СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОПРОБИОТИЧЕСКОГО БАКТЕРИЙНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактерийных препаратов, и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний животных и птиц, а также производства гнотобиологических организмов (SPF- животных и птиц).

Создание крупных птицеводческих и животноводческих предприятий выдвинуло ряд новых экологических и клинических проблем, многие из которых не решены до настоящего времени. Среди них можно назвать такие, как необходимость защиты поголовья от эпизоотий, приводящих к падежу молодняка и массовой гибели птицы, защита потребителей продукции от инфекционных агентов, источником которых является мясо животных и птицы - сальмонелл, кампилобактеров, кишечных палочек, иерсиний, листерий, криптоспоридий и др., предотвращение распространения в природе антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов животного происхождения и т. п. Установлено, например, что 77% случаев сальмонеллеза человека вызваны сальмонеллами птичьего происхождения. Ежегодные убытки от заболеваний сальмонеллезом людей и птиц только в США составляют не менее 300 млн. долларов.

Не вызывает сомнений, что спектр потенциальных патогенов домашних животных и птиц будет неуклонно расширяться, что связано как с улучшением диагностики, так и с ухудшением экологической ситуации в отдельных регионах и в мире в целом, обусловливающим нарушение защитных механизмов макроорганизма, в первую очередь его нормальной микрофлоры. Роль нормальной микрофлоры в защите организма хозяина от неблагоприятного действия различных инфекционных и неинфекционных агентов общеизвестна. В естественных условиях нормальная микрофлора животных и птиц формируется прежде всего за счет их инфицирования микрофлорой родителей, а также микроорганизмов из внешней среды. Однако современная технология промышленного животноводства и особенно птицеводства в силу своих особенностей нарушает эволюционно сложившиеся взаимоотношения организма хозяина и его микрофлоры, поскольку эта технология фактически исключает обсеменение потомства нормальной микрофлорой родителей. Поэтому выведенные в инкубаторах цыплята обсеменяются микроорганизмами случайным образом из окружающей среды. Их биопленка неполноценна в плане обеспечения колонизационной резистентности. В связи с этим, инфицирование таких цыплят даже единичными клетками потенциально патогенных микроорганизмов сопровождается быстрым размножением последних, их диссеминацией во внутренние органы с возникновением патологических процессов и массовой гибелью молодняка или формированием особей с длительным носительством патогенных микроорганизмов.

Известно множество приемов защиты молодняка птицы и домашних животных от инфекционных заболеваний. Прежде всего, это включение в рацион молодняка разнообразных антибактериальных препаратов и их комплексов. Помимо этого широко используют различные вакцины, бактериофаги и другие антимикробные препараты. Однако длительное применение антибиотиков приводит к селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов, что ведет к удлинению носительства и их диссеминации в окружающую среду. Широкое использование антибиотиков в птицеводстве приводит также к их аккумуляции в мясе птицы с последующим попаданием этих химических соединений в организм потребителя с возможным развитием у последнего разнообразных токсических, аллергических и дисбиотических реакций.

В настоящее время для восстановления нарушенного микробиоценоза животных и птицы используют разнообразные приемы, прежде всего введение в больших количествах антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры кишечника животных, птиц и человека (кишечных палочек, бифидобактерий, лактобацилл и др.). Описаны многочисленные композиции чистых культур микроорганизмов, выделенных от человека и различных видов животных и птиц, для профилактики и лечения дисбактериозов и кишечных заболеваний у птиц и животных, либо их комбинации со стимуляторами роста бактерий или иммуномодуляторами.

Известны, например, пробиотические препараты для предупреждения колибактериоза у цыплят, приготовленные из монокультуры кишечных палочек, выделенных от кур, или из выделенных от овцы культур лактобацилл и пропионибактерий. Для предупреждения сальмонеллеза и кампилобактериоза предложено скармливать молодняку монокультуры лактобацилл или энтерококков. Известны препараты бактоферон, приготовленный из живых культур бифидобактерий и стрептококков с добавлением интерферона; стрептобифид, представляющий собой сухую биомассу смеси чистых культур бифидобактерий и стрептококков, выделенных от поросят; препарат СБА, содержащий смесь трех штаммов бактерий различных видов - ацидофильных лактобацилл, бифидобактерий и фекальных стрептококков, и предназначенный для профилактики заболеваний поросят; известен комплексный бактерийный препарат для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных - энтерацид П, содержащий по одному штамму ацидофильных лактобацилл и фекальных энтерококков, выделенных от песца, бактерийный препарат Биосан для лечения эндометрита коров, содержащий смесь штаммов лактобацилл двух видов, выделенных из влагалища здоровой женщины, и многие другие.

Вместе с тем отмечено, что наилучший протективный эффект наблюдается при введении бактериальных культур, выделенных от животного или птицы того же вида. Например, бактерии, выделенные от мышей, свиней и других животных, значительно слабее защищали новорожденных цыплят от инфекционных заболеваний, чем бактерии, выделенные от кур. В этой связи недостатком большинства вышеперечисленных препаратов представляется то, что они содержат бактерии, гетерогенные для организма реципиента, и поэтому транзитом быстро выводятся из организма. В связи с этим трудно ожидать одинаковый позитивный эффект при назначении любого из названных препаратов животным и птицам разных видов.

Известны способы создания колонизационной резистентности у молодняка кур путем использования чистых культур микроорганизмов, изолированных из зоба, слепой и толстой кишок взрослых кур. Известно также, что защита молодняка птицы от инфекционных заболеваний более выражена при использовании не монокультур, а смеси чистых культур микроорганизмов, состоящие из 2, 6 и даже 28 микроорганизмов, выделенных из зоба и цекума здоровых взрослых кур, причем часть из них не была идентифицирована (1). Однако при данном способе создания гомопробиотического препарата, то есть пробиотика, приготовленного на основе аллохтонных микроорганизмов конкретного вида животных или птиц и предназначенного для применения животным и птицам того же вида, велика вероятность того, что выделенные культуры являются клонами гетерогенных для видовой принадлежности хозяина микроорганизмов, случайно попавших в его пищеварительный тракт с пищей и водой, контаминированных транзиторными бактериями из окружающей среды или животных организмов другой видовой принадлежности (рыб, амфибий, насекомых и других, включая человека). Кроме того, по данным авторов, эффективность смеси бактерий, которую готовили для каждого испытания из сохранявшихся чистых культур, прогрессивно уменьшалась на протяжении 20-недельных испытаний, в то время как эффективность бактериальной смеси, приготовленной для каждого испытания из сохраняемого цекального содержимого, оставалась неизменной.

Имеются данные о протективном эффекте не только гомопробиотических препаратов, приготовленных из смеси чистых культур фекальных бактерий после культивирования их в анаэробных условиях, но и назначение нативного кишечного содержимого взрослых кур.

Защитный эффект в отношении сальмонеллеза при оральном назначении кишечной микрофлоры взрослых птиц установлен в Швеции, где на протяжении 5 лет цекальную бактериальную флору кур вводили 2.86 миллионам цыплят-бройлеров (2). Показано также, что назначение содержимого толстой кишки может оказывать и выраженный терапевтический эффект при назначении птице, инфицированной патогенными энтеробактериями (3). Однако в кишечном содержимом здоровых животных и птиц наряду с высоким содержанием автохтонных бактерий присутствует большое количество разнообразных аллохтонных бактерий, а также грибов. В этой связи назначение молодняку нативного содержимого толстой кишки взрослых животных и птиц с профилактический или лечебной целью сопряжено с риском инфицирования реципиента случайными для него видами бактерий, в том числе патогенными.

Известен способ получения гомопробиотического бактериального препарата для профилактики кишечных заболеваний птиц, особенно сальмонеллеза (4). Способ предусматривает анаэробное культивирование известными методами содержимого слепой кишки птицы в присутствии эпителиальных клеток пищеварительного тракта, например зоба птиц, с последующим после культивирования выделением чистых культур бактерий, наращиванием биомассы, ее отделением от питательной среды с последующим ее замораживанием или лиофилизацией. Для приготовления препарата используют лишь штаммы бактерий с высокой адгезивной активностью (не менее 10 бактерий на 1 эпителиальную клетку), отобранные в Fuller adhesion test. Изолированные таким образом штаммы были идентифицированы как Lactobacillus acidophilus, L.fermentum, L.lactis и Clostridium spp. Конечный препарат готовят путем раздельного культивирования отобранных бактерий на питательной среде типа MRS-бульон или VL-бульон в анаэробных условиях при 35^oC в течение ночи. По окончании культивирования готовят смесь культур путем помещения в питательный бульон по несколько капель каждой культуры и культивирования смеси в анаэробных условиях в течение 2 дней. Затем бактериальные клетки отделяют от питательного бульона, высушивают или замораживают. Возможно совместное культивирование отобранных штамов.

Таким образом, культивирование содержимого цекума в анаэробных условиях и последующий отбор бактерий по их способности к адгезии позволяет повысить эффективность получаемого препарата за счет использования при получении конечного пробиотического препарата бактерий с высокими адгезивными характеристиками. При данном способе конструирования препарата определяющей является адгезивная активность бактерий к эпителиальным клеткам. Вместе с тем известно, что многие чужеродные для хозяина бактерии, включая патогенные кишечные микроорганизмы, также обладают неспецифической адгезивной активностью. Кроме того, они могут нести плазмидные трансмиссивные гены, кодирующие образование у них структур, определяющих повышенную специфическую адгезию к эпителиальным клеткам (типа антигенов К-88 и К-99 у эшерихий, выделенных от поросят и цыплят, поверхностных белков у стрептококков и т.д.).

Цель изобретения - получение гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии (молочнокислые бактерии - большая гетерогенная группа грамположительных анаэробных и микроаэрофильных бактерий, которые при утилизации углеводов накапливают в среде молочную кислоту). Поставленная цель достигается тем, что пробиотик готовят на основе естественных симбиотических комплексов автохтонных анаэробных микроорганизмов, присутствующих в нормальной микрофлоре кишечника здоровых животных и/или птиц конкретного вида, которые в последующем и будут выступать в качестве реципиента данного пробиотика. Для выделения естественных комплексов бактерий проводят селективную деконтаминацию нативного биоматериала путем его разведения жидкой селективной для молочнокислых бактерий питательной средой, что позволяет удалить из биоматериала случайно попавшие в него чужеродные для данного вида животных и птиц микроорганизмы. Последующая обработка разведенного биоматериала сывороткой крови (или иммуноглобулиновыми препаратами) того же вида животных или птиц позволяет максимально полно удалить постороннюю микрофлору. После освобождения биоматериала от всех контаминирующих микроорганизмов его культивируют в анаэробных условиях с последующим пересевом полученной биомассы без выделения чистых культур в питательную среду, пригодную для накопления биомассы молочнокислых бактерий, и вновь культивируют в анаэробных условиях.

Полученная таким образом биомасса может быть использована в жидком, лиофилизированном или замороженном виде в качестве гомопробиотика для коррекции микробиоценоза кишечника или конструирования микробной экологии молодняка животных и птиц при их массовом выращивании или получения SPS-гнотобионтов.

Установлено, что слизистые желудочно-кишечного тракта начинают реагировать на вводимые орально микроорганизмы синтезом lgA только, если количество микроорганизмов составляет 10⁶ и более клеток на грамм содержимого кишки. Поэтому любые микроорганизмы, обнаруживаемые в пищеварительном тракте в количествах менее 10⁶ КОЕ, являются транзиторными и чужеродными. В связи этими данными для механического удаления возможной контаминации исходного биоматериала посторонними транзиторными микроорганизмами кишечное содержимое донора разводят селективной средой не менее, чем до 10^-6.

Известно, что сывороточные иммуноглобулины различных классов способствуют инактивации и устранению чужеродных микроорганизмов. Это подтверждено тем фактом, что 99% бактерий - представителей индигенной анаэробной кишечной флоры не покрыты секреторными иммуноглобулинами, в то время как энтеробактерии, энтерококки, другие аэробные и анаэробные транзиторные микроорганизмы полностью покрыты lgA. Основываясь на этих данных, окончательное удаление посторонней микрофлоры из разведенного биоматериала, взятого от донора, осуществляют внесением в разведенный до 10^-6 биоматериал сыворотки крови (или комплексного иммуноглобулинового препарата) того вида животных или птиц, для которого предназначен изготавливаемый по заявляемому способу гомопробиотик.

Пример 1. Подготовка исходного биоматериала, микробиологическая оценка его состава.

Свежевзятые образцы фекалий живых здоровых взрослых кур из племенного хозяйства или содержимое слепой кишки забитых здоровых птиц помещают в свежередуцированный тиогликолевый физиологический раствор для транспортировки в бактериологическую лабораторию. В качестве биоматериала можно использовать лиофилизированные или криоконсервированные образцы.

Из доставленного биоматериала готовят серийные десятикратные разведения используемой для транспортировки средой, из которых затем производят высевы проб в объеме 0,05-0,1 мл капельным методом на селективные и дифференциально-диагностические среды плотные Эндо, Плоскирева, Сабуро, Рогозы, маннит-солевой, азидовый агары, среда для выделения клостридий и полужидкая БС-среда с пропионатом лития. Посевы культивируют в анаэробных условиях при 42^oC в течение 24-72 часов. Состав микрофлоры здоровых кур-бройлеров приведен в таблице 1.

Как видно из таблицы, молочнокислые бактерии (энтерококки, лактобациллы и бифидобактерии) присутствуют в фекалиях здоровых кур-бройлеров в значительном количестве. Видовой состав лактобацилл характеризуется широким спектром видов (видовой состав лактобацилл определяли по спектру утилизации углеводов) - Lactobacillus acidophilus, L.alimentarius, L.fermentum, L.brevis, L.buchneri, L.plantarum, L.salivarius, L.lactis.

Пример 2. Деконтаминация биоматериала от аллохтонной микрофлоры.

Деконтаминацию биоматериала от аллохтонной микрофлоры, присутствующей в образце в количестве менее 10⁶ КОЕ/г, осуществляют путем последовательного десятикратного разведения испытуемого образца. Готовят 2 параллельных ряда пробирок с последовательными десятикратными разведениями биоматериала любой жидкой питательной средой, пригодной для выделения и культивирования лактобацилл и бифидобактерий, например МРС или БС, являющимися в настоящее время оптимальными для выращивания лактобацилл и бифидобактерий.

Берут стандартную питательную среду для выделения бифидобактерий сухую (БС) производства Государственного научного центра прикладной микробиологии МЗ РФ (г. Оболенск Московской обл.) следующего состава в г/л (см. табл.2).

50.35 г сухой среды тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, стерилизуют автоклавированием при температуре 110^oC в течение 30 минут и охлаждают до температуры 50-45^oC.

Первый ряд состоит из пробирок до разведения 10^-9 и предназначен для оценки общего количественного содержания лактобацилл и бифидобактерий в исходном биоматериале. Второй ряд предназначен для получения биомассы этих бактерий и состоит из пробирок с биоматериалом до разведения 10^-6. Для окончательной деконтаминации биоматериала от чужеродных микроорганизмов, присутствующих в биоматериале в сопоставимых с молочнокислыми бактериями количествах (более 10⁶ КОЕ/г), и получения симбиотических сообществ индигенных лактобацилл и бифидобактерий, свободных от схожих микроорганизмов иного происхождения, попавших в организм птицы-донора с водой и пищей, и гарантированного удаления аллохтонных, включая патогенные, бактерий, осуществляют 2-й этап деконтаминации.

В пробирку из последнего десятикратного разведения биоматериала второго ряда, приготовленного с использованием жидкой питательной среды МРС или БС, добавляют комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП), приготовленный из крови кур по способу, описанному в патенте РФ N 2050858 10%, в количестве 5-20% от объема исследуемого образца. КИП был приготовлен из крови кур того же птицеводческого хозяйства, в котором проводили настоящее исследование, и содержал в значительных количествах иммуноглобулины всех основных классов (lgG 40-50%, lgM 25-30%, lgA 25%). КИП характеризуется выраженной специфической активностью в отношении возбудителей основных инфекционных заболеваний кур, в т.ч. сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий, ротавирусов, а также других потенциально патогенных микроорганизмов. Содержимое пробирки тщательно перемешивают встряхиванием, герметично закрывают пробкой и помещают в термостат при 42^oС на 48 часов. Культивирование ведут в анаэробных условиях.

Пример 3. Приготовление гомопробиотического препарата.

После культивирования делают контрольные посевы биоматериала для определения количества микроорганизмов (в соответствии с примером 1) и наличия посторонней микрофлоры. В случае отсутствия роста на средах Эндо, Плоскирева, Сабуро, маннит-солевом агаре делают пересев материала (1:10) в свежую жидкую питательную среду для культивирования лакто- и бифидобактерий (среды МРС или БС) и культивируют в анаэробных условиях при 42^oC в течение 48 часов. Полученная биомасса представляет собой симбиотический комплекс лактобацилл и бифидобактерий индигенного происхождения. Для длительного сохранения полученной биомассы ее подвергают лиофилизации или замораживанию и используют в качестве гомопробиотика для коррекции, или конструирования микробной экологии новорожденных цыплят, или для профилактики и лечения инфекционных заболеваний взрослых кур.

Таким же способом может быть приготовлен пробиотический препарат для других видов животных и птиц на основе культивирования в анаэробных условиях на селективных питательных средах детерминантных видов микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры этого вида животных и птиц с деконтаминацией иммуноглобулиновым препаратом, приготовленным из сыворотки крови того же вида животных и птиц.

При необходимости последняя пробирка из второго ряда может быть заменена на две пробирки: 1-я со средой Рогозы для выделения симбиотических ассоциаций только лактобацилл, 2-я со средой БС с азидом и пропионатом лития для выделения только симбиотических ассоциаций бифидобактерий. Все последующие операции осуществляют аналогично описанному выше. Для приготовления комплексного пробиотического препарата полученные биомассы ассоциаций бифидобактерий и лактобацилл смешивают в отношении 1:10 и используют в качестве гомопробиотика.

Пример 4. Контроль пробиотического препарата.

Контроль полученного пробиотика осуществляют общепринятым методом посева на питательные среды Эндо и ТГС для определения посторонней микрофлоры - на этих средах рост в аэробных условиях отсутствует.

Для оценки количественного содержания лактобацилл и бифидобактерий в готовом гомопробиотике делают разведения на полужидких средах Рогозы и БС с пропионатом лития. При этом содержание бифидобактерий и лактобацилл в пробиотике не менее 10⁸ КОЕ/мл. Все определения ведут общепринятыми методами.

Изучение видовой принадлежности лактобацилл и бифидобактерий, содержащихся в препарате, проводят на основе изучения культуральных и ферментативных характеристик изолированных из комплекса гомопробиотика отдельных штаммов лакто- и бифидобактерий. Выделенные штаммы лактобацилл идентифицтированы как L.acidophilus, L.fermentum, L.lactis, L.plantarum Lactobacillus spp.; бифидобактерии - B.bifidum, B.longum, Bifidobacterium spp.

Пример 5. Оценка эффективности оральной инокуляции пробиотического препарата.

Пробиотик изготавливали по вышеописанному в примерах 2 и 3 способу.

Эксперимент был проведен на базе подмосковного экспериментального хозяйства ВНИТИП.

13107 однодневных цыплят после их посадки в птичник с напольным содержанием были орально инокулированы с питьевой водой гомопробиотическим препаратом. Первую контрольную группу составили цыплята в количестве 21432 голов, находящиеся в аналогичных условиях в других птичниках и получающие антибиотик левомицетин по принятой в хозяйстве схеме. Вторую контрольную группу составили 18747 цыплят, получавших с питьевой водой сухой бифидумбактерин, приготовленный на основе производственных штаммов бифидобактерий человеческого происхождения.

Контроль за гибелью цыплят опытной и контрольных групп вели ежедневно в течение 30 дней.

Результаты испытаний приведены в таблице 3.

Анализ представленных в таблице данных свидетельствует, что оральное применение приготовленного по данному способу гомопробиотического препарата в условиях промышленного птицеводства снижает гибель цыплят бройлеров более эффективно по сравнению с общепринятыми приемами (применение антибиотиков и пробиотиков на основе монокультур бифидобактерий человеческого происхождения). Патологоанатомическое вскрытие и бактериологическое исследование погибших цыплят опытной группы в подавляющем большинстве случаев не выявили каких-либо признаков их гибели от известных инфекционных агентов.

Таким образом, предложен способ получения гомопробиотика на основе индигеннных лактобацилл и бифидобактерий, присутствующих в кишечнике конкретного вида животных и птиц.

Список литературы.

1. GIeeson T.M., Starvic S, Blanchfield B. Protection of chicks against Salmonella infection with a mixture of pure cultures of intestinal bacteria. Avian Dis, 1989 Oct-Dec, 33(4), P. 636-42.

2. Wierup M., Wold-Troell M, Nurmi E. et al. Epidemiological evaluation of the salmonella-controling effect of a nationwide use of a comprtitive exclusion culture in poultry. Acta Vet. Scand. Suppi., 1988, 84, 309-311.

3. Weinack O.M Snoeyenbos GH, Soerjadi-Liem AS et al. Therapeutic trials with native intestinal microflora for salmonella typhimurium infections in chickens. Avian. Dis., 1985, 29 (4), 1230-1234.

4. Патент США N 4689226. Приоритет 25.08.87 г. НКИ 424/93. МПК А 01 N 63/00.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактерийных препаратов, и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний животных и птиц, а также производства гнотобиологических организмов (SPF- животных и птиц). Для выделения естественных комплексов бактерий проводят селективную деконтаминацию нативного биоматериала путем его разведения жидкой селективной для молочнокислых бактерий питательной средой. Это позволяет удалить из биоматериала случайно попавшие в него чужеродные для данного вида животных и птиц микроорганизмы. Последующая обработка разведенного биоматериала сывороткой крови (или иммуноглобулиновыми препаратами) того же вида животных или птиц позволяет максимально полно удалить постороннюю микрофлору. После освобождения биоматериала от всех контаминирующих микроорганизмов его культивируют в анаэробных условиях. Затем пересевают полученную биомассу без выделения чистых культур в питательную среду, пригодную для накопления биомассы молочнокислых бактерий, и вновь культивируют в анаэробных условиях. Оральное применение гомопробиотика в условиях промышленного птицеводства снижает гибель цыплят бройлеров более эффективно по сравнению с общепринятыми приемами. 3 табл.

Способ получения гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии, путем разведения нативного биоматериала донора с последующим культивированием в анаэробных условиях на селективных питательных средах и накопления их биомассы, отличающийся тем, что разведение нативного биоматериала донора проводят питательной средой, пригодной для селекции молочнокислых бактерий, с последующей обработкой разведенного биоматериала сывороткой крови или иммуноглобулиновым препаратом, приготовленным из крови животных или птиц того же вида, что и донор, а наращивание биомассы полученного комплекса молочнокислых бактерий проводят без выделения чистых культур.