СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЦИРКОВИРУСОВ Российский патент 2007 года по МПК C12N7/00 

Область техники, к которой относится данное изобретение

Данное изобретение относится к области цирковирусов и обеспечивает композиции и способы для культивирования цирковирусов, в частности цирковируса свиней. В частности, данное изобретение относится к способам культивирования цирковируса свиней в клетках млекопитающих, экспрессирующих функцию гена Е1 аденовируса млекопитающих.

Уровень техники

Вирусы семейства Circoviridae, обнаруживаемые в ряде видов растений и животных и обычно называемые цирковирусами, характеризуются круглыми, не имеющими оболочки вирионами со средним диаметром 17-23,5 нм, содержащими кольцевую одноцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (оцДНК). оцДНК геном цирковирусов является самым коротким из известных вирусных ДНК-репликонов. Как раскрыто в WO 99/459566, по меньшей мере, шесть вирусов согласно Шестому отчету Международного комитета по таксономии вирусов идентифицированы как члены этого семейства (Lukert, P.D. et al. 1995, The Circoviridae, pp.166-168. In F.A.Murphy, et al. (eds) Virus Taxonomy, Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Arch. Virol. 10 Suppl.).

К вирусам животных, включенным в данное семейство, относятся цирковирус анемии цыплят (chicken anemia virus, CAV), вирус заболевания клюва и перьев (beak and feather disease virus, BFDV), цирковирус свиней (porcine circovirus, PCV) и цирковирус голубей (pigeon circovirus). PCV был исходно выделен из культур клеток почек свиней. PCV реплицируется в клеточном ядре и образует большие внутриядерные тельца включения. См. Murphy et al. (1999, Circoviridae p.357-361, Veterinary Virology, 3^rd ed. Academic Press, San Diego). На данный момент известны два типа PCV: PCV тип 1(PCV1) и PCV тип 2 (PCV2). PCV1, изолированный в качестве стойкого контаминанта непрерывной клеточной линии почки свиньи РК-15 (АТСС CCL31), не вызывает детектируемого цитопатического эффекта в культуре клеток и не вызывает клинического заболевания свиней при экспериментальном инфицировании (см. Allan G., 1995, Vet. Microbiol. 44: 49-64; Tisher, I. et al., 1982, Nature 295: 64-66 и Tisher, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91: 271-276). PCV2, в продолжительность PCV1, тесно ассоциирован с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения у поросят-отъемышей (PMWS) (см. Allan G. et al., 1998, Europe J.Vet. Diagn. Investig. 10: 3-10; Ellis, J. et al, 1998, Can. Vet. J.39: 44-51 и Morozov, I. et al., 1998, J.Clin. Microbiol. 36: 2535-2541). Нуклеотидные последовательности для PC VI описаны в работе Mankertz, А. et al. (1997, J. Virol. 71: 2562-2566), а нуклеотидные последовательности для PCV2 описаны в работе Hamel, A.L., et al. (1998, J. Virol. 72: 5262-5267); Mankertz, A. et al.(2000, Virus Res. 66: 65-77) и Meehan, B.M. et al. (1998, J. Gen. Virol. 79: 2171-2179). Штаммы PCV2 описаны в WO 00/01409 и были депонированы Европейской коллекцией клеточных культур Центра прикладных микробиологии и исследований (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom): номер доступа V97100219, номер доступа V9700218, номер доступа V97100217, номер доступа V98011608 и номер доступа 98011609. PCV2 также описывается в WO 00/77216.

В опубликованных на данный момент исследованиях по PCV2 использовались либо гомогенат ткани, либо культивированный вирус, полученный из полевых изолятов. Tisher et al., 1987, Arch Virol. 96: 39-57 сообщает, что при обработке D-глюкозамином происходит стимуляция вступления клеток почек свиней в S-фазу клеточного цикла. Однако обработка клеток D-глюкозамином должна проводиться осторожно, т.к. D-глюкозамин является токсичным для культур клеток (см. Allan G. et al., 2000, Europe J.Vet. Diagn. Investig. 12:3-14). Остается потребность в способах культивирования цирковируса, такого, например, как PCV1 и PCV2, и других цирковирусов, которые позволят получать чистый цирковирус. Такие способы будут полезны, в частности, для получения антигенов PCV2 в качестве вакцин против PMWS. Данное изобретение нацелено на удовлетворение этой потребности.

