ВАКЦИНА MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE Российский патент 2018 года по МПК A61K39/02 

Отрасль изобретения

Данное изобретение касается Mycoplasma hyopneumoniae (М. hyopneumoniae или M.hyo). Более конкретно, изобретение касается растворимой части цельноклеточного лекарственного препарата M.hyo, и ее применения в вакцине для защиты свиней от энзоотической пневмонии.

Предпосылки создания изобретения

Энзоотическая пневмония у свиней, которую также называют микоплазменная пневмония, вызывается M.hyo. Заболевание является хроническим не смертельным заболеванием, которое поражает свиней в любом возрасте. Инфицированные свиньи проявляют только незначительные симптомы кашля и лихорадки, однако заболевание имеет значительное экономическое влияние в результате снижения эффективности питания и уменьшения прироста массы тела. Энзоотическая пневмония передается от свинье к свинье через носовые ходы организмами, которые переносятся воздухом, выделяющимся из легких пораженных свиней. За первичным инфицированием M.hyo может следовать вторичное инфицирование другими видами микоплазм (Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma flocculare), а также другими бактериальными патогенами.

M.hyo является маленьким прокариотическим микроорганизмом, способным к свободному существованию, хотя его часто находят в ассоциации с эукариотическими клетками, в силу того, что он имеет абсолютные требования для экзогенного стерина и жирных кислот. Эти требования, как правило, вызывают необходимость роста в среде, которая содержит сыворотку. M.hyo связывается с клеточной мембраной, а не клеточной стенкой.

Физическая ассоциация микоплазм с поверхностью клетки хозяина является основой развития и присутствия энзоотической пневмонии. M.hyo поражает дыхательные пути свиней, колонизируя трахею, бронхи и бронхиолы. Микоплазма продуцирует статический фактор ресничек, который вызывает повреждение реснитчатого эпителия дыхательных путей и остановку дыхания. Со временем, реснички дегенерируют, что делает свиней склонным к инфицированию вторичным патогеном. Характерные поражения от пурпурных к серым участкам уплотнений наблюдаются у инфицированных животных. Исследование забитых животных обнаружило поражение в 30-80% свиней. Результаты из 37 стад в 13 штатах указали на то, что 99% стад имели свиней с пневмоническими поражениями, типичными для энзоотической пневмонии. Поэтому существует значительная потребность в эффективных превентивных и лечебных средствах.

Антибиотики, такие как тиамулин, триметоприм, тетрациклины и линкомицин имеют некоторые преимущества, однако являются дорогими и нуждаются в пролонгированном применении. Кроме этого, антибиотики не устраняют распространение или повторное инфицирование M.hyo. Предотвращение путем поддерживания стад свободных от патогена иногда является возможным, однако часто случается повторное появление M.hyo. В результате серьезных экономических последствий пневмонии свиней, разрабатываются вакцины против M.hyo. Вакцины, которые включают композиции организмов микоплазм, выращенных в среде, которая содержит сыворотку, были представлены на рынке, однако растет обеспокоенность относительно обратных эффектов, вызванных компонентами сыворотки (такими как иммунокомплексы или неиммуногенные специфические протеины), которые присутствуют в материале для иммунизации. Другие попытки обеспечить вакцины М. hyo были успешными, однако заболевание остается широко распространенным.

M.hyo и цирковирус свиней типа 2 (PCV2) является двумя наиболее распространенными патогенами, с которыми сталкиваются в индустрии свиноводства. Свинья, инфицированная PCV2, проявляет синдром, который обычно называют полисистемным синдромом истощения после отбирания (PMWS). PMWS клинически характеризуется истощением, бледностью кожи, хилостью, дыхательной недостаточностью, диареей и желтухой. Кроме PMWS, PCV2 связана с несколькими другими инфекциями, включая ложное бешенство, репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS), болезнь Гласера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, коли-бактериоз после отбирания, диетический гепатоз и гнойная бронхопневмония. M.hyo связана с энзоотической пневмонией и считается одним из главных кофакторов в развитии заболевания, которое сопровождает цирковирус свиней (PCVAD).

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS) вызывается артеривирусом, имеющим чрезвычайную афинность к макрофагам, особенно, которые находятся в легких (альвеолярные макрофаги). Эти макрофаги глотают и удаляют бактерии и вирусы, которые попали в организм, однако не в случае вируса PRRS (PRRSV). В случае вируса PRRS, он размножается внутри макрофага, образовывая еще большее количество вируса, и убивает макрофаги. Когда PRRSV попадает в стадо, он присутствует и остается активным бесконечно. До 40% макрофагов уничтожаются, что позволяет бактериям и другим вирусам пролиферировать и вредить. Типичным примером этого является заметное ухудшение симптомов энзоотической пневмонии у более взрослых/старых свиней, при инфицировании вирусом PRRS. Больше чем половина PRRS-негативних свиней возраста отбирания заражаются перед попаданием на рынок.

Поэтому потребностью является улучшенная вакцина против микоплазм у свиней. Желательно, вакцина M.hyo является совместимой с другими свиными антигенами, такими как антигены PCV2 и вируса PRRS, независимо от того, или их вводят параллельно как отдельные вакцины, или объединяют в готовую к применению вакцину. Желательно, обеспечить готовую к применению комбинированную вакцину PCV2/M.hyo в одном флаконе с одной дозой.

Резюме изобретения

Данное изобретение касается иммуногенной композиции, которая включает растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), где растворимая часть композиции М. hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. В одном аспекте, растворимую часть цельноклеточного препарата M.hyo обрабатывали протеином-А или протеином-G перед добавлением к иммуногенной композиции.

В одном варианте воплощения, растворимая часть препарата M.hyo включает, по меньшей мере, один антиген протеина M.hyo. В другом варианте воплощения, растворимая часть препарата M.hyo включает два или больше антигена протеина M.hyo.

В других вариантах воплощения, иммуногенная композиция данного изобретения также включает, по меньшей мере, один дополнительный антиген. В одном варианте воплощения, по меньшей мере, один дополнительный антиген защищает от микроорганизма, который может вызывать заболевание у свиней.

В одном варианте воплощения, микроорганизм включает бактерии, вирусы или простейших. В другом варианте воплощения, микроорганизм выбирают из, однако не ограничиваются следующими: цирковирус свиней тип 2 (PCV2), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), парвовирус свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, лептоспиры, Lawsonia intracellulars, вирус свиного гриппа (SIV), антиген Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, респираторный коронавирус свиней, вирус эпизоотической диареи свиней (PED), ротавирус, вирус гепатита (TTV), цитомегаловирус свиней, энтеровирусы свиней, вирус энцефаломиокардита, патоген, который вызывает болезнь Ауески, классическая свиная лихорадка (CSF) и патоген, который вызывает трансмиссивный гастроэнтерит свиней, или их комбинации.

В некоторых вариантах воплощения, по меньшей мере, один дополнительный антиген представлен антигеном цирковируса свиней тип 2 (PCV2), антигеном вируса PRRS или их комбинацией. В одном варианте воплощения, композиция данного изобретения вызывает защитный иммунный ответ у свиньи против как M.hyo, так и PCV2. В другом варианте воплощения, композиция данного изобретения вызывает защитный иммунный ответ у свиньи против M.hyo, PCV2 и вируса PRRS.

В одном варианте воплощения, антиген PCV2 находится в форме гибридного цирковируса тип-1-тип 2, где гибридный вирус, включает инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, экспрессирующий ORF2 протеин цирковируса свиней типа 2. В другом варианте воплощения, антиген PCV2 находится в форме рекомбинантного протеина ORF2. В другом варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 экспрессируется бакуловирусним вектором.

В некоторых вариантах воплощения, композиция данного изобретения также включает адъювант. В одном варианте воплощения, адъювант выбирают из, однако не ограничиваются следующими: адъювант масло в воде, полимерный и водный адъювант, адъювант вода в масле, адъювант гидроксид алюминия, адъювант витамин Е и их комбинации. В другом варианте воплощения, композиция данного изобретения также включает фармацевтически приемлемый носитель.

В определенных вариантах воплощения, композиция данного изобретения вызывает защитный иммунный ответ против M.hyo при введении однократной дозы. В других вариантах воплощения, композиция данного изобретения вызывает защитный иммунный ответ против M.hyo, и как минимум одного другого микроорганизма, который может вызвать заболевание у свиньи, при введении однократной дозы. В других вариантах воплощения, композиция данного изобретения вызывает защитный иммунный ответ против M.hyo и как минимум одного другого микроорганизма, который может вызвать заболевание у свиньи, при введении двух доз.

Данное изобретение также касается способа иммунизации свиньи против M.hyo. Этот способ включает введение свинье иммуногенной композиции, которая содержит растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), где растворимая часть препарата М. hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. В одном варианте воплощения, растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo введенной композиции включает как минимум один антиген протеина М. hyo.

В одном варианте воплощения способа данного изобретения, поливалентную композицию вводят внутримышечно, интрадермально, трансдермально или подкожно. В другом варианте воплощения способа данного изобретения, композицию вводят с однократным введением. В другом варианте воплощения способа данного изобретения, композицию вводят с двукратным введением.

В другом варианте воплощения способа данного изобретения, композицию вводят вместе с как минимум одним дополнительным антигеном, который защищает против микроорганизма, который может вызвать заболевание у свиньи, например, такого как описанные выше. Такие другие антигены могут вводиться параллельно с композицией M.hyo (то есть, в виде отдельных вакцин), или объединяться в готовую к использованию вакцину

В следующем варианте воплощения, композицию вводят свиньям, которые имеют материнские антитела против M.hyo. В следующем варианте воплощения, композицию вводят свиньям, которые имеют материнские антитела против M.hyo и как минимум одного другого микроорганизма, который может вызвать заболевание у свиньи.

В одном варианте воплощения, композицию вводят свиньям возрастом 3 недели или старшим.

Данное изобретение также касается набора. Набор включает флакон, который содержит иммуногенную композицию. Иммуногенная композиция включает растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), где растворимая часть препарата M.hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин. В одном варианте воплощения, набор так же включает инструкцию с информацией относительно введения свинье иммуногенной композиции.

Данное изобретение также касается способа получения иммуногенной композиции данного изобретения. Этот способ включает i) культивирование M.hyo в пригодной среде в течение периода в диапазоне 18-144 часа; ii) потом инактивацию культуры М. hyo; iii) сбор жидкости инактивированной культуры, где жидкость инактивированной культуры содержит цельноклеточный препарат M.hyo, включающий как растворимую жидкую фракцию, так и нерастворимый клеточный материал; iv) отделение растворимой жидкой фракции от нерастворимого клеточного материала; v) существенное удаление как Ig G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин из отделенной растворимой жидкой фракции.

Короткое описание чертежей

Фигура 1 является диаграммой, которая показывает эффективность моновалентных вакцин M.hyo, полученных из антигенов M.hyo из разных обработок (Т02-Т10 описаны в Примере 3) против плацебо (Т01). Результаты представлены как % LS значений поражений легких.

Фигура 2 является диаграммой, которая показывает результаты эффективности антигена PCV2 (ELISA PCV2 антигена) вакцин M.hyo в комбинации с убитым гибридным вирусом PCV тип1-тип2. Гибридный вирус включали в композиции в начальной концентрации 1,6≤RP. Состояние каждого образца выражали как относительную эффективность (RP).

Фигура 3 является диаграммой, которая показывает результаты виремии PCV2 (количественная ПЦР PCV2), наблюдаемые на композициях вакцин PCV/M.hyo, которые используют разные платформы адъювантов.

Фигура 4 является диаграммой, которая показывает серологические результаты ELISA антитела PCV2 (S/P), наблюдаемые на композициях вакцин PCV/M.hyo, которые используют разные платформы адъювантов, на 1-й, 20-й и 42-й дни стимуляции.

Фигура 5 является диаграммой, которая показывает фекальные выделения PCV2, полученные в группах обработки Т02-Т04, описанные в Примере 7, против плацебо (Т01). Результаты выражены как PCV2 ДНК копии/мл.

Фигура 6 является диаграммой, которая показывает назальные выделения PCV2, полученные в группах обработки Т02-Т04, описанных в Примере 7, против плацебо (Т01). Результаты выражены как PCV2 ДНК копии/мл.

Фигуры 7 (А и В) представлены графиками, показывающими результаты теста на интерферон-гамма (IFN-γ), который измеряет PCV2-специфический клеточно-опосредованный (КОИ) иммунный ответ. Результаты после-вакцинации/перед-заражением представлены на Фигуре 7А, и результаты после-вакцинации/после-заражения представлены на Фигуре 7В. Стимулирование 5×106 клеток считалось значительным.

Фигура 8 показывает эффективность M.hyo экспериментальных композиций вакцины PCV2/M.hyo в SP-масло. Показатели легких для композиций M.hyo с обработками Т02-Т08 против плацебо (Т01) изображены графически на Фигуре 8А. Таблица на Фигуре 8В показывает контраст обработок Т02-Т08 по сравнению с плацебо.

Фигура 9 является блок-схемой, которая показывает один вариант воплощения процесса производства, использованного для получения PCV2-совместимого M.hyo антигена, обработанного Протеином-А.

Короткое описание последовательностей

SEQ ID NO: 1 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая кодирует р46 штамма Р-5722 M.hyo;

SEQ ID NO: 2 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует р46 штамма Р-5722 M.hyo; SEQ ID NO: 3 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая кодирует р97 штамма Р-5722 M.hyo;

SEQ ID NO: 4 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует р97 штамма Р-5722 M.hyo; SEQ ID NO: 5 является одним вариантом воплощения геномной последовательности, которая кодирует гибридный вирус PCV1-2;

SEQ ID NO: 6 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая соответствует ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO. 7 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует полипептиду ORF2 цирковируса свиней; SEQ ID NO: 8 является одним вариантом воплощения геномной последовательности, которая кодирует гибридный вирус PCV1-2;

SEQ ID NO: 9 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая соответствует ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO: 10 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует полипептиду ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO: 11 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует полипептиду ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO: 12 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;

SEQ ID NO: 13 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует полипептиду ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO: 14 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 15 является одним вариантом воплощения аминокислотной последовательности, которая соответствует полипептиду ORF2 цирковируса свиней;

SEQ ID NO: 16 является одним вариантом воплощения геномной последовательности невирулентной формы изолята североамериканского вируса PRRS, обозначенного как Р129; и

SEQ ID NO: 17 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая соответствует ORF2 - ORF5 изолята вируса PRRS, обозначенного как ISU-55.

SEQ ID NO: 18 является одним вариантом воплощения нуклеотидной последовательности, которая соответствует ORF6 и ORF7 изолята вируса PRRS, обозначенного как ISU-55.

Детальное описание изобретения

Данное изобретение касается иммуногенной композиции, которая содержит растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (М. hyo), где растворимая часть препарата М. hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. Заявители неожиданно обнаружили, что нерастворимая фракция цельноклеточного препарата M.hyo является неиммуногенной. Напротив, растворимый препарат M.hyo, свободный от Ig G, является иммуногенным и может быть эффективно комбинирован с антигенами другого патогена, такими как PCV2, без аналитической или иммунологической интерференции между антигенами. Это делает растворимый препарат M.hyo эффективной платформой для поливалентных вакцин этого изобретения, включая готовые к использованию препараты в одном флаконе. Заявители также неожиданно обнаружили, что удаление иммуноглобулина и нерастворимых остатков клеток из препарата M.hyo улучшает безопасность иммуногенной композиции.

В описании и формуле использование единичной формы включает также и множественную форму, пока контекст четко не указывает на обратное. Например, термин "антиген протеина" включает множественное число антигенов протеина, включая их смеси.

Как использовано в данном документе, термин "содержит" значит, что композиции и способы включают перечисленные элементы, однако не исключает другие элементы.

Как определено в данном документе, растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo касается растворимой жидкой фракции цельноклеточного препарата M.hyo после отделения нерастворимого материала и существенного удаления Ig G и антиген-связанных иммунокомплексов. Растворимая часть M.hyo может альтернативно означать фракцию супернатанта, культуральный супернатант и т.д. Она включает растворимые протеины, экспрессированные M.hyo (антиген протеина M.hyo), отделенные от или изолированные от нерастворимых протеинов, целые бактерии и другой нерастворимый клеточный материал M.hyo, с использованием обычных способов, таких как центрифугирование, фильтрация или осаждение. Кроме содержания М.hyo-специфических растворимых протеинов, растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo также включает гетерологические протеины, такие как те, которые содержатся в культуральной среде, использованной для ферментации M.hyo.

Термин "антиген" касается соединения, композиции или иммуногенного субстрата, который может стимулировать выработку антител или Т-клеточного ответа, или обоих у животного, включая композиции, которые вводят инъекцией или абсорбируются животными. Иммунный ответ может генерироваться в ответ на всю молекулу или ее часть (например, эпитоп или гаптен).

Как определено в данном документе, "иммуногенная или иммунологическая композиция", касается композиции, которая содержит, по меньшей мере, один антиген, который вызывает иммунологический ответ клеточного и/или антитело-опосредованного происхождения на композицию или вакцину у хозяина.

Термин "иммунный ответ" как использовано в данном документе, касается ответа, вызванного у животного. Иммунный ответ может касаться клеточного иммунитета (КОИ); гуморального иммунитета или может включать оба. Данное изобретение также включает ответ, ограниченный частью иммунной системы. Обычно, "иммунологический ответ" включает, однако не ограничивается одним или несколькими следующими эффектами: выработка или активация антител, В-клеток, хелперов Т-клеток, супрессоров Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, и/или yd Т-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в композицию или вакцину. Желательно, хозяин будет проявлять терапевтический или защитный иммунологический ответ, так что в результате будет улучшена резистентность к новой инфекции и/или уменьшена клиническая тяжесть болезни. Такая защита будет продемонстрирована уменьшением или отсутствием симптомов, которые в норме имеются у инфицированного хозяина, быстрым временем возобновления и/или снижением вирусного титра у инфицированного хозяина.

Как использовано в данном документе, термин "иммуногенность" означает способность вызывать иммунный ответ у животного хозяина против антигена или антигенов. Этот иммунный ответ формирует основу защитного иммунитета, вызванного вакциной против специфического инфекционного организма.

"Адъювант" как использовано в данном документе, означает композицию, которая состоит из одного или больше соединений, которые усиливают иммунный ответ на антиген(ы). Механизм действия адъюванта полностью не известен. Считается, что некоторые адъюванты усиливают иммунный ответ путем медленного высвобождения антигена, в то время как другие адъюванты является сильно иммуногенными сами по себе и действуют синергично.

Как использовано в данном документе, термин "поливалентная" означает вакцину, которая содержит больше чем один антиген одного вида (то есть, разные изоляты Mycoplasma hyopneumoniae), разных видов (то есть, изоляты как Pasteurella hemolytica, так и Pasteurella multocida), или вакцину, которая содержит антигены разного рода (например, вакцина, которая содержит антигены Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus и Clostridium).

Термин "свинья" или "поросенок" как использовано в данном документе, означает животное свиного происхождения, в то время как "свиноматка" касается свиньи женского рода репродуктивного возраста. "Молодая свинья" касается не супороносной свиньи женского рода.

Как использовано в данном документе, термин "вирулентный" означает изолят, который сохраняет способность к инфицированию животного хозяина.

"Инактивированная вакцина" означает композицию вакцины, которая содержит инфекционный организм или патоген, который больше не способен к репликации или росту. Патоген может быть бактериального, вирусного, протозойного или грибкового происхождения. Инактивация может осуществляться различными способами, включая замораживание-оттаивание, химическую обработку (например, обработку тимерозалом или формалином), обработку ультразвуком, облучение, нагревание или любой другой способ, который способен предотвратить репликацию или рост организма, при этом поддерживая его иммуногенность.

Термин "вариант" как использовано в данном документе, касается полипептида или последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который имеет одну или больше консервативных аминокислотных вариаций или других второстепенных модификаций, так что соответствующий полипептид имеет в сущности эквивалентную функцию по сравнению с диким типом полипептида.

"Консервативная вариация" означает замену аминокислотного остатка другим биологически подобным остатком, или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, так что аминокислотный остаток, который кодируется, не изменяется, или является другим биологически подобным остатком. Примеры консервативных вариаций включают замещение одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой гидрофобный остаток, или замещение одного полярного остатка, например, замещение аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, и т.д. Термин "консервативная вариация" также включает применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты, при условии, что антитела, вызванные против замещенного полипептида, также иммунореагируют с незамещенным полипептидом.

Как использовано в данном документе, термины "фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый наполнитель" является взаимозаменяемыми и касаются жидкого наполнителя, который содержит антигены вакцины, которые можно вводить хозяину без побочных эффектов. Пригодные известные в отрасли фармацевтически приемлемые носители включают, однако не ограничиваются следующими: стерильная вода, солевой раствор, глюкоза, декстроза или забуференные растворы. Носители могут включать вспомогательные агенты, включая, однако не ограничиваясь следующими: разбавители, стабилизаторы (то есть, сахара и аминокислоты), консерванты, смачиватели, эмульгаторы, pH буферные агенты, добавки, которые улучшают вязкость, красители и т.д.

Как использовано в данном документе, термин "композиция вакцины" включает по меньшей мере, один антиген или иммуноген в фармацетивчно приемлемом наполнителе, пригодном для вызывания иммунного ответа у хозяина. Композиции вакцины могут быть введены в дозировках и с помощью способов хорошо известных специалистам в отрасли медицины или ветеринарии, принимая во внимание такие факторы как возраст, пол, масса, вид и состояние животного реципиента, и путь введения. Путь введения может быть чрезкожный, введение в слизистую (например, оральное, назальное, анальное, влагалищное) или парентеральное (интрадермальное, трансдермальное, внутримышечное, подкожное, внутривенное или интраперитонеальное). Композиции вакцины могут быть введены отдельно, или вместе или последовательно с другими обработками или терапиями. Формы введения могут включать суспензии, сиропы или эликсиры, и препараты для парентерального, подкожного, интрадермального, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъективное введение), такие как стерильные суспензии или эмульсии. Композиции вакцины могут быть введены как спрей или подмешаны к еде и/или воде, или доставлены в смеси с пригодным носителем, растворителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, солевой физраствор, глюкоза, и т.д. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачиватели или эмульгаторы, pH буферные агенты, адъюванты, гелеобразователи или добавки, которые улучшают вязкость, консерванты, ароматизаторы, красители, и т.д., в зависимости от пути введения и желаемого препарата. Стандартные фармацевтические пособия, такие как "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990 могут приниматься во внимание при приготовлении пригодных препаратов, избегая ненужных экспериментов.

"Североамериканский вирус PRRS" означает любой вирус PRRS с генетическими характеристиками, связанными с изолятом североамериканского вируса PRRS, таким как, однако не ограничиваясь вирусом PRRS, впервые изолированным в США в начале 1990-х (смотреть, например, Collins, J. Е., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); изолятом североамериканского вируса PRRS MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); штаммом вируса PRRS Quebec LAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); и изолятом североамериканского вируса PRRS VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Дополнительные примеры штаммов североамериканского вируса PRRS описаны в данном документе. Генетические характеристики касаются геномного сходства нуклеотидной последовательности и сходства аминокислотной последовательности штаммов североамериканского вируса PRRS. Штаммы китайского вируса PRRS обычно имеют приблизительно 80-93% сходства нуклеотидной последовательности с североамериканскими штаммами.

"Европейский вирус PRRS" касается любого штамма вируса PRRS с генетическими характеристиками, связанными с вирусом PRRS впервые изолированным в Европе приблизительно в 1991 (смотреть, например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130). "Европейский вирус PRRS" также иногда в отрасли называют "вирусом Lelystad". Примеры штаммов Европейского вируса PRRS описаны в данном документе.

Генетически модифицированный вирус является "аттенуированным", если он является менее вирулентным, чем его немодифицированный родительский штамм. Штамм является "менее вирулентным", если он показывает статистически значимое уменьшение одного или больше параметров, которые определяют тяжесть болезни. Такие параметры могут включать уровень виремии, лихорадку, тяжесть респираторного расстройства, тяжесть репродуктивных симптомов или количество или тяжесть поражений легких, и т.д.

"Инфекционный клон" являются изолированным или клонированным геномом агента заболевания (например, вируса), который может быть специфически и преднамеренно модифицирован в лаборатории, и потом использован для возобновления живого генетически модифицированного организма. Живой генетически модифицированный вирус, полученный из инфекционного клона, может быть применен в живой вирусной вакцине. Альтернативно, вакцины с инактивированным вирусом могут быть получены путем обработки живого вируса, полученного из инфекционного клона, инактивирующими агентами, такими как формалин или гидрофобные растворители, кислоты, и т.д., облучением ультрафиолетом или Х-лучами, нагреванием, и т.д.

Все имеющиеся на данное время вакцины M.hyo и комбинированные вакцины M.hyo получены из убитых цельноклеточных препаратов микоплазм (бактерины). Напротив, данное изобретение применяет растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) для комбинирования с антигенами PCV2 и PRRS, где растворимая часть препарата M.hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину.

M.hyo имеет абсолютные требования к экзогенному стерину и жирным кислотам. Эти требования обычно являются необходимыми для роста M.hyo в среде, которая содержит сыворотку, такую как свиная сыворотка. Отделение нерастворимого материала от растворимой части цельноклеточного препарата M.hyo (например, центрифугированием, фильтрацией или осаждением) не удаляет свиной Ig G или иммунные комплексы. В одном варианте воплощения данного изобретения, растворимая часть M.hyo обрабатывается протеином-А или протеином-G для значительного удаления Ig G и иммунных комплексов, которые содержатся в культуральном супернатанте. В этом варианте воплощения, понятно, что обработка протеином А осуществляется после ферментации M.hyo. Она в данном документе альтернативно называется даунстрим обработка протеином А. В другом варианте воплощения, может быть применена апстрим обработка ростовой среды протеином А (то есть, перед ферментацией M.hyo). Протеин А связывается из Fc частью Ig G. Протеин G связывается преимущественно из Fc частью Ig G, однако также может связываться и с Fab участком. В отрасли известны способы очистки/удаления общего Ig G из неочищенной смеси протеинов, такой как культуральный супернатант ткани, сыворотка и свободная жидкость брюшной полости.

В некоторых вариантах воплощения, растворимая часть препарата M.hyo включает по меньшей мере, один антиген протеина M.hyo. В других вариантах воплощения, растворимая часть препарата M.hyo включает два или больше антигена протеина M.hyo.

В одном варианте воплощения, фракция супернатанта M.hyo включает один или больше следующих специфических антигенных протеинов M.hyo: протеины M.hyo приблизительно молекулярной массы 46 кД (р46), 64 кД (р64) и 97 кД (р97). В другом варианте воплощения, фракция супернатанта включает по меньшей мере р46, р64 и р97 антигенные протеины M.hyo. Протеин M.hyo приблизительно 64 кД (р64) альтернативно называется в данном документе р65 поверхностный антиген M.hyo, описанный Kim et al. [Infect. Immun. 58(8):2637-2643 (1990)], а также в патенте США №5,788,962.

Futo et al. описали клонирование и характеристику поверхностного протеина M.hyo с массой 46 кД, который может быть применен в композициях данного изобретения [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. В одном варианте воплощения, M.hyo культуральный супернатант включает р46, чьи соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности штамма Р-5722 показаны в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Также считается, что варианты таких последовательностей р46 могут быть применены в композициях данного изобретения, как описано ниже.

Zhang et al. описали и охарактеризовали адгезин протеин р97 из M.hyo [Infect. Immun. 63: 1013-1019, 1995]. Кроме этого, King et al. описали протеин массой 124 кД, который называется Mhp1 из штамма Р-5722 M.hyo, и представленные данные предусматривают, что Mhp1 и р97 является одинаковыми протеинами [Vaccine 15:25-35 (1997)]. Такие протеины р97 могут быть применены в композициях этого изобретения. В одном варианте воплощения, культуральный супернатант M.hyo включает р97, чьи соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности штамма Р-5722 показаны в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Также считается, что варианты таких последовательностей могут быть применены в композициях данного изобретения, как описано ниже.

M.hyo культуральный супернатант также может включать специфические антигенные протеины M.hyo такие как, однако не ограничиваясь, протеинами с молекулярной массой приблизительно 41 кД (р41), 42 кД (р42), 89 кД (р89) и 65 кД (р65). Смотреть, Okada et al., 2000, J. Vet. Med. В 47:527-533 и Kim et al., 1990, Infect. Immun. 58(8):2637-2643. Кроме этого, M.hyo культуральный супернатант может содержать специфические антигенные протеины M.hyo с молекулярной массой приблизительно 102 кД (р102) и 216 кД (р216). Смотреть патенты США №6,162,435 и 7,419,806 Minnion et al.

Любой штамм M.hyo может быть использован в качестве исходного материала для получения растворимой части препарата композиций M.hyo данного изобретения. Приемлемые штаммы M.hyo могут быть получены из коммерческих или академических источников, включая депозитарии, такие как Культуральная Коллекция Американского Типа (АТСС) (Manassas, Va.) и Культуральная Коллекция NRRL (Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, III.). Только АТСС приводит шесть следующих штаммов M.hyo для продажи: M.hyo АТСС 25095, M.hyo АТСС 25617, M.hyo АТСС 25934, M.hyo АТСС 27714, M.hyo АТСС 27715 и M.hyo АТСС 25934D. Желаемый штамм M.hyo для применения в вариантах воплощения этого изобретения идентифицировано как штамм Р-5722-3, АТСС #55052, депонированный 30.05.1990, в соответствии с правилами доступности патентного ведомства США. Учитывая широкую распространенность болезни, штаммы также могут быть получены путем возобновления M.hyo из секретов легких или тканей свиней, инфицированных известными штаммами, которые вызывают атипическую пневмонию у свиней.

Специалист в отрасли понимает, что варианты последовательностей M.hyo могут быть применены в композициях данного изобретения. Такие варианты могут отличаться где-то на 10-20% идентичности последовательности и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают их пригодными для иммуногенных композиций. Желательно, варианты M.hyo имеют по меньшей мере 80%, желательно по меньшей мере 85%, более желательно по меньшей мере 90%, еще более желательно по меньшей мере 95% идентичности последовательности с непроцессированной геномной последовательностью штамма дикого типа M.hyo. Антигенные характеристики иммунологической композиции могут быть, например, оценены в экспериментах заражения, как показано в Примерах. Более того, антигенная характеристика модифицированного антигена M.hyo еще сохраняется, когда модифицированный антиген предоставляет по меньшей мере 70%, желательно 80%, более желательно 90% защитного иммунитета, по сравнению с протеином дикого типа M.hyo.

В одном варианте воплощения, растворимый р46 антиген M.hyo является включенным в композициях изобретения в конечной концентрации от приблизительно 1,5 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл, желательно от приблизительно 2 мкг/мл до приблизительно 6 мкг/мл. Указано, что р46 является протеином, использованным для теста на активность M.hyo (смотреть секцию Примеры ниже). В другом варианте воплощения, антиген M.hyo может быть включенным в композициях в конечной концентрации от приблизительно 5,5% до приблизительно 35% супернатанта обработанной протеином-А культуры M.hyo.

Растворимый препарат M.hyo данного изобретения является как безопасным, так и эффективным против M.hyo, и является пригодным для одноразового введения. Кроме этого, заявители неожиданно обнаружили, что растворимый препарат M.hyo может быть эффективно комбинирован с антигенами другого патогена, включая PCV2, без иммунологической интерференции антигенов. Это делает растворимый препарат M.hyo эффективной платформой для поливалентных вакцин, включая комбинированную вакцину PCV2/M.hyo этого изобретения. PCV2 антиген может быть введен одновременно с композицией M.hyo (то есть, как две отдельных одиночных вакцины), однако желательно растворимый препарат M.hyo объединяют с антигеном PCV2 в готовую к использованию жидкую композицию.

В одном варианте воплощения, иммуногенные композиции PCV2/M.hyo данного изобретения включают, по меньшей мере, один дополнительный антиген. В одном варианте воплощения, по меньшей мере, один дополнительный антиген защищает от микроорганизма, который может вызывать заболевание у свиней.

В некоторых вариантах воплощения, по меньшей мере, один дополнительный антиген защищает от бактерий, вирусов или простейших, которые могут вызывать заболевание у свиней. Примеры таких микроорганизмов включают, однако не ограничиваются следующими: цирковирус свиней тип 2 (PCV2), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), парвовирус свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, лептоспиры, Lawsonia intracellulars, вирус свиного гриппа (SIV), антиген Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, респираторный коронавирус свиней, вирус эпизоотической диареи свиней (PED), ротавирус, вирус гепатита (TTV), цитомегаловирус свиней, энтеровирусы свиней, вирус энцефаломиокардита, патоген, который вызывает болезнь Ауески, классическая свиная лихорадка (CSF) и патоген, который вызывает трансмиссивный гастроэнтерит свиней, или их комбинации.

В одном варианте воплощения, иммуногенная композиция данного изобретения включает комбинацию как минимум одного растворимого антигена M.hyo (например, два или больше) и антигена PCV2. В другом варианте воплощения, композиция вызывает защитный иммунный ответ у свиньи против как M.hyo, так и PCV2.

В одном варианте воплощения, комбинированная вакцина PCV2/M.hyo данного изобретения обеспечивается как готовая к использованию вакцина в одном флаконе. Такая готовая к использованию комбинированная вакцина не нуждается в смешивании отдельных вакцин, таким образом, не имеет риска загрязнения или дополнительных рабочих расходов, связанных со смешиванием, и не имеет потребность в использовании смеси в течение нескольких часов. Также, комбинированная вакцина PCV2/M.hyo в одном флаконе на половину уменьшает расходы и место для хранения в рефрижераторе. Более того, одноразовое введение исключает роботу, связанную с введением второй дозы животному. Указано, что хотя в данное время существуют комбинированные вакцины PCV2/M.hyo, они поставляются в виде готовой к использованию вакцины с двумя дозами (Circumvent®PCVM) или вакцины в 2-х флаконах с одной дозой, которая требует одновременного введения отдельных вакцин (наприклад, Ingelvac CircoFLEX® и Ingeivac MycoFLEX®). Желательно, комбинация PCV2/M.hyo данного изобретения является совместимой с другими антигенами, такими як антиген вируса PRRS, так что все антигены могут быть введены с одной дозой.

В некоторых вариантах воплощения, антигенный компонент PCV2 комбинированной вакцины PCV2/M.hyo находится в форме цирковируса гибридного типа-1-типа 2. Гибридный вирус включает инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, экспрессирующий ORF2 протеин цирковируса свиней типа 2. Гибридные цирковирусы свиней и способы их получения описаны в WO 03/049703 А2, а также в патентах США 7,279,166 и 7,575,752, включенных в данный документ с помощью ссылок.

В одном варианте воплощения, непроцессированная последовательность ДНК генома гибридного вируса PCV1-2 соответствует SEQ ID NO: 5 или ее вариантам, как описано ниже. В другом варианте воплощения, иммуногенный ORF2 капсидный ген гибридного вируса PCV1-2 соответствует SEQ ID NO: 6. В следующем варианте воплощения, аминокислотная последовательность иммуногенного ORF2 протеина, которая экспрессируется гибридным вирусом PCV1-2, соответствует SEQ ID NO: 7.

В одном варианте воплощения, непроцессированная последовательность ДНК генома гибридного вируса PCV1-2 соответствует SEQ ID NO: 8. В одном варианте воплощения, иммуногенный ORF2 капсидный ген гибридного вируса PCV1-2 соответствует SEQ ID NO: 9. В следующем варианте воплощения, аминокислотная последовательность иммуногенного ORF2 протеина, которая экспрессируется гибридным вирусом PCV1-2 соответствует SEQ ID NO: 10.

Однако, ДНК ORF2 PCV2 и протеин гибридного вируса PCV1-2 не ограничены вышеописанными последовательностями, ввиду того, что ДНК ORF2 PCV2 и протеин является высоко консервативным доменом изолятов PCV2.

В некоторых вариантах воплощения, антигенный компонент PCV2 комбинированной вакцины M.hyo/PCV2/PRRS находится в форме рекомбинантного протеина ORF2. В одном варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 экспрессируется бакуловирусным вектором. Альтернативно, могут быть использованы другие известны векторы экспрессии, такие как, однако не ограничиваясь, парапокс векторами.

В одном варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 PCV2 имеет последовательность SEQ ID NO: 11, которая кодируется SEQ ID NO: 12 (номер доступа в банке генов AF086834). В другом варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 имеет последовательность SEQ ID NO: 13, которая кодируется SEQ ID NO: 14. В другом варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 соответствует SEQ ID NO: 15. В другом варианте воплощения, рекомбинантный протеин PCV2 ORF2 соответствует SEQ ID NO: 7. В следующем варианте воплощения, рекомбинантный протеин PCV2 ORF2 соответствует SEQ ID NO: 10.

Однако, дано изобретение не ограниченно определенной ДНК ORF2 и вышеописанными последовательностями протеина. Ввиду того, что ДНК ORF2 PCV2 и протеин является высоко консервативным доменом изолятов PCV2, любой ORF2 PCV2 должен быть эффективным в качестве источника ДНК ORF2 PCV2 и/или полипептида, использованных в гибридном вирусе PCV1-2 или в рекомбинантном протеине PCV2.

Примером пригодного PCV2 изолята, из которого может происходить ДНК ORF2 PCV2 и последовательности протеина, является PCV2 изолят номер 40895 (депонируемый в АТСС 07,12,2001 и имеет АТСС обозначения патентного депозита РТА-3914). Геномная (нуклеотидна) последовательность изолята PCV2 номер 40895 является доступной под номером доступа в банке генов AF264042. Другие примеры пригодных PCV2 изолятов, из которых могут происходить ДНК ORF2 PCV2 и последовательности протеина, включают, однако не ограничиваются следующими: Imp.999, Imp.1010-Stoon, Imp.1011-48121, и Imp.1011-48285. Номера доступа в банке генов геномных последовательностей, которые отвечают этим PCV2 изолятам, включают AF055391, AF055392, AF055393 и AF055394, соответственно.

В некоторых формах, иммуногенные части протеина ORF2 PCV2 использованы в качестве антигенного компонента в композиции. Например, усеченные и/или замещены формы или фрагменты протеина ORF2 PCV2 могут быть применены в композициях данного изобретения.

Специалист в отрасли понимает, что варианты последовательностей PCV2 могут быть применены в композициях данного изобретения. Такие варианты могут отличаться на приблизительно 10-20% идентичности последовательности и все же сохранять антигенные характеристики, которые делают их пригодными для иммуногенных композиций. Желательно, PCV2 варианты имеют по меньшей мере 80%, желательно по меньшей мере 85%, более желательно по меньшей мере 90%, еще более желательно по меньшей мере 95% идентичности последовательности с непроцессированной геномною последовательностью дикого типа изолята PCV2. Антигенные характеристики иммунологической композиции могут быть, например, оценены по эксперименту заражения, приведенному в секции Примеры. Более того, антигенная характеристика модифицированного антигена PCV2 все еще сохраняется, когда модифицированный антиген вызывает по меньшей мере 70%, желательно 80%, более желательно 90% защитного иммунитета по сравнению с дикими типом протеина ORF2 PCV2.

Антигенный компонент PCV2 обеспечивается в иммуногенной композиции на уровне включения антигена, эффективном для вызывания желаемого иммунного ответа, а именно, снижение заболеваемости или уменьшение тяжести клинических признаков, после инфекции PCV2.

В одном варианте воплощения, гибридный вирус PCV1-2 включен в композициях изобретения на уровне по меньшей мере 1,0≤RP≤5,0, где RP является единицей относительной активности, определенной с помощью количественного анализа антигена ELISA (тест на активность in vitro) по сравнению с контрольной вакциной. В другом варианте воплощения, гибридный вирус PCV1-2 включен в композициях изобретения в конечной концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% 20-раз (20Х) концентрированной массы PCV1-2 антигена.

В другом варианте воплощения, рекомбинантный протеин ORF2 PCV2 включен в композициях изобретения на уровне по меньшей мере 0,2 мкг антиген/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл). В следующем варианте воплощения, уровень включения рекомбинантного протеина ORF2 PCV2 составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 400 мкг/мл. В другом варианте воплощения, уровень включения рекомбинантного протеина ORF2 PCV2 составляет от приблизительно 0,3 до приблизительно 200 мкг/мл. В следующем варианте воплощения, уровень включения рекомбинантного протеина ORF2 PCV2 составляет от приблизительно 0,35 до приблизительно 100 мкг/мл. В другом варианте воплощения, уровень включения рекомбинантного протеина ORF2 PCV2 составляет от приблизительно 0,4 до приблизительно 50 мкг/мл.

В одном варианте воплощения, трехвалентная иммуногенная композиция данного изобретения включает комбинацию, по меньшей мере, одного растворимого антигена M.hyo (например, два или больше) и антигена цирковируса свиней типа 2 (PCV2), а также антигена вируса PRRS изобретения. В другом варианте воплощения, композиция вызывает защитный иммунный ответ у свиньи против M.hyo, PCV2 и вируса PRRS.

В одном варианте воплощения, комбинированная вакцина PCV2/M.hyo/PRRS обеспечивается в виде вакцины с одной дозой в 2-х флаконах. Например, в некоторых вариантах воплощения, комбинация PCV2/M.hyo обеспечивается как стабильная жидкая композиция в первом флаконе, и вирус PRRS обеспечивается в лиофилизированном состоянии во втором флаконе. В некоторых вариантах воплощения, дополнительные свиные антигены могут быть прибавлены как к первому, так и ко второму флакону.

В одном варианте воплощения, вирусный компонент PRRS обеспечивается в виде лиофилизированного генетически модифицированного живого вируса. Перед введением, жидкость PCV2/M.hyo из первого флакона может быть использована для регидратации вируса PRRS во втором флаконе, так что все три антигена могут быть введены животному в одной дозе. Обращаем внимание на то, что хотя комбинированные вакцины PCV2/M.hyo/PRRS существуют на данное время, они обеспечиваются в виде вакцины с одной дозой в 3-х флаконах, что требует одновременного введения трех отдельных вакцин (например, Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® и Ingelvac®PRRS MLV).

Этиологический агент PRRS впервые изолировали в Нидерландах, и назвали вирусом Lelystad. Этот вирус описан в WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Изолят Европейского вируса PRRS депонирован в институте Пастера в Париже, под номером 1-1102. Североамериканский тип изолирован практически одновременно с европейским вирусом, и описан в WO-93/03760 (Collins et al.) Изолят североамериканского типа вируса депонирован в коллекции культур американского типа (АТСС), под номером VR-2332.

Были изолированы разные штаммы как из европейского, так и из североамериканского типа вируса. WO 93/07898 (Akzo) описывает европейский штамм и вакцины, которые происходят от него, депонируемый в CNCM (институт Пастера), под номером 1-1140. Также, WO 93/14196 (Rhone-Merieux) описывает новый штамм, изолированный во Франции, депонируемый в CNCM (институт Пастера), под номером I-1153. Более того, ЕР 0595436 B1 (Solvay) описывает новый североамериканский тип штамма, более вирулентный, чем тот, что был описан сначала, и его вакцины. Этот штамм депонируется в АТСС, однако номер депонирования не указан в патентной заявке. Кроме того, ES 2074950 ВА (Cyanamid Iberica) и его эквивалент GB 2282811 В2 описывают так называемый "Испанский штамм", который отличается от европейского и североамериканского штаммов. Этот "Испанский штамм" депонируется в европейской коллекции культур клеток животных (ЕАССС), под номером V93070108.

Пригодные антигены вируса PRRS для применения в композициях PCV2/M.hyo/PRRS данного изобретения включают изоляты североамериканского вируса PRRS, штаммы китайского вируса PRRS, и штаммы европейского вируса PRRS, а также генетически модифицированные версии таких изолятов/штаммов. В одном варианте воплощения, антигенный компонент вируса PRRS, примененный в композициях данного изобретения, является североамериканским вирусом PRRS.

В некоторых вариантах воплощения, антигенный компонент вируса PRRS, примененный в композициях этого изобретения, является изолятом североамериканского вируса PRRS, обозначенным как Р129 или его живой генетически модифицированной версией. Желательно, генетически модифицированный вирус PRRS не способен продуцировать патогенную инфекцию, однако способен вызывать иммунный защитный ответ против инфекции, вызванной диким типом вируса PRRS.

Генетически модифицированный вирус PRRS для применения в композициях изобретения может быть получен из инфекционного клона. Получение инфекционного кДНК клона изолята североамериканского вируса PRRS, обозначенного Р129, описано в патенте США 6,500,662, который включен с помощью ссылок. Последовательность кДНК Р129 описана в банке генов под номером доступа AF494042 и в патенте США №6,500,662.

В одном варианте воплощения, нуклеотидная последовательность невирулентной формы Р129, для применения в композициях данного изобретения, представлена SEQ ID NO: 16. Однако, данное изобретение не ограниченно этой последовательностью. Эта последовательность и последовательности других невирулентных форм Р129 описаны в международной заявке PCT/IB 2011/055003, поданной 09.11.2011, содержание которой (включая любые национальные заявки, поданные в США, на основе этой международной заявки) включено в данный документ с помощью ссылок. Желательно, вирус PRRS является модифицированным для предотвращения даун-регулирования интерферон-опосредованной функции.

В других вариантах воплощения, антигенный компонент вируса PRRS, примененный в композициях изобретения, является вирусным изолятом PRRS обозначенным как ISU-55. Изолят ISU-55 депонирован в коллекции культур американского типа (АТСС), под номером доступа VR2430. Нуклеотидная последовательность генов ORF2 - ORF5 изолята ISU-55 представлена SEQ ID NO: 17. Нуклеотидна последовательность генов ORF6 и ORF7 изолята ISU-55 представлена SEQ ID NO: 18.

Другим пригодным изолятом североамериканского вируса PRRS, который можно использовать в композициях, является ISU-12, депонированный в АТСС под номерами доступа VR2385 [3 × очищен от тромбоцитов] и VR2386 [неочищенный от тромбоцитов]. Другие пригодные североамериканские вирусы PRRS, которые могут быть применены в композициях этого изобретения, представлены: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 и ISU-79, депонированные в АТСС под номерами доступа VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 и VR2474, соответственно. Генетически модифицированные версии любого из этих изолятов ISU могут быть применены в композициях этого изобретения. Эти ISU изоляты и изолят ISU-55, детально описанные в патентах США Paul, et al: US 5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 и 7,517,976, все включены в данный документ с помощью ссылок.

В других вариантах воплощения, антигенным компонентом вируса PRRS, примененным в композициях данного изобретения, является североамериканский тип, депонированный в коллекции культур американского типа (АТСС) под номером VR-2332, или его генетически модифицированная версия. Например, вирус PRRS может быть модифицированным живым вирусом на основе изолята, идентифицированного как АТСС VR2332, который применяют в INGELVAC® PRRS ATP и INGELVAC® PRRS MLV, производства Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.

В других вариантах воплощения, антигенный компонент вируса PRRS, применный в композициях данного изобретения, является изолятом Европейского вируса PRRS или вирусом Lelystad или его генетически модифицированной версией. Пример пригодного штамма вируса PRRS идентифицирован как депонируемый под номером №I-1102, описанный выше. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, отвечающие номеру депонирования I-1102, описанные в патенте США №5,620,691 Wensvoort et al, включенном в данный документ с помощью ссылок. Получение инфекционного клонам изолята Европейского вируса PRRS или вируса Lelystad описано в патенте США №6,268,199, включенном в данный документ с помощью ссылок.

Другие примеры пригодных изолятов вируса PRRS включают, однако не ограничиваются описанными выше. Также, живые генетически модифицированные версии изолятов вируса PRRS могут быть применены в композициях данного изобретения. Инфекционные клоны могут быть использованы для восстановления таких живых генетически модифицированных организмов.

Специалист в отрасли понимает, что варианты последовательности вируса PRRS могут быть применены в композициях данного изобретения. Такие варианты могут отличаться практически на 10-20% идентичности последовательности, и все же хранить антигенные характеристики, которые делают их пригодными для иммуногенных композиций. Желательно, варианты вируса PRRS имеют по меньшей мере 80%, желательно по меньшей мере 85%, более желательно по меньшей мере 90%, еще более желательно по меньшей мере 95% идентичности последовательности с непроцессированной геномною последовательностью изолята дикого типа вируса PPRS. Антигенные характеристики иммунологической композиции могут быть, например, оценены экспериментами заражения. Более того, антигенная характеристика модифицированного антигена вируса PRRS все еще сохраняется, когда модифицированный антиген вызывает, по меньшей мере, 70%, желательно 80%, более желательно 90% защитного иммунитета, по сравнению с диким типом антигена вируса PRRS.

В одном варианте воплощения, антигенный компонент вируса PRRS является генетически модифицированным живым вирусом, который включен в композициях изобретения на уровне по меньшей мере 2,1 ≤ TCID50 ≤ 5,2, где TCID50 означает 50% инфекционной дозы культуры тканей, определенной подсчетом количества антигена (тест на активность in vitro).

Антигенный компонент PCV2 композиции изобретения PCV2/M.hyo/PRRS может находиться в форме гибридного цирковируса типа-1-типа 2, гибридного вируса, включая инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, экспрессирующий ORF2 протеин цирковируса свиней типа 2. В другом варианте воплощения, антигенный компонент PCV2 композиции изобретения PCV2/M.hyo/PRRS находится в форме рекомбинантного протеина ORF2.

Пригодные PCV2 антигены для применения в композиции PCV2/M.hyo/PRRS могут происходить от любого изолята PCV2, описанного выше, а также других PCV2 изолятов. Пригодные PCV2 антигены для применения в композициях изобретения включают, однако не ограничиваются следующими: описанные выше PCV2 последовательности и их варианты.

Вакцины данного изобретения формулируют согласно принятой конвенции с включением приемлемых носителей для животных, включая людей (в случае необходимости), таких как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или солюбилизаторы, а также формулируют для содействия постоянному высвобождению. Разбавители включают воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин, и т.д. Добавки для изотоничности включают хлорид натрия, декстрозу, манитол, сорбитол и лактозу, и т.д. Стабилизаторы включают альбумин, и т.д. Другие пригодные наполнители вакцин и добавки, включая приемлемые для модифицированных живых вакцин, являются известными и очевидными для специалиста в отрасли. Смотреть, например, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, включенную в данный документ с помощью ссылок.

Вакцины данного изобретения могут также содержать один или больше дополнительных иммуномодуляторов, таких как, например, адъювант или цитокин, и т.д. Виды пригодных адъювантов для применения в композициях данного изобретения включают следующие: адъювант масло в воде, полимерный и водный адъювант, адъювант вода в масле, адъювант гидроксид алюминия, адъювант витамин Е и их комбинации. Некоторые конкретные примеры адъювантов включают, однако не ограничиваются следующими: полный адъювант Фройнда, неполный адъювант Фройнда, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, гель гидроксида алюминия, глюкан, декстрин сульфат, оксид железа, альгинат натрия, бакто-адъювант, определенные синтетические полимеры, такие как полиаминокислоты и сополимеры аминокислот, блок-сополимеры (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® адъювант, сапонин, Quil А или другие фракции сапонина, монофосфорит липид А, и Avridine липид-амин адъювант (N,N-диоктадецил-N',N'-- бис(2-гидроксиэтил) - пропандиамин), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), керосин, система адъювантов RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), мурамил дипептид и т.д.

Неограниченные примеры эмульсии масло в воде, пригодные для вакцины изобретения, включают модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированная SEAM62 является эмульсией масло в воде, которая содержит 5% (о./о.) сквалена (Sigma), 1% (о./о.) SPAN® 85 детергента (ICI поверхностно активные вещества), 0,7% (о./о.) TWEEN® 80 детергента (ICI поверхностно активные вещества), 2,5% (о./о.) этанола, 200 мкг/мл Quil А, 100 мкг/мл холестерина, и 0,5% (о./о.) лецитина. Модифицированная SEAM 1/2 является эмульсией масло в воде, которая содержит 5% (о./о.) сквалена, 1% (о./о.) SPAN® 85 детергента, 0,7% (о./о.) Tween 80 детергента, 2,5% (о./о.) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина.

Другим примером адъюванта, пригодного в композициях изобретения, является SP-масло. В описании и формуле, термин "SP масло" означает масляную эмульсию, которая содержит блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен, сквалан, полиоксиэтилен сорбитан моноолеат и забуференный солевой раствор. Блок-сополимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилен являются поверхностно-активными веществами, которые помогают суспендировать твердые вещества и жидкие компоненты. Эти поверхностно-активные вещества имеются на рынке в виде полимеров под торговой маркой Pluronic®. Желаемыми поверхностно-активными веществами являются полоксамер 401, присутствующий на рынке под торговой маркой Pluronic® L-121. В целом, эмульсия SP масло является иммуностимулирующей смесью адъювантов, которая содержит приблизительно 1-3% о./о. блок-сополимера, приблизительно 2-6% о./о. сквалана, в частности приблизительно 3-6% сквалана, и приблизительно 0,1-0,5% о./о. полиоксиэтилен сорбитан моноолеата, с остатком, представленным забуференным солевым раствором. В одном варианте воплощения, эмульсия SP-масло находится в конечной композиции в о./о. количестве приблизительно 1% - 25%, желательно приблизительно 2% - 15%, более желательно приблизительно 5% - 12% о./о.

В другом примере, пригодным адъювантом для применения в композициях изобретения является AMPHIGEN™ адъювант, который состоит из обезжиренного лецитина, растворенного в масле, обычно легком жидком вазелиновом масле.

Другие примеры адъювантов, пригодных в композициях изобретения, включают следующие пропиретарные адъюванты: Microsol Diluvac Forte® duel система эмульсия адъювант, Emunade адъювант, и Xsolve адъювант. Как Emunade, так и Xsolve адъюванты является эмульсиями легкого минерального масла в воде, однако Emunade также содержит альгидрогель, а d.I-α-токоферил ацетат является частью XSolve адъюванта. Еще один пример пригодного адъюванта для применения в композициях изобретения включает ImpranFLEX™ адъювант (адъювант вода в масле). Еще один пример пригодного адъюванта включает адъювант на основе Carbomer (Carbopol®). Желаемые Carbopol® адъюванты включают полимер Carbopol® 934 и полимер Carbopol®941.

В одном варианте воплощения, адъювант или смесь адъювантов добавляют в количестве приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу. В другом варианте воплощения, адъювант/смесь адъювантов добавляют в количестве от приблизительно 200 мкг до приблизительно 5 мг на дозу. В одном варианте воплощения, адъювант/смесь адъювантов добавляют в количестве от приблизительно 300 мкг до приблизительно 1 мг/дозу.

Адъювант или смесь адъювантов обычно присутствуют в композиции вакцины изобретения в о./о количестве приблизительно 1% - 25%, желательно приблизительно 2% - 15%, более желательно приблизительно 5% - 12% о./о.

Другие "иммуномодуляторы", которые могут быть включены в вакцину, включают, например, один или больше интерлейкинов, интерферонов или других известных цитокинов. В одном варианте воплощения, адъювант может означать производную циклодекстрина или полианионный полимер, такие как описанные в патентах США 6,165,995 и 6,610,310, соответственно.

Следующий аспект касается способа получения иммуногенной композиции данного изобретения. Этот способ включает i) культивирование M.hyo в пригодной среде в течение периода в диапазоне 18-144 часа; ii) потом инактивацию культуры М.hyo; iii) сбор жидкости инактивированной культуры, где жидкость инактивированной культуры содержит цельноклеточный препарат M.hyo, включающий как растворимую жидкую фракцию, так и нерастворимый клеточный материал; iv) отделение растворимой жидкой фракции от нерастворимого клеточного материала; v) существенное удаление как Ig G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин из отделенной растворимой жидкой фракции с образованием растворимой части цельноклеточного препарата M.hyo; и vi) последующее объединение растворимой части цельноклеточного препарата M.hyo с антигеном PCV2.

Примером пригодной среды для культивирования M.hyo является PPLO бульон (бульонная основа Mycoplasma), который при дополнении питательными элементами, используют для удаления и культивирования Mycoplasma.

В некоторых вариантах воплощения, культуру M.hyo выращивают до поздней логарифмической фазы роста, после чего культуру инактивируют. В некоторых других вариантах воплощения, культуру инактивируют увеличением pH (например, до приблизительно 7,8). Это осуществляют путем обработки культуры инактивирующим агентом, таким как бинарный этиленимин (BEI). BEI получают in situ в течение инкубации L-бромэтиламин гидробромида (ВЕА) в культуре. Потом, pH инактивированной культуры нейтрализуют, например, добавлением эквивалентного количества агента, который нейтрализует агент инактивации в растворе. В некоторых вариантах воплощения, агентом инактивации является BEI, а нейтрализующим агентом является тиосульфат натрия. В одном варианте воплощения, pH инактивированной культуры доводили до приблизительно 7,4 добавлением тиосульфата натрия.

В некоторых вариантах воплощения, растворимую жидкую фракцию цельноклеточного препарата M.hyo отделяли от нерастворимого клеточного материала, используя обычные способы. В одном варианте воплощения, это разделение осуществляли фильтрацией. В другом варианте воплощения, это разделение осуществляли центрифугированием. В другом варианте воплощения, это разделение осуществляли осаждением.

В одном варианте воплощения, растворимую жидкую фракцию инактивированного, нейтрализованного цельноклеточного препарата M.hyo обрабатывали Протеин А смолой для значительного удаления как Ig G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин. В другим вариантах воплощения, Протеин G смола может быть использована для значительного удаления как Ig G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин, которые содержатся в растворимой жидкой фракции. Способы удаления как Ig G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин Протеин А или Протеин G смолами хорошо известны в отрасли.

Согласно следующему аспекту, способ получения поливалентной иммуногенной композиции данного изобретения включает приготовление растворимого M.hyo антигена как описано выше, и его смешивание из PCV2 антигеном, пригодным адъювантом, и одним или больше фармацевтически приемлемым носителем. Этот способ необязательно включает добавление, по меньшей мере, одного дополнительного свиного антигена, такого как, но не ограничиваясь, антигеном вируса PRRS, как описано выше.

Следующий аспект данного изобретения касается набора. "Набор" касается многих компонентов, сгруппированных вместе. В одном варианте воплощения, набор данного изобретения включает флакон (или другую пригодную тару), который содержит иммуногенную композицию. Эта иммуногенная композиция включает как антиген PCV2, так и растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), где растворимая часть препарата M.hyo в сущности является свободной как от (i) Ig G, так и (ii) иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин. Необязательно, набор может дополнительно включать инструкцию. Инструкция включает информацию по введению иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах воплощения, набор, содержащий растворимую часть препарата M.hyo, так же включает антиген PCV2. В некоторых вариантах воплощения, комбинация PCV2/M.hyo во флаконе обеспечивается в виде готовой к использованию жидкой композиции.

В других вариантах воплощения, набор включает второй флакон, который содержит антиген вируса PRRS. В некоторых вариантах воплощения, антиген вируса PRRS находится в форме генетически модифицированного живого вируса, который обеспечивается в лиофилизированном состоянии. В таких случаях, инструкция включает способы регидратации вирусного компонента PRRS жидким содержанием из флакона, который содержит комбинацию PCV2/M.hyo. Инструкция также включает информацию по введению полученной трехвалентной композиции(й) PCV2/M.hyo/PRRS.

В некоторых вариантах воплощения, иммуногенную композицию данного изобретения вводят свиньям, которые имеют материнские антитела против M.hyo. В других вариантах воплощения, иммуногенную композицию данного изобретения вводят свиньям, которые имеют материнские антитела, против M.hyo и как минимум одного другого микроорганизма, способного вызвать заболевание у свиней.

В некоторых вариантах воплощения, поливалентную иммуногенную композицию данного изобретения вводят поросенку возрастом 3 недели или старше. Однако, предусматривается, что поливалентная вакцинная композиция изобретения также может быть использована для повторной вакцинации молодых свиней до размножения. В отрасли также известно, что молодая свинья является свиньей женского рода, которая не была супоросной. Вакцинированные молодые свиньи будут пропускать материнские антитела их новорожденным поросятам с помощью молозива.

Также предусматривается, что поливалентная вакцина изобретения может быть использована для ежегодной повторной вакцинации стада, которое размножается. Желательно, поливалентную вакцину данного изобретения вводят свиньям (например, поросятам или молодым свиньям) в одной дозе. В одном варианте воплощения, поливалентная вакцина данного изобретения не нуждается в смешивании отдельных моновалентных вакцин перед введением, то есть, она обеспечивается как готовая к использованию композиция. В другом варианте воплощения, поливалентная композиция требует смешивания бивалентной вакцины данного изобретения, которая содержится в первом флаконе, с моновалентной вакциной, которая содержится во втором флаконе. Необязательно, дополнительные антигены могут быть добавлены к любому из этих флаконов.

В некоторых вариантах воплощения, иммунитет начинает проявляться через 2-3 недели после вакцинации моновалетной или поливалентной композицией вакцины данного изобретения. В других вариантах воплощения, длительность иммунитета составляет приблизительно 17-23 недели после вакцинации моновалетной или поливалентной композицией вакцины данного изобретения.

Следующие примеры приводят предпочтительные материалы и способы данного изобретения. Однако, нужно понимать, что эти примеры приведены только с целью иллюстрации, и не ограничивают объем прав изобретения.

Примеры

Пример 1: Способы получения Mycoplasma hyopneumoniae для антигена M.hyo. способного к объединению с PCV2

Ферментация и инактивация M.hyo

Среду для разведений исходного вируса и антигена готовили следующим образом. Бульон плевропневмония-подобного организма, полученного из сердца свиней (PPLO) (BD Biosciences каталог No. 21498), получали по инструкции производителей (то есть, 21 г/л), и раствор экстракта дрожжей получали с концентрацией 21 г/л в USP. Раствор дрожжевого экстракта потом добавляли к PPLO при 6,25%, и смесь стерилизовали, нагревая к 121°С в течение > 30 минут. Гидрохлорид цистеина получали с концентрацией 90 г/л и стерилизовали фильтрованием. Раствор декстрозы получали добавлением 450 г декстрозы на литр USP воды, после чего стерилизовали нагреванием. Для получения конечной среды, свиную сыворотку добавляли к основной среде с концентрацией 10%, после чего цистеин с концентрацией 0,01% и декстрозу с концентрацией 1,0%. Среду инокулировали 10% о.:о. культуры М. hyopeumoniae (штамм Р-5722-3) в логарифмической фазе роста. Культуру выдерживали при 37°С, и pH и dO поддерживали на уровне 7,0 и 25%, соответственно. В логарифмической фазе роста, культуру инактивировали бинарным этиленимином (BEI), азиридином, полученным из 2-бромэтиламин гидробромида. В частности, инактивацию осуществляли путем повышения pH до 7,8 добавлением 2-бромэтиламингидробромида (ВЕА) к конечной концентрации 4 мМ и инкубированием в течение 24 часов. BEI нейтрализовали добавлением тиосульфата натрия в молярном соотношении 1:1, после чего инкубировали в течение еще 24 часов. Жидкость инактивированной культуры выдерживали при 2-8°С до последующей обработки.

Пример 2: Способы получения гибридного цирковируса свиней (cPCV) 1-2

cPCVI-2 конструировали путем клонирования иммуногенного капсидного гена патогенного цирковируса свиней типа 2 (PCV2) в геномный скелет непатогенного цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Процедура конструирования клонам гибридной ДНК описана, например, в патенте США №7,279,166, который включен в данный документ с помощью ссылок. Инфекционный материал гибридного вируса получали от доктора X.J. Meng, университет Virginia Polytechnic Institute and State University, Блексбург, Вирджиния, и использовали для инфицирования клеток почек свиней (РК)-15, выращенных в минимальной поддерживающей среде (MEM), обогащенной 0,05% гидролизатом лактальбумина (LAH), 30 мкг/мл гентамицин сульфата, и 5% фетальной бычьей сыворотки. Полученные cPCVI-2 инфицированные РК-15 клетки размножали серийными пассажами еще четыре раза, используя такую же среду, за исключением того, что использовали 2-3% фетальную бычью сыворотку. Пятый пассаж замораживали, размораживали и фильтровали, и полученные лизаты использовали для приготовления предыдущего вакцинного вируса и потом исходного вакцинного вируса.

Среда, что использовали для приготовления вирусного инокулята, была такой же как использовали для приготовления вирусного посевного материала. Как ростовая среда MEM, OPTIMEM, или эквивалентом является базальная среда, которую можно использовать для высаживания клеточной линии РК-15 для разрастания. Ростовая среда может быть дополнена до 10% бычьей сывороткой, до 0,5% гидролизатом лактальбумина, до 0,5% бычьей сывороткой альбумина, и до 30 мкг/мл гентамицином. Как среду размножения вируса используют MEM, OPTIMEM или эквивалентную. Среда размножения вируса может быть дополнена до 0,5% гидролизатом лактальбумина, до 2% бычьей сывороткой, до 0,5% бычьей сывороткой альбумина, и до 30 мкг/мл гентамицином. До 5 г/л глюкозы и до 5 ммоль/л L-глутамина могут быть добавлены к ростовой среде и/или среде размножения вируса, что необходимо для поддержания клеток.

cPCN/1-2 исходный вакцинный вирус добавляли к суспензии клеток РК-15 и адсорбировали до 3 часов. Вирусный инокулят разводили в ростовой базальной среде для обеспечения многочисленности инфекции (MOI) 0,1-0,0001.

Культуры клеток РК-15 сначала инокулировали рабочим вирусным инокулятом во время высаживания клеток, или когда клетки достигали приблизительно 20% - 50% конфлюенции. Этот первый пассаж может называться "одно-стадийный способ инфицирования" для получения пула антигена, или может быть использован в последующем для серийных пассажей. Для серийных пассажей, cPCVI-2 инфицированные клетки РК-15 дальше размножали до 7 пассажей серийными разделением в соотношении 1:5-20 для размножения вируса. Культуральная среда, что содержит суспензию инфицированных клеток из предыдущего пассажа, служила посевным материалом для следующего пассажа. cPCVI-2 инфицированные клетки инкубировали в течение 3-14 суток для каждого пассажа при 36±2°С, до достижения клетками >90% конфлюенции. Вирус cPCVI-2 вызывает видимые цитопатические изменения на протяжении репликации вируса. При сборе культуры клеток, наблюдали округление клеток и значительные плавучие куски. Культуры также наблюдали на визуальное присутствие бактериального или грибкового поражения. Время инкубирования между сбором для cPCV антигенов приведено в Таблице 1 ниже:

Культуральные жидкости cPCVI-2 собирали в стерильные пробирки и отбирали образцы на исследование микоплазмы, используя известные способы. Многочисленные сборы можно осуществлять из роллер-флаконов, биореакторов и перфузионных колб.

Перед инактивацией собранного вируса cPCVI-2, один или больше серий антигенов концентрировали (например, к 60Х) путем ультрафильтрации. Концентраты промывали сбалансированным солевым раствором для удаления протеинов сыворотки.

Способы инактивации, аттенуации или детоксификации вируса cPCVI-2 описаны дальше. После концентрирования cPCV антигена, бета-пропиолактон (BPL) добавляли к объединенному вирусному материалу cPCV1-2 с получением приблизительной концентрации 0,2% о./о. Объединены вирусные жидкости потом перемешивали в течение минимум 15 мин., и потом инактивированный объем жидкостей антигена переносили во вторую стерильную колбу. Перенесенные жидкости антигена выдерживали при 2-7°С, с постоянным взбалтыванием, в течение минимум 24 часов. После минимум 24 часов, второе добавление 0,2% о./о BPL добавляли к объединенной суспензии. Содержание потом взбалтывали, переносили в третью колбу, и выдерживали при 2-7°С, с постоянным взбалтыванием, в течение дополнительного времени не меньше чем 84 часов. В целом, время полной инактивации равняется не меньше, чем 108 часов, и не больше, чем 120 часов. Способ инактивации показан в Таблице 2 ниже.

Инактивацию завершали добавлением финальной концентрации - не больше, чем 0,1 М раствор тиосульфата натрия. pH инактивированного пула антигена доводили до приблизительно 6,8, используя NAOH или HCl. После инактивации, типичный образец брали из пула и тестировали на завершение инактивации. Инактивированный продукт cPCV1-2 антигена стандартизировали для достижения цели в более чем 1,0 RP, измеренной с помощью ELISA эффективности.

Пример 3: Даун-стрим обработка М. hyo антигенов и аналитическое тестирование этих обработанных антигенов

Даун-стрим обработка M.hyo антигенов:

Инактивированную ферментационную жидкость (полученную как описано выше в Примере 1) обрабатывали следующим образом для каждой указанной группы. Эти обработанные M.hyo антигены применяли в Примере 4 ниже.

Т02: (вся масса) не обработанные.

Т03: (10 X УФ концентрированные) Концентрировали с помощью фильтрации с тангенциальным потоком, используя мембрану с отсечкой по молекулярной массе 100 КДа (пористое волокно). Уменьшение конечного объема составляло 10Х.

Т04 и Т05: (10Х УФ концентрированные и центрифугированные) Концентрированные клетки микоплазмы (из Т03) собирали и промывали один раз PBS с помощью центрифугирования при ~20,000×g (модель Sorvall RC5B).

Т06 и Т07: (10Х центрифугированы) Инактивированную ферментационную жидкость центрифугировали при ~20,000×g (Sorvall RC5B) и промывали один раз путем ресуспендирования клеток в PBS, после чего дополнительным центрифугированием. Уменьшение конечного объема равнялось 10Х.

Т08: (10Х центрифугированы и нагреты) Клетки Mycoplasma концентрировали и промывали на Т06 и нагревали до 65°С в течение 10 минут.

Т09: (супернатант без клеток) Супернатант, собранный из первого центрифугирования как описано для Т06, стерилизовали фильтрованием сквозь фильтр 0,2 микрон (Nalgene).

Т10: (супернатант без клеток, обработанный протеином-А) Стерильный супернатант (приготовленный для Т09) смешивали со смолой протеин А (Протеин А Сефароза, Pharmacia Inc) при объемном соотношении 10:1 в течение 4 часов. Смолу удаляли стерильной фильтрацией, и фильтруемую жидкость хранили при 2-8°С. Этот способ использует после ферментационную обработку "даунстрим" протеином А для удаления антител и иммунокомплексов. Хотя данное изобретение не исключает апстрим обработки протеином А, изобретатели выяснили, что в случае M.hyo, апстрим обработка протеином А ростовой среды приводит к р46 результатам, худшим и не соответствующим необработанной среде (данные не приведены).

Аналитическое тестирование антигенов M.hyo, обработанных даунстрим

Обработанные даустрим препараты антигенов M.hyo (полученные как описано выше) тестировали на восстановление M.hyo специфического р46 антигена, и присутствие PCV2 антитела. Кроме этого, эти препараты M.hyo антигенов тестировали на присутствие вируса гепатита (TTV), включая генотип 1 (g1TTV) и генотип 2 (g2TTV). Результаты представлены ниже в Таблице 3.

Со ссылкой на Таблицу 3 выше, восстановление M.hyo-специфического р46 антигена демонстрировали для каждого из M.hyo даунстрим обработанного антигенного препарата. Кроме этого, следующие обработки успешно удалили PCV2 антитело: 10Х УФ концентрированные и центрифугированные, 10х центрифугированные, 10Х центрифугированные и нагретые, и супернатант без клеток (обработанные протеином А). Относительно TTV, следующие обработки успешно удалили g1TTV: 10Х УФ концентрированные и центрифугированные, 10х центрифугированные и нагретые, и супернатант без клеток (обработанные протеином А). Только обработка, обозначенная 10Х УФ концентрированные и центрифугированные, удаляла g2TTV. Изоляты вируса гепатита, включая генотипы 1 и 2, описаны в US 20110150913, который включен в данный документ с помощью ссылок.

Ввиду того, что в отрасли известно, что протеин А связывает Ig G, специалисту в отрасли понятно, что не только PCV2 антитело, но и другие свиные антитела, включая PRRS антитело, HPS антитело и SIV антитело, можно эффективно удалять обработкой протеином А. Это делает бесклеточный обработанный протеином А супернатант M.hyo этого изобретения совместимым не только с PCV2 антигеном, а также с другими свиными антигенами, в результате отсутствия иммунологической интерференции между антигенами. Кроме этого, ожидается, что удаление остатков незащитных клеток и удаления иммуноглобулина и комплексов антиген/иммуноглобулин сделает вакцину безопаснее.

Пример 4: Получение композиций экспериментальных вакцин M.hyo

Все экспериментальные вакцины M.hyo формулировали с конечной концентрацией адъюванта 5%. Кроме этого, все вакцины стандартизировали с помощью р46 ELISA и фиксировали тимеросолом. Композиции экспериментальной вакцины получали с M.hyo антигенами, обработанными согласно обработкам Т02-Т10 выше. Кроме этого, Обработка Т01 отвечала плацебо (не содержала M.hyo антигена, только 5% Amphigen адъюванта), в то время как Обработка Т11 означала позитивный контроль, который отвечал вакцине M.hyo на основе бактерина, где закончился термин действия (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health). Эти композиции описаны в Таблице 4 ниже.

Пример 5: Оценка in vivo эффективности вакцины M.hyo с M.hyo антигенами от разных обработок даунстрим

Это исследование проводили для оценки in vivo эффективности вакцин Mycoplasma hyopneumoniae (М.hyo) с М.hyo антигенами от разных даунстрим обработок (DSP). Свиней возрастом 3 недели внутримышечно инокул провал и однократной дозой разных композиций вакцин, описанных в Таблице 4 выше. Шестнадцать животных инокул провал и в каждой из групп обработок. Животных заражали через 21 сутки после вакцинации вирулентным изолятом M.hyo из исследуемой станции. Трупы животных разрезали через 28 суток после заражения, и легкие удаляли и подсчитывали уплотнения совместимые с инфекцией M.hyo. Первичным критерием для защиты против заражения M.hyo была оценка уплотнений в легких. Обычно принято, что существует взаимосвязь между размером поражений легких, вызванных энзоотической пневмонией, и обратным эффектом на скорость роста. Таблица 5 ниже содержит оценку поражений легких для соответствующих групп обработки. Статистическая значимость продемонстрирована с помощью анализа смешанной модели оценок легких для каждой группы.

С ссылкой на Таблицу 5 выше, результаты с M.hyo антигенами от разных даунстрим обработок указали на то, что все экспериментальные вакцины, кроме Т04, значительно отличались от плацебо. Эти результаты поражений M.hyo графически изображенные на Фигуре 1. Как показано на Фигуре 1, Т04 дала неприемлемые результаты. Все другие обработки значительно отличались от плацебо (Т01). Оценка уплотнений легких указала, что Т02, Т03 и Т09-Т11 предоставили наиболее эффективную защиту против заражения M.hyo

Относительную эффективность р46 экспериментальных вакцин оценивали, используя двойной антитело сендвич ферментный иммуносорбентный анализ (DAS ELISA). Результаты р46 DAS ELISA, показанные в Таблице 5 выше, указывают на то, что все экспериментальные вакцины превысили намеченную эффективность. Кроме этого, р46 относительная эффективность поддерживалась или увеличивалась при хранении вакцин в течение месяца (данные не приведены). Заметное увеличение активности со временем наблюдали у центрифугированных антигенов, за исключением антигенов, которые поддавались нагреванию. Не привязываясь к теории, вероятно, что "каркасы" клеток со временем разрушаются и высвобождают больше связанного мембраной р46 антигена в случае центрифугированных антигенов.

Пример 6: Оценка совместимости экспериментальных вакцин M.hyo из PCV2 антигеном

Это исследование осуществляли для оценки совместимости экспериментальных вакцин M.hyo с М.hyo антигенами от разных даунстрим обработок PCV2 антигеном. Композиции экспериментальной вакцины M.hyo описаны в Таблицах 4 и 5 выше. Экспериментальные р46 относительные эффективности этих вакцин описаны в Таблице 5 выше. Каждую из этих экспериментальных вакцин M.hyo объединяли с PCV2 антигеном. В этом примере, антиген PCV2 представляет убитый гибридный вирус PCV тип 1-тип 2 (Fostera PCV), полученный как описано выше в Примере 2. Гибридный вирус включали в композиции в начальной концентрации 1,6 ≤ RP, где RP является единицей относительной эффективности, определенной с помощью количественного анализа антигена PCV2 ELISA (тест на активность in vitro) по сравнению с эффективной вакциной.

Композиции экспериментальной комбинации M.hyo/PCV2 оценивали с помощью PCV2 ELISA. Результаты представлены на Фигуре 2. Как показано на Фигуре 2, только препараты M.hyo антигена после следующих даунстрим обработок были совместимыми с PCV2 антигеном: Ультрафильтрация и Центрифугирование (Т04 & Т05), Центрифугирование (Т06 и Т07), Центрифугирование, плюс нагревание (Т08) и Супернатант, обработанный протеином А (Т10). Среди них, Супернатант M.hyo, обработанный протеином А, был наиболее совместимым с PCV2 антигеном, по сравнению из плацебо контролем, который включал гибридный вирус и Amphigen адъювант, однако не содержал M.hyo антиген. Уровень гибридного вируса PCV в супернатанте, обработанном протеином А, составлял 1,5 RP, по сравнению с 1,69 RP для плацебо. Таким образом, заключили, что отсутствует или присутствует минимальная иммунологическая интерференция между препаратом растворимого антигена M.hyo, обработанного протеином А, и PCV2 антигеном гибридного вируса.

Эффективность in vivo Супернатанта M.hyo, обработанного протеином А, продемонстрированная в Примере 5 выше, вместе с результатами описанными в этом Примере, указывает на то, что Супернатант, обработанный протеином А, является потенциально эффективной платформой для комбинаций M.hyo-PCV2.

Пример 7: Оценка эффективности PCV2 комбинированной вакцины PCV2/M.hvo в одном флаконе в разных композициях адъюванта

Это исследование осуществляли для оценки эффективности PCV2 в комбинированной вакцине PCV2/M.hyo в одном флаконе в разных композициях адъюванта. В этом примере, антиген PCV2 представлял гибридный вирус PCN/тип 1-тип 2 (Fostera PCV). Гибридный вирус объединяли с препаратом растворимого антигена M.hyo, который в сущности не содержал Ig G (то есть, супернатант, обработанный протеином А).

Обработка жидкостей:

Ферментированную жидкость с инактивированным M.hyo (описанную выше в Примере 1), обрабатывали для каждой указанной группы следующим образом.

Т02-Т04: Полную ферментированную жидкость, которая содержит живые клетки М. hyopneumoniae (описанную выше) центрифугировали при ~20,000×g (Sorvall RC5B), и собирали супернатант и стерилизовали через фильтр 0,2 мкМ. Протеин А Сефароза (номер компонента 17-5199-03, GE Healthcare) паковали в 1L хроматографическую колонку. После удаления буфера для хранения и обработки двумя объемами колонки 1М уксусной кислоты, смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки буфера 50 мМ NaPO4/1M NaCl, pH 7,04. Приблизительно 2 литра очищенной/профильтрованной жидкости, которая содержит антиген М. Hyopneumoniae, пропускали сквозь смолу Протеин А со скоростью потока 100 см/час. Пропущенную жидкость собирали и стерилизовали с помощью фильтра 0,2 мкМ.

Т05: это позитивный контроль, который отвечает Fostera PCV-подобной композиции (не содержит M.hyo антигена). Содержание гибридного вируса в этой Fostera PCV-подобной композиции составляло приблизительно уровень Минимальной Иммунизирующей Дозы (MID) в композиции. Гибридный вирус включали в экспериментальные вакцины PCV2/M.hyo в одинаковом количестве.

Все экспериментальные вакцины PCV2/M.hyo формулировали с разными композициями адъювантов. Композиции экспериментальной вакцины получали с M.hyo антигенами, обработанными согласно обработок Т02-Т04 выше. Кроме этого, Обработка Т01 отвечала плацебо (стерильный солевой раствор).

Все вакцины стандартизировали с помощью р46 ELISA и фиксировали тимеросолом.

Эти экспериментальные композиции описаны в Таблице 6 ниже, где символ * указывает на М. hyo антиген из супернатанта глобального посева М. hyo, обработанного Протеином А, и символ ** указывает на Исследуемый Ветеринарный Продукт (ИВП) серийный.

Свиней возрастом 3 недели внутримышечно инокулировали одной дозой разных композиций вакцин, описанных в Таблице 6 выше. Шестнадцать животных включали в каждую из обрабатываемых групп. Животных заражали через 21 сутки после вакцинации вирулентным изолятом PCV2 из исследуемой станции.

Фигура 3 является диаграммой, которая показывает результаты виремии PCV2 (PCV2 количественная ПЦР) полученные с разными платформами адъювантов. Отмечено, что виремию PCV2 использовали в качестве первичной переменной эффективности. Результаты виремии PCV2 представлены как ДНК копии/мл. Как показано на Фигуре 3, все обработки имели значительно меньший уровень виремии по сравнению с плацебо на 28, 35 и 42 (заражение на 21 сутки) сутки. 10% SP-масло адъювант имел значительно меньший уровень виремии по сравнению с 5% Amphigen на 28-е и 35-е сутки. 5% Amphigen плюс 5% SLCD адъювант имел значительно меньший уровень виремии по сравнению с 5% Amphigen на 28-е и 35-е сутки. Платформа 20% SLCD адъюванта имела значительно меньший уровень виремии по сравнению с 5% Amphigen на 28, 35 и 42-е сутки.

Серологию PCV2, PCV2 фекальные выделения, PCV2 назальные выделения, клеточно-опосредованный иммунный (КОИ) ответ, истощение лимфоидной ткани, и иммуногистохимию (ИГХ) также мониторили как вторичные переменные эффективности. Эти результаты будут описаны ниже.

Фигура 4 является диаграммой, которая показывает результаты PCV2 ELISA на 1, 20 и 42-е сутки исследования (заражения осуществляли на 21-е сутки). Статус каждого образца выражали как образец к позитивному соотношению (S/P). Как показано на Фигуре 4, 20% SLCD было единственной обработкой, которая значительно отличалась от плацебо (Т01) как на 20-е, так и на 42-е сутки. Также, 5% Amphigen было единственной обработкой, которая значительно не отличалась от плацебо на 20-е сутки.

Фигура 5 является диаграммой, которая показывает PCV2 фекальных выделений, полученных в обработках Т02-Т04 против плацебо (Т01). Эти результаты выражали как PCV2 ДНК копии/мл. Результаты на Фигуре 5 указывают на то, что все обработки имели значительно меньшие фекальные выделения по сравнению с плацебо на 42-е сутки. Кроме этого, 5% Amphigen & 5% SLCD (Т04) имели значительно меньшие фекальные выделения по сравнению с 5% Amphigen (Т03) на 42-е сутки. Никаких других различий между обработками не зафиксировано.

Фигура 6 является диаграммой, которая показывает PCV2 назальных выделений, полученных в обработках Т02-Т04 против плацебо (Т01). Эти результаты выражали как PCV2 ДНК копии/мл. Результаты на Фигуре 6 указывают на то, что все обработки имели значительно меньшие назальные выделения по сравнению с плацебо на 42-е сутки. Кроме этого, 20% SLCD (Т05) имела значительно меньшие назальные выделения по сравнению с 5% Amphigen (Т03) на 42-е сутки. Никаких других различий между обработками не зафиксировано.

Фигуры 7 (А и В) является двумя графиками, которые показывают результаты теста интерферон-гамма (IFN-γ), который измеряет PCV2-специфический клеточно-опосредованный иммунный (КОИ) ответ.Результаты КОИ показаны как после вакцинации/перед заражением (Фигура 7А), и после вакцинации/после заражения (Фигура 7В). На этом графике, стимулирование 5×106 клеток считали значимым (…). Все экспериментальные вакцины PCV2/M.hyo дали способный к выявлению IFN-γ ответ после вакцинации. 10% SP-масло (Т02) дало самый сильный IFN-γ ответ после вакцинации. 20% SLCD (Т05) вызывала сам ранний ответ, однако самый слабый ответ на 20-е сутки. Наблюдали значительный ответ после заражения, особенно в группе плацебо. Кроме этого, ответ после заражения был ниже в группах с вакцинированными свиньями, по сравнению с группой плацебо.

Таблица 7 ниже показывает истощение лимфоидной ткани, полученное после экспериментальных обработок, на контрасте с плацебо.

Результаты, представленные в Таблице 7 выше, показывают, что все вакцины дали значительную защиту против истощения лимфоидной ткани. Также, не наблюдали статистически значимых контрастов между обработками вакцин.

Таблица 8 ниже показывает иммуногистохимию, полученную от экспериментальных обработок по сравнению с плацебо.

Результаты, представленные в Таблице 8 выше, показывают, что все вакцины дали значительную защиту против PCV2 колонизации, что подтверждено иммуногистохимией. Также, не наблюдали статистически значимых контрастов между обработками вакцин.

В итоге, результаты, представленные в этом примере, демонстрируют, что растворимый препарат антигена M.hyo не мешает эффективности PCV2. Результаты также демонстрируют, что все экспериментальные композиции вакцин PCV/M.hyo имеют эффективность против заражения PCV2. Кроме этого, результаты указывают на то, что существуют некоторые статистические и цифровые разницы, полученные с разными композициями адъюванта, где 10% SP-масло дало наибольшую эффективность.

Пример 8: Оценка эффективности M.hyo комбинированной вакцины PCV2/M.hvo в одном Флаконе с разными композициями адъюванта

Это исследование проводили для оценки эффективности M.hyo комбинированной вакцины PCV2/M.hyo в одном флаконе с разными композициями адъюванта. Антиген M.hyo комбинировали с цирковирусом свиней (тип 1-тип 2 гибрид, или PCV1-2, убитый вирус) в одном флаконе.

Обработка жидкостей:

Ферментированную жидкость с инактивированным M.hyo (описанную выше в Примере 1) обрабатывали для каждой группы следующим образом.

Т02-Т04: Эти обработки были такими же, как описанные для групп Т02-Т04 в Примере 7 выше.

Т05: формулировали с инактивированными клетками M.hyo (M.hyo бактерии), как описано в Примере 1 выше, под названием "Ферментация и инактивация".

Все экспериментальные вакцины PCV2/M.hyo формулировали с разными композициями адъюванта. Композиции экспериментальной вакцины получали с антигенами M.hyo, обработанными согласно обработок Т02-Т04. Кроме этого, Обработка Т01 отвечала плацебо (стерильный солевой раствор). Обработка Т05 является позитивным контролем, что отвечает вакцине RespiSure® с законченным сроком действия, которая представляет собой вакцину на основе бактерина M.hyo (Pfizer Animal Health).

Эти экспериментальные композиции описаны в Таблице 9 ниже, где символ * означает супернатант М. hyo антигена из глобального посева М. hyo, обработанного Протеином А, и символ** означает Исследуемый Ветеринарный Продукт (ИВП) серийный.

Свиней возрастом 3 недели внутримышечно инокулировали одной дозой разных композиций вакцин, описанных в Таблице 9 выше. Четырнадцать животных включали как в группу плацебо, так и в 10% SP-масло, тринадцать животных включали в группу позитивного контроля, и шестнадцать животных включали как в группу 5% Amphigen, так и в 5% Amphigen + 5% SLCD.

Животных заражали через 21 сутки после вакцинации вирулентным изолятом M.hyo из исследуемой станции. Трупы животных разрезали на 28-е сутки после заражения и легкие удаляли и оценивали на содержание уплотнений совместимых с инфекцией M.hyo. Таблица 10 ниже содержит оценки поражений легких для соответствующих групп обработки. Статистическая значимость определялась за анализом смешанной модели оценок легких в каждой группе.

Как указано в Таблице 10 выше, группа плацебо имела среднюю оценку поражения легких 13,1%, по сравнению с группами 10% SP-масло и 5% Amphigen, которые имели среднюю оценку поражения легких 4,3% и 4,7%, соответственно. Как композиция 10% SP-масло, так и 5% Amphigen уменьшали и/или предотвращали поражение легких. Таким образом, экспериментальные вакцины PCV/M.hyo формулируемые с 10% SP-масло или 5% Amphigen считаются эффективными. PCV2 антиген не препятствует эффективности M.hyo в этих композициях.

Напротив, группа 5% Amphigen + 5% SLCD имела средний уровень поражения легких 12,0%. Что было неприемлемым результатом, поскольку он не отличался по сравнению с плацебо. В результате, экспериментальная вакцина PCV/M.hyo формулируемая с 5% Amphigen + 5% SLCD не считается эффективной.

Отмечено, что в результате уменьшенного количества животных и значительной вариабельности оценки поражения легких, не возможно продемонстрировать статистическое влияние обработки в этом исследовании. По этой причине, решили, что другое исследование разработают для тестирования эффективности M.hyo экспериментальных композиций PCV/M.hyo в 10% SP-масло. Это повторяемое исследование представлено в Примере 9 ниже.

Пример 9: Оценка эффективности M.hyo комбинированной вакцины PCV2/M.hvo в одном Флаконе в 10% SP-масло

Это исследование разработано для оценки эффективности фракции M.hyo в четырех экспериментальных вакцинах PCV2/M.hyo (серийные номера L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 и L0711RK14, в Таблице 11 ниже), полученных согласно разным способам получения M.hyo, которые используют Протеин А для удаления Ig G по сравнению с контрольными вакцинами, полученными согласно стандартному способу получения M.hyo. Каждая из этих четыре экспериментальных вакцин PCV2/M.hyo включает 10% SP-масло в качестве адъюванта.

Обработка жидкостей:

Т02: Инактивированный М. hyopneumoniae антиген как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" в Примере 1 выше.

Т03 и Т04: Формулируемые с инактивированными клетками М. hyopneumoniae, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" в Примере 1 выше.

Т05: Обработку среды Протеином А использовали для роста М. hyopneumoniae. PPLO (происхождение свиное сердце) получали по инструкции производителей (то есть, 21 г/л) и раствор экстракта дрожжей готовили с концентрацией 21 г/л в USP. Раствор дрожжевого экстракта добавляли к PPLO с концентрацией 6,25%, и смесь стерилизовали, нагревая до 121°С в течение > 30 минут. Гидрохлорид цистеина получали с концентрацией 90 г/л и стерилизовали фильтрованием. Раствор декстрозы получали добавлением 450 г декстрозы на литр USP воды, после чего стерилизовали нагреванием. Для получения конечной среды, свиную сыворотку добавляли к основной среде с концентрацией 10%, после чего цистеин с концентрацией 0,01% и декстрозу с концентрацией 1,0%. Антитела в полной среде PPLO удаляли обработкой протеином А. Коротко, 1 л Протеин А Сефароза (номер партии 17-5199-03 GE Healthcare) паковали в стеклянную колонку (10 X 11,5 см). После удаления буфера для хранения, колонку обрабатывали 2-мя объемами колонки 1М. Смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки буфера 50 мМ NaPO4, 1М NaCl (pH 7,0). 15 л Полной PPLO среды загружали на смолу при линейной скорости потока 140 см/час. Прогонку колонки собирали и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 микрон (Sartