые обладают свойством увеличивать естественный (врожденный) иммунитет, или вещества, которые имеют способность восстанавливать целостность слизистой оболочки.
Для обеспечения микроорганизма, содержащего одно или несколько представляющих интерес веществ, может быть выбран любой микроорганизм, который природно экспрессирует такие вещества. Поскольку эти микроорганизмы предназначены для высвобождения их внутриклеточного материала, включающего в себя полезное вещество (вещества), в специфическом местоположении кишечника, секреция этого вещества в окружающую среду не является необходимой. Напротив, в соответствии с данным изобретением это вещество будет присутствовать в более высоких количествах в заранее заданном местоположении, так как по существу весь используемый микроорганизм будет лизироваться и высвобождать там это вещество. Для этой цели соответствующие микроорганизмы, уже содержащие соответствующее вещество, могут быть при необходимости предобработаны подходящим образом для доставки этого вещества в определенное желаемое местоположение кишечника и могут вводиться в реципиента, после чего они будут лизироваться в соответствующем местоположении в кишечнике в зависимости от характера предобработки.
Это является большим преимуществом в сравнении с обычным использованием пробиотиков, при котором полезные вещества главным образом высвобождаются посредством секреции в окружающую среду. В соответствии с данным изобретением используемый микроорганизм будет высвобождать весь свой полезный груз по существу одновременно при достижении местоположения кишечника, в котором он должен лизироваться. Кроме того, количество соответствующего вещества, доставляемого в реципиента, может также более правильно регулироваться, так как будет вводиться конкретное количество используемого микроорганизма в общем и целом, с известным содержанием представляющего интерес вещества.
Для увеличения количества конкретного вещества, доставляемого микроорганизмом, могут быть использованы обычные способы, такие как применение конкретных ферментативных условий или генетическая модификация самого микроорганизма, например, подверганием микроорганизмов случайному мутагенезу и отбором мутантов, экспрессирующих более высокое количество желаемого вещества. Могут быть также использованы рекомбинантные способы, в которых экспрессия эндогенного гена может быть увеличена, например, связыванием соответствующего гена с промотором, более сильным, чем эндогенный промотор, или встраиванием гена или генов, кодирующих представляющее интерес вещество (или вещества), в этот микроорганизм с помощью плазмиды или в его хромосому, при необходимости связанных с сильным промотором, который запускает экспрессию представляющего интерес гена (генов) таким образом, что рекомбинантный микроорганизм будет содержать более высокие количества желаемого вещества.
Общепризнанным является то, что рекомбинантная технология будет также предоставлять возможность встраивания генов, кодирующих представляющее интерес вещество в микроорганизм, который природно не содержит такого вещества. Таким образом, любое желаемое вещество, которое может экспрессироваться микроорганизмом, может быть включено в данный микроорганизм встраиванием одного или нескольких генов, кодирующих указанное вещество (указанные вещества), в выбранный микроорганизм и подверганием этих рекомбинантных микроорганизмов условиям культивирования, подходящим для экспрессии этого вещества (этих веществ) и увеличения его (их) содержания в клетке. После этого данные микроорганизмы могут быть предобработаны таким образом, чтобы они были переведены в состояние, при котором это вещество доставляется к специфической части желудочно-кишечного тракта.
В концепцию данного изобретения входит также культивирование микроорганизма в питательной среде, содержащей представляющее интерес соединение, и при необходимости "обработка" этих микроорганизмов таким образом, что они включают в себя вещества из этой среды. Примерами соединений, которые могут быть включены таким путем, являются сложные углеводы или любой тип полипептидов, пептонов или белков.
Таким образом, микроорганизмы данного изобретения рассматриваются в качестве носителя для переноса представляющего интерес вещества к заранее заданному местоположению или участку желудочно-кишечного тракта реципиента. Поскольку специалист в соответствии с данным изобретением сможет определить, где вещество будет высвобождаться, настоящее изобретение обеспечивает превосходное средство для направленной доставки желаемого вещества к специфическим частям желудочно-кишечного тракта.
В зависимости от характера и продолжительности предобработки может быть установлена сопротивляемость микроорганизма, т.е. его выживание в желудочно-кишечном тракте, с потенциальными местоположениями доставки, находящимися во рту, в глотке, желудке, двенадцатиперстной кишке, тощей кишке, подвздошной кишке или ободочной кишке. Должно быть понятно, что специалист с квалификацией в данной области сможет, на основании его общих знаний и простого экспериментирования, определить продолжительность выживания конкретного микроорганизма в кишечнике реципиента и применить соответствующую обработку перед введением микроорганизма реципиенту.
Такие микроорганизмы обычно вводят в форме продукта, приемлемого для потребителя, такого как принимаемый внутрь переносчик или носитель соответственно. Примерами таких переносчиков или носителей являются фармацевтические композиции, галеновы препараты или пищевые композиции. Не ограничивающими примерами таких композиций являются молоко, йогурт, творог, сыр, кисломолочные продукты, ферментированные продукты на основе молока, мороженое, продукты на основе ферментированных злаков, порошки на основе молока, детские смеси, корм для комнатных животных, таблетки, жидкие бактериальные суспензии, высушенная пероральная добавка, увлажненная пероральная добавка, сухая добавка для зондового питания, увлажненная добавка для зондового питания.
Такой продукт может быть приготовлен выбором микроорганизма, который либо уже содержит подлежащее введению вещество, либо будет модифицирован соответственно для обеспечения такого вещества (таких веществ) в достаточном количестве.
Затем свойства указанного микроорганизма будут оцениваться простыми экспериментами, которые показывают общее выживание микроорганизма в желудочно-кишечном тракте. В случае выбора микроорганизма, который, например, не является резистентным к желудочному соку и который должен доставлять свой груз в местоположение далее по ходу продвижения в желудочно-кишечном тракте, такой микроорганизм будет предпочтительно инкапсулироваться для обеспечения его прохождения через желудок. С другой стороны, при выборе пробиотического микроорганизма, о котором известно, что он выдерживает окружающую среду, существующую в желудочно-кишечном тракте, и может начинать пролиферировать в кишечнике, жизнеспособность и/или сопротивляемость такого микроорганизма могут быть ослаблены таким образом, что он не начнет пролиферировать в желаемом местоположении, а, напротив, будет лизироваться там и доставлять в это местоположение свой груз.
После выбора и при необходимости предобработки микроорганизма указанный микроорганизм может быть включен в вышеупомянутый продукт в количестве 105-1013 КОЕ/мл в зависимости от природы доставляемого вещества и от количества этого вещества, содержащегося в соответствующих микроорганизмах.
Микроорганизмы и вышеупомянутые продукты могут быть затем использованы для поддержания здоровья индивидуумов, принимающих внутрь указанный микроорганизм, и/или для профилактики заболеваний.
Следующие далее неограничительные примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение.
Пример 1
Для испытания чувствительности различных микроорганизмов к различным условиям, имеющимся в желудочно-кишечном тракте, проводили эксперименты in vitro, в которых имитировали различные условия в кишечнике.
Двадцать две бактерии, в том числе 11 штаммов Lactobacillus, 10 штаммов Bifidobacterium и один штамм Leuconostoc, полученные из коллекции культур Nestle (NCC), реактивировали и первоначально выращивали в MRS-бульоне [Lactobacillus и Leuconostoc] или в MRS-Cysteine [Bifidobacterium] (табл.1) в анаэробных условиях (в анаэробном сосуде) в течение 16 часов (24-36 часов для бифидобактерий).
Исследованные бактериальные штаммы
Использовали другой физиологический тест для определения производительности и жизнеспособности этих двадцати двух штаммов (лактобацилл, лейконостока, бифидобактерий) в имитированном желудочном соке (SGJ) и солях желчных кислот.
а) Резистентность к кислым условиям: 5 мл имитированного желудочного сока (0,3% (мас./об.) пепсин, 0,5% (мас./об.) NaCl, рН 2,0 с HCl) + 1,5 мл 0,5% NaCl смешивали с 1 мл свежей бактериальной культуры. В различные моменты времени (0 мин, 1 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин) отбирали пробы 1 мл, разводили (серийные 10-кратные разведения) и точно подсчитывали.
b) Резистентность к солям желчных кислот (Oxgall, Difco): Все штаммы инокулировали в виде 1% инокулята в MRS-бульоне и выдерживали в течение 15 часов с различными концентрациями СО желчных кислот (0,0%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%). В конце этого периода времени брали пробы 1 мл, разводили (серийные 10-кратные разведения) и точно подсчитывали.
Результаты суммированы в следующих табл.2 и 3.
Как видно из табл.2, некоторые штаммы оказались кислотоустойчивыми. Например, все четыре штамма Lb. rhamnosus (в том числе Ls8=Lb. GG) уже теряют один порядок (+/-0,2 порядка) в количестве бактериальных клеток (КОЕ/мл) после 1-минутного подвергания действию имитированного желудочного сока (SGJ). Спустя 30 минут можно было наблюдать уменьшение, по меньшей мере, на 2,4 порядка (и до 5 порядков) для всех четырех штаммов Lb. rhamnosus. Спустя 60 мин подвергания действию SGJ все бактерии в основном погибали (потеря по меньшей мере 6 порядков). В этом контексте стало ясным, что все исследованные штаммы Lb. rhamnosus являются очень чувствительными к низкому рН.
Lb. johnsonii Lj3 теряет около 0,6-1,0 порядка после подвергания действию SGJ в течение 1 мин. Дополнительная экспозиция в течение 30, 60, 120 и 240 мин далее не уменьшала количество жизнеспособных бактерий. В этой связи становится совершенно очевидным, что испытанный штамм Lb. johnsonii является очень стабильным против низкого рН. Это открытие наблюдали ранее для Lb. johnsonii Lal (NCC533).
Штаммы, показанные выделением, как было обнаружено, не были стабильными при рН 2 и считаются хорошими кандидатами для быстрого лизиса и целевого высвобождения желаемых соединений в желудке.
В табл. 3 суммированы результаты экспериментов с использованием солей желчных кислот. Очевидно, что эти штаммы ведут себя совершенно по-разному в этом тесте в отношении солей желчных кислот:
Все изоляты Lb. rhamnosus/casei были обычно довольно стабильными к различным концентрациям солей желчных кислот. Концентрация 0,1% уменьшала количество бактерий максимально на 0,6 порядка. Повышение концентрации до 0,2% приводило к потере 0,5-0,9 порядка. При 0,3% Oxgall уменьшение было обычно в диапазоне одного порядка (+/-0,2 порядка), тогда как концентрация 0,4% желчных солей приводила к уменьшению жизнеспособных бактерий после 17 часов экспозиции на 1,0-1,7 порядка в зависимости от исследованного штамма. Lb. rhamnosus Ls8 (=Lb. GG) является довольно стабильным против солей желчных кислот, что приводит к общему уменьшению только на 1 порядок, которое является очень значимым.
Все бактериальные штаммы инокулировали при 1% в MRS и выращивали при 37°С или 30°С в течение 16 часов.
Штаммы, показанные выделением, являются не устойчивыми к различным концентрациям солей желчных кислот и являются хорошими кандидатами для быстрого лизиса и целевого высвобождения в этом месте кишечного тракта.
Должно быть понятно, что специалист с квалификацией в данной области может с легкостью испытывать другие штаммы на их пригодность к лизису в определенном местоположении в желудочно-кишечном тракте путем подвергания их действию условий, как подробно описано выше, или иных, отражающих окружающую среду, существующую в желудочно-кишечном тракте.
Данное изобретение относится к фармакологии и медицине, а именно к применению молочнокислых бактерий для доставки веществ, полезных для реципиента, к специфическим частям его желудочно-кишечного тракта, и может быть использовано для лечения и/или профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта. Данное изобретение обеспечивает повышенную эффективность лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта за счет использования носителя, в данном случае молочнокислых бактерий, для переноса представляющего интерес вещества к заранее заданному местоположению желудочно-кишечного тракта. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл.
| Geoffroy MC, Guyard С, Quatannens В et al "Use of green fluorescent protein to tag lactic acid bacterium strains under development as live vaccine vectors", Appi Environ Microbiol | |||
| ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР | 1922 |
|
SU2000A1 |
| Charteris WP, Kelly PM et all "Development and application of an in vitro meyhodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic | |||