Все патенты и публикации включены в настоящее описание в их полном виде путем отсылки.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы культивирования цирковирусов млекопитающих, включающие в себя: а) получение клеток млекопитающих, экспрессирующих функцию гена Е1 аденовируса млекопитающих, причем указанные клетки являются пермиссивными для репликации цирковируса млекопитающих; b) введение указанного генома цирковируса млекопитающих или его части, способной реплицироваться в указанные клетки; и с) культивирование указанных клеток млекопитающих в условиях, подходящих для репликации указанного цирковируса млекопитающих. В некоторых воплощениях этот способ дополнительно включает в себя извлечение указанного цирковируса из указанных культивируемых клеток.

В некоторых воплощениях цирковирусом млекопитающих является цирковирус свиней, такой как, например, цирковирус свиней 1 (PC VI) или цирковирус свиней 2 (PCV2). В дополнительных воплощениях цирковирус свиней содержит химерную нуклеотидную последовательность. В других воплощениях клетки млекопитающих происходят от свиньи. В других дополнительных воплощениях клетки млекопитающих являются клетками сетчатки свиньи.

В других воплощениях функция Е1 аденовируса млекопитающих является функцией Е1 аденовируса человека. В других воплощениях функция Е1 аденовируса млекопитающих является функцией Е1 аденовируса свиней. В следующих дополнительных воплощениях функция Е1 является функцией Е1А и/или Е1В. В других дополнительных воплощениях клетка млекопитающего, экспрессирующая функцию Е1 аденовируса млекопитающего, стабильно трансформирована последовательностью гена Е1 аденовируса млекопитающих. В других воплощениях последовательность гена Е1 аденовируса млекопитающих является гетерологичной по отношению к указанной клетке млекопитающего.

Данное изобретение обеспечивает рекомбинантные клетки млекопитающих, которые экспрессируют функцию Е1 аденовируса млекопитающих и содержат геном цирковируса млекопитающих или его часть, способную реплицироваться, причем указанные клетки являются пермиссивными для репликации указанного цирковируса млекопитающих. В некоторых вариантах цирковирусом млекопитающих является цирковирус свиней, такой как, например, цирковирус свиней 1 (PCV1) или цирковирус свиней 2 (PCV2). В дополнительных воплощениях цирковирус свиней содержит химерную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях функция Е1 аденовируса является функцией Е1 аденовируса человека. В других воплощениях функция Е1 аденовируса является функцией Е1 аденовируса свиней. В других воплощениях клетка млекопитающего происходит от свиньи. В следующих дополнительных воплощениях клетка млекопитающего является клеткой сетчатки свиньи. В дополнительных воплощениях клетка млекопитающего, экспрессирующая функцию Е1 аденовируса млекопитающих, стабильно трансформирована последовательностями гена Е1 аденовируса млекопитающих. В других воплощениях последовательность гена Е1 аденовируса млекопитающих является гетерологичной по отношению к указанной клетке млекопитающего.

Данное изобретение также обеспечивает способы получения рекомбинантных клеток млекопитающих, экспрессирующих функцию Е1 аденовируса млекопитающих и содержащих геном цирковируса млекопитающих, предусматривающие стадии: а) получение клетки млекопитающего, экспрессирующей функцию E1 аденовируса млекопитающих; и b) введения генома указанного цирковируса млекопитающих или его части, способной к репликации, в указанную клетку млекопитающего. В дополнительных воплощениях способ включает в себя дополнительную стадию культивирования рекомбинантной клетки млекопитающего в условиях, пригодных для репликации указанного цирковируса млекопитающих. В следующих воплощениях способ включает в себя извлечение указанного цирковируса из указанных культивируемых клеток. В некоторых воплощениях цирковирус млекопитающего является цирковирусом свиней, таким как, например, цирковирус свиней 1 (PCV1) или цирковирус свиней 2 (PCV2). В других воплощениях цирковирус свиней содержит химерную нуклеотидную последовательность. В следующих воплощениях клетки млекопитающих происходят от свиньи. В следующих воплощениях клетки млекопитающих являются клетками сетчатки свиньи. В дополнительных воплощениях функция Е1 аденовируса является функцией Е1 аденовируса человека или функцией Е1 аденовируса свиней. В других дополнительных воплощениях клетка млекопитающего, экспрессирующая функцию Е1 аденовируса млекопитающих, стабильно трансформирована последовательностью гена Е1 аденовируса млекопитающих. В других воплощениях последовательность гена Е1 аденовируса млекопитающих является гетерологичной по отношению к относительно указанной клетке млекопитающего.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А-1В показана характеристика и титрование вируса PCV2, полученного путем трансфекции и экстракции ДНК из инфицированных клеток VIDO R1 по способу Хирта. (А) ПЦР с использованием РСV2-специфичных праймеров и ДНК из PCV2-инфицированных клеток (дорожка 1) и фиктивно инфицированных клеток (дорожка 2). В качестве контроля использовали плазмиду, содержащую геном PCV2 (дорожка 3). Маркер молекулярных размеров ДНК (1-kb DNA ladder) фирмы GIBCO BRL наносили на дорожку М. (В) Вирусные ДНК из клеток, инфицированных PCV2 (дорожки 1, 3 и 5) и фиктивно инфицированных клеток (дорожки 2, 4 и 6) были переварены рестриктазами NcoI и SluI (дорожки 1 и 2), EcoRI и StuI (дорожки 3 и 4), EcoRI и EcoRV (дорожки 5 и 6). Маркер молекулярных размеров ДНК (1-kb-plus DNA ladder) фирмы GIBCO BRL наносили на дорожку М.

Фиг.2А-2В показывают титрование PCV2 путем иммунопероксидазного окрашивания. Через 72 ч после инфекции фиктивно инфицированные (А) или инфицированные вирусом PCV2 (В) клетки VIDO R1 инкубировали с кроличьими анти-ОРС2 поликлональными антителами и биотинилированным вторичным антителом. После внесения комплекса авидина и биотинилированной пероксидазы хрена монослой проявляли диаминобензидинтетрахлоридом (DAB). Одна темная клетка соответствовала инфицированию единичной вирусной частицей.

Фиг.3А-3С показывают нуклеотидную последовательность (А) и аминокислотные последовательности ORF1 (В) и ORF2 (С) цирковируса свиней 2, описанные в Genbank (регистрационный номер AF086834).

Осуществление изобретения

Данное изобретение относится к композициям и способам для культивирования цирковирусов млекопитающих, в частности цирковируса свиней. Данное изобретение основано на открытии того, что клетки свиньи, экспрессирующие функцию Е1 аденовируса человека, могут быть трансфицированы геномом вируса PCV2 и продуцируют PCV2 вирус с высоким титром вируса. Клеточная линия VIDO R1, депонированная в АТСС под регистрационным номером РТА-155, является линией клеток сетчатки свиньи, трансформированных геном Е1 аденовируса-5 человека (HAV5), который, как было показано, индуцирует вступление клетки в S-фазу клеточного цикла и трансактивирует транскрипцию. См. Shenk, Т. (1996). "Adenoviridae: the viruses and their replication" In Fields Virology. 3^rd ed. B.N, Fields, D.M.Knipe and P.M.Howley (ed.) Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, pp.2111-2148. Как описано здесь, в примере 3, клетки VIDO R1 трансфицировали геномом PCV2 и давали вирус с титром 2×10⁷ ИЕ/мл.

При осуществлении данного изобретения применяются общепринятые способы, если нет других указаний, традиционной микробиологии, иммунологии, вирусологии, молекулярной биологии и способы рекомбинантных ДНК, которыми владеют специалисты. Эти методы полностью изложены в литературе. См., например, Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vols. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N.Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization (B.Hames & S. Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation (B.Hames & S.Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.Freshney, ed. (1986)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition); vols. I, II & III (1989).

Circoviridae, семейство вирусов, имеющих лишенные оболочки сферические вирионы со средним диаметром 17-23,5 нм, содержащие кольцевую одноцепочечную ДНК (оцДНК), описаны в Шестом отчете Международного комитета по таксономии вирусов, как уже указывалось выше. К членам этой группы относятся цирковирусы свиней: PCV1 и PCV2. Известно, что некоторые цирковирусы свиней патогенны, такие как, например, PCV2, который ассоциирован с PMWS.

Нуклеотидные последовательности PCV1 представлены в работах Mankertz, A., et al., 1997, J. Virol. 71:2562-2566 and Meehan, B.M. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:221-227. Нуклеотидные последовательности PCV2 представлены в работах Hamel, A.L. et al. (1998, J. Virol. 72:5262-5267; Mankertz, A. et al., 2000, Virus Res. 66:65-77 and Meehan, B.M. et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:2171-2179). Репрезентативные штаммы PCV2 депонированы в Европейской Коллекции Клеточных Культур (Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom) под регистрационными номерами: No. V97100219, No. V9700218, No. V97100217, No. V98011608 и No.V98011609. Описание PCV2 дано также WO 00/77216. Нуклеотидные последовательности PCV2 были также опубликованы в работах Hamel et al., (1998), J. Virol. vol. 72,6:5262-5267 (GenBank AF027217) и Morozov et al., (1998), J. Clinical Microb. vol.36, 9:2535-2541, а также GenBank AF086834, AF086835 и AF086836. Сравнение опубликованных нуклеотидных последовательностей PCV1 и PCV2 выявляет их <80% идентичность, несмотря на то что геномы имеют сходную организацию, особенно что касается взаимного расположения двух самых длинных открытых рамок считывания (ORF) с предполагаемым сайтом инициации репликации ДНК.

Данное изобретение включает в себя способы культивирования цирковирусов млекопитающих, в частности, цирковируса свиней (PCV). Данное изобретение включает в себя способы культивирования PCV, содержащего представленную здесь или известную в данной области нуклеотидную последовательность PCV, или ORF из этой последовательности, или ее части, способные к репликации. Данное изобретение включает в себя также способы культивирования PCV, содержащих нуклеотидную последовательность PCV, отличающуюся вследствие вырожденности генетического кода от представленных здесь или известных в данной области; или ее ORF, или ее части, способные к репликации. Данное изобретение включает в себя также способы культивирования PCV, содержащих вариации нуклеотидной последовательности PCV, не изменяющие функциональность или штаммовую специфичность нуклеотидной последовательности, или ее ORF, или ее части, способные к репликации. Данное изобретение включает в себя способы культивирования PCV, содержащих нуклеотидные последовательности PCV, способные гибридизоваться в условиях от промежуточной до высокой строгости с последовательностями, представленными здесь; и способы культивирования PCV, содержащих мутации нуклеотидной последовательности PCV, представленной здесь или известной в данной области, например, делеции или точковые мутации, или их ORF, или их части, способные к репликации. Данное изобретение включает в себя также способы культивирования PCV, содержащих гетерологичные нуклеотидные последовательности. Данное изобретение включает в себя также способы культивирования PCV, содержащих химерные нуклеотидные последовательности цирковирусов, такие как, например, нуклеотидные последовательности цирковируса свиней, слитые с нуклеотидными последовательностями других патогенных вирусов, таких как, например, патогенный для свиней вирус, в том числе парвовирус.

В данном контексте гетерологичная нуклеотидная последовательность по отношению к цирковирусу или клетке млекопитающего является последовательностью, которая обычно не связана с последовательностью цирковируса как часть генома цирковируса, или последовательностью, которая обычно не связана с клеткой млекопитающего соответственно. Гетерологичные нуклеотидные последовательности включают в себя синтетические последовательности. Реакции гибридизации могут проводиться в условиях различной строгости. Условия, увеличивающие строгость реакций гибридизации, широко известны и опубликованы в данной области. См., например, Sambrook et al. (1989) стр.7.52. Примеры таких условий включают в себя (в порядке возрастания строгости): температуры инкубации 25°С, 37°С, 50°С и 68°С; концентрации буфера 10 Х SSC, 6 Х SSC, 1 Х SSC, 0.1 Х SSC (где SSC обозначает 0.15 М NaCl и 15 mM цитратный буфер) и их эквиваленты, использующие другие буферный системы; концентрации формамида 0%, 25%, 50%, и 75%; время инкубации от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более стадий промывки; время промывки 1, 2 или 15 минут; и раствор для отмывки 6 Х SSC, 1 Х SSC, 0.1 Х SSC, или деионизированная вода. Примером строгих условий гибридизации являются: 68°С и 0.1 Х SSC.

Геномы PCV кодируют несколько полипептидных последовательностей с приблизительным размером от 8 до 35 кДа. Считается рутинным определение ORF цирковирусов свиней с использованием стандартных программ, таких как, например, Mac Vector® (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030). Самая большая ORF (ORF1) двух типов PCV обнаруживает только минорную вариацию с идентичностью 85% (измеренной с использованием программы Clustal), и, как было показано, она является белком Rep у PCV1 (Mankertz, A., et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:381-384). He имея намерения быть связанным теорией, более высокий уровень вариабельности, обнаруживаемый в последовательностях ORF2 PCV1 и PCV2 (идентичность около 65%), позволяет предположить, что типоспецифические признаки PCV могут определяться соответствующим белком ORF2. Несколько типоспецифических эпитопов PCV были картированы на последовательностях ORF2 PCV2. См. Mahe, D. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:1815-24. Другое недавнее исследование идентифицировало ORF2 PCV2 в качестве главного структурного белка, который способен формировать капсидоподобные частицы в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим ORF2. См. Nawagitgul, Р. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:2281-2287.

В некоторых иллюстративных воплощениях данного изобретения рекомбинантный вектор, содержащий геном PCV или его ORF, или часть ORF, например, антигенный район, конструируют рекомбинацией in vitro между плазмидой и геномом PCV. В некоторых воплощениях геном PCV является геном PCV2. В других воплощениях рекомбинантный вектор, содержащий геном PCV, или его ORF, или часть ORF, например, антигенный район, конструируют рекомбинацией in vivo. Способы рекомбинации in vivo известны специалистам и включают в себя, например, способы, описанные в работе Chartier, et al. (1996, J. Virol. 70:4805-4810). Векторы для конструирования цирковирусных геномов включают в себя, например, бактериальные плазмиды, которые позволяют получать множество копий клонированной цирковирусной нуклеотидной последовательности. В некоторых воплощениях эту плазмиду котрансфицируют в подходящие хозяйские клетки для рекомбинации. Подходящие хозяйские клетки для рекомбинации включают в себя любую клетку, которая будет поддерживать рекомбинацию между геномом PCV и плазмидой, содержащей последовательность PCV, или между двумя или более плазмидами, каждая из которых содержит последовательности PCV. Рекомбинацию, как правило, проводят в клетках прокариот, например, в клетках Е.coli, тогда как получение цирковируса проводят предпочтительно в клетках млекопитающих, пермиссивных для репликации PCV, например, в клетках свиньи, в частности, клетках свиньи, способных экспрессировать функцию Е1 аденовируса млекопитающих.

Данное изобретение включает в себя применение любой клетки-хозяина млекопитающего, пермиссивной для репликации цирковируса, в частности, для репликации PCV, такого как PCV1 и PCV2. Allan et al. (1995, Veterinary Microbiology 44: 49-64) сообщают, что PCV реплицируется в культурах моноцитов/макрофагов свиней и коров. Согласно результатам, полученным Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96:39-57), для репликации PCV в культуре клеток необходимо наличие активно делящихся клеток. Примеры клеток и клеточных линий, которые можно использовать для репликации PCV, включают в себя клетки млекопитающих, содержащие функцию Е1, и пермиссивные для репликации PCV, включая клетки свиньи, такие как моноциты/макрофаги и клетки сетчатки, экспрессирующие аденовирусную функцию Е1. В иллюстративном воплощении, описанном здесь, было показано, что клетки сетчатки свиньи, экспрессирующие функцию Е1 аденовируса человека, являются пермиссивными для репликации PCV2 и дают вирус при 2×10⁷ ИЕ/мл. Линии клеток свиньи можно получить, например, из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC). Выращивание бактериальных культур клеток, а также культивирование и поддержание эукариотических клеточных линий и линий клеток млекопитающих являются процедурами, хорошо известными специалистам в данной области.

Данное изобретение включает в себя способы культивирования цирковирусов млекопитающих, в частности цирковируса свиней, в клетках-хозяевах млекопитающих, трансфицированных последовательностями гена Е1 аденовирусов млекопитающих. В некоторых воплощениях клетки млекопитающих стабильно трансформируют последовательностями гена Е1 аденовируса. В некоторых воплощениях последовательности гена Е1 интегрированы в геном клетки млекопитающего. В других воплощениях последовательности гена Е1 присутствуют на реплицирующейся плазмиде. В других воплощениях последовательность гена Е1 является гетерологичной для клеток млекопитающего. В иллюстративном описанном здесь воплощении клетки свиньи трансформируют последовательностью гена Е1 аденовируса-5 человека. Данное изобретение включает в себя использование любой клетки млекопитающего или линии клеток млекопитающего, экспрессирующих функцию Е1, пока клетка или клеточная линия, экспрессирующие функцию Е1, являются пермиссивной для репликации цирковируса, в частности, цирковируса свиней, например, цирковируса 1 свиней или цирковируса 2 свиней. В предпочтительном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетку или клеточную линию свиньи. Настоящее изобретение охватывает использование функции Е1 любого аденовируса млекопитающих до тех пор, пока клетка-хозяин млекопитающих, экспрессирующая функцию Е1 аденовируса млекопитающих, является пермиссивной для репликации цирковирусов, в частности, PCV, такого как, например, цирковирус 1 свиней или цирковирус 2 свиней. Геномы аденовирусов млекопитающих известны в данной области и приводятся, например, в работе Reddy et al. (1998, Journal of Virology, 72:1394), где описана нуклеотидная последовательность, организация генома и транскрипционная карта коровьего аденовируса 3 (bovine adenovirus 3, BAV3); и в работе Kleiboeker (1995, Virus Res. 36:259-268), где описана E1 область PAV-4. Данное изобретение включает в себя функцию Е1 любого из различных серотипов аденовируса человека, таких как Ad2, Ad5, Ad12 и Ad40. В иллюстративном воплощении, описанном здесь в примере 1, функцей Е1 является функция Е1 вируса человека Ad5. Ген Е1А человека экспрессируется сразу же после вирусной инфекции (0-2 часа) и до того, как начинают экспрессироваться любые другие вирусные гены. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175-208; Flint (1986) Advances Vims Research 31:169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25-38. Сайт инициации транскрипции гена Е1А Ad5 находится при нуклеотиде в положении 498, а стартовый кодон ATG белка Е1А находится при нуклеотиде в положении 560 в вирусном геноме. Белок Е1В действует in trans и необходим для транспорта поздних мРНК из ядра в цитоплазму. Промотор Е1В Ad5 состоит из одного высокоаффинного сайта узнавания Spl и ТАТА-бокса. В частности, последовательности генов Е1А и Е1В аденовируса-5 человека расположены при нуклеотидах 505-4034 нуклеотидной последовательности, представленной Chroboezek, J. et al. (1992, Virology. 186:280-285). В иллюстративном воплощении, приведенном здесь в примерах, клеткой-хозяином млекопитающего является клетка-хозяин свиньи, трансфицированная последовательностями гена Е1 аденовируса-5 человека.

Геном PCV может быть выделен из вирионов PCV или может быть представлен в виде генома PCV, встроенного в плазмиду, при помощи стандартных методов молекулярной биологии и биотехнологии. Клонирование полноразмерного генома PCV2 в вектор pBluescript II KS(+) от Strategene при помощи ПЦР описано в работе Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol vol 38:3474-3477). Из полученной плазмиды полноразмерный геном PCV2 может быть высвобожден расщеплением рестриктазой SacII.

Введение нуклеотидных последовательностей цирковируса в пермиссивные хозяйские клетки млекопитающих может быть достигнуто любым известным в данной области способом, в том числе, но и не только, как трансфекцей и трансформацией, в том числе, но не только микроинъекцей, электропорацей, преципитацей СаРО₄, DEAE-декстрановым способом с использованием липосом, бомбардировкой частицами и т.д. Иллюстративный способ трансфекции нуклеотидных последовательностей PCV2 в клетки VIDO Rl описан здесь в примере 3.

Считается, что способы культивирования прокариотических клеток, например, бактериальных клеток, и эукариотических клеток, например клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих аденовирусную функцию Е1, являются рутинными для специалистов в данной области.

Следующие примеры приводятся для иллюстрации изобретения, но ими изобретение не ограничивается. Все источники и публикации патентов, приведенные здесь, включены в их полном виде в описание путем отсылки.

Примеры.

Пример 1: Получение клеток сетчатки свиньи, трансфицированных последовательностями гена Е1 аденовируса человека (клеток VIDO R1)

Первичные культуры клеток сетчатки эмбриона свиньи трансфицировали 10 мкг плазмиды pTG 4671 (Transgene, Strasbourg, France) способом с применением фосфата кальция. Плазмида pTG 4671 содержит полные последовательности Е1А и Е1В (нуклеотиды 505-4034) вируса HAV-5 вместе с геном пуромицинацетилтрансферазы в качестве селектируемого маркера. В этой плазмиде область Е1 находится под контролем конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы мышей, а ген пуромицинацетилтрансферазы контролируется конститутивным ранним промотором SV40. Трансформированные клетки подвергали селекции в ходе трех пассажей в среде, содержащей 7 мкг/мл пуромицина, идентифицировали на основе изменения их морфологии в единичных очагах (т.е. потери контактного ингибирования) и подвергали клонированию из единичных клеток. Сначала полученную клеточную линию тестировали на ее способность поддерживать рост делеционных мутантов E1 HAV-5. Затем эту клеточную линию дополнительно исследовали на присутствие последовательности Е1 в геноме при помощи ПЦР, экспрессию белков Е1А и Е1В методом Вестерн-блоттинга и время удвоения в условиях клеточной культуры. Последовательности Е1 были обнаружены, а продуцирование белков Е1А и Е1В было продемонстрировано при помощи иммунопреципитации. Время удвоения было более коротким в сравнении со временем удвоения родительской клеточной линии.

Для оценки стабильности экспрессии Е1 клетки VIDO R1 культивировали в течение более чем 50 пассажей (разведение 1:3 дважды в неделю) и тестировали на их способность поддерживать репликацию HAV-5 с делегированным геном Е1. Экспрессию белков Е1А и Е1В с регулярными интервалами времени также контролировали при помощи Вестерн-блоттинга. Результаты показали, что линия VIDO R1 сохраняла способность поддерживать рост вируса с делегированным геном Е1 и экспрессировала белки Е1 на сходном уровне во время более чем 50 пассажей в культуре. Таким образом, VIDO R1 может считаться установленной клеточной линией. Клеточная линия VIDO R1 была депонирована в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) и имеет регистрационный номер РТА-155.

Пример 2.

В примере 2 дано описание молекулярного клонирования полноразмерного генома PCV2.

Сначала ДНК PCV2 амплифицировали при помощи ПЦР из тотальной ДНК, экстрагированной из поросенка с синдромом PMWS. Клонирование полноразмерной геномной ДНК PCV2 в вектор pBluescript II KS(+) (Stratagene) при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) описано в работе Liu et al. (2000). J. Clin. Microbiol 38:3474-3477). Последовательность PCV2 была депонирована в GenBank (регистрационный номер AF086834). Полноразмерную геномную ДНК PCV2 выделяют из полученной плазмиды расщеплением с использованием Sacll.

Пример 3.

Пример 3 описывает трансфекцию клеток VIDO R1, описанных в примере 1, плазмидой, содержащей геном PCV2, сконструированной, как описано в примере 2.

Материалы и способы

Клеточная культура

Линию клеток сетчатки эмбриона свиньи, VIDO R1, описанную в примере 1 и клетки Vero (АТСС) поддерживали при 37°С и 5% СО₂ в среде на основе MEM с добавлением 10% или 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) соответственно.

Трансфекция и инфицирование

Монослойные культуры клеток VIDO R1, выращенные в 6-луночном планшете, трансфицировали клонированной ДНК PCV2 с использованием Lipofectin согласно рекомендациям производителя (GIBCO BRL). Перед трансфекцией полноразмерный геном PCV2 вырезали из плазмиды расщеплением рестриктазой Sacll (Liu, Q., et al, 2000, J.Clin. Microbiol. 38:3474-3477). Для инфицирования трансфицированные клетки VIDO R1 подвергали трем циклам замораживания (-70°С) и оттаивания (37°С). Затем лизат клеток осветляли центрифугированием и использовали для инфицирования новых клеток VIDO R1. В опубликованных сообщениях не содержащую PCV1 линию клеток почки свиньи используют для культивирования вируса PCV2. Для стимуляции вступления в S-фазу клеточного цикла клетки почки свиньи всегда обрабатывают D-глюкозамином (scm. Tischer et al., (1987). Arch Virol 96:39-57). Однако обработка должна проводиться осторожно, т.к. D-глюкозамин токсичен для клеточной культуры (см. Allan et al., (2000). J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14). Напротив, обработка используемой в этом исследовании линии клеток VIDO R1 D-глюкозамином не была необходимой, т.к. она была трансформирована HAV5-E1, который способен индуцировать S-фазу.

Пример 4

Очистка и титрование вируса

Для очистки вируса PCV2 РСУ2-инфицированные клетки VIDO R1 проинкубировали с 0,5% Тритоном Х-114 в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) при 37°С в течение 45 минут и затем экстрагировали фреоном-113 (1,1,2-трихлортрифторэтан). Обломки клеток и мембран были осаждены центрифугированием при 2000 g в течение 15 минут. Вирусы в супернатанте осаждали при 35000 g в течение 3 часов через подушку 20% сахарозы. Осадок вируса суспендировали в ЗФР и хранили при -70°С. Титры вируса определяли в инфекционных единицах (ИЕ) количественным иммунопероксидазным окрашиванием на белок ORF2. Для этого монослойные культуры клеток в 12-луночных планшетах инфицировали серийными разведениями вируса. После адсорбции вируса в течение 1 часа клетки промывали и наслаивали сверху среду MEM, содержащую 2% ФБС и 0,7% агарозу. На 3-й день после инфекции (д.п.и.) верхний агарозный слой удаляли и клетки фиксировали и делали проницаемыми смесью метанол/ацетон (1:1 по объему) в течение 20 минут при -20°С. После блокирования 1% бычьим сывороточным альбумином в течение 1 часа при комнатной температуре клетки инкубировали с кроличьей сывороткой против ORF2 (Liu et al., 2001, Protein Expression and Purification. 21:115-120). После 2 часов инкубации планшеты промывали ЗФР и затем обрабатывали с использованием набора VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories). Реакцию проявляли 3,3'-диаминобензидинтетрахлоридом (ДАВ) и наблюдали под микроскопом. Подсчитывали положительно окрашенные клетки и титр вируса выражали в ИЕ, где 1 ИЕ определяли как 1 положительно окрашенную клетку/очаг клеток на 3 д.п.и.

Экстракция и характеризация вирусной ДНК.

Вирусную ДНК выделяли из монослоя клеток VIDO RI, инфицированных PCV2, по способу Хирта (1967, J. Mol Biol. 26:365-369). Затем вирусную ДНК характеризовали с использованием рестрикционного анализа и полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в работе Liu et al., (2000). J. Clin. Microbiol. 38: 3474-3477).

ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из инфицированных клеток, и PCV-2-специфичных праймеров амплифицировала продукт определенного размера, тогда как никакая ДНК не амплифицировалась из контрольных неинфицированных клеток. В соответствии с предполагаемой рестрикционной картиной расщепление вирусной ДНК рестриктазами Ncol and StuI приводило к образованию двух фрагментов размером 1291 п.н. и 477 п.н. соответственно; расщепление при помощи EcoRI and StuI приводило к образованию двух фрагментов размером 1492 п.н. и 276 п.н. соответственно; и расщепление при помощи EcoRI и EcoRV давало два фрагмента размером 1094 п.н. и 674 п.н. соответственно. Эти данные показывают, что был получен вирус PCV2. С использованием способа иммуноокрашивания и подсчетом положительно окрашенных клеток было определено, что титр вируса в препарате составляет 2×10⁷ ИЕ/мл.

Данное изобретение относится к способам культивирования цирковирусов, в частности цирковируса свиней. Данное изобретение обеспечивает композиции и способы для культивирования цирковируса свиней в клетках млекопитающих, экспрессирующих функцию Е1 аденовируса млекопитающих. 7 н. и 63 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ культивирования цирковируса млекопитающего, включающий в себя:

a) получение клеток млекопитающего, экспрессирующих функцию Е1 аденовируса млекопитающего, причем указанные клетки являются пермиссивными для репликации цирковируса млекопитающего;

b) введение генома цирковируса млекопитающего или его части, способной реплицироваться, в указанные клетки млекопитающего; и

c) культивирование указанных клеток млекопитающего в условиях, пригодных для репликации указанного цирковируса млекопитающего.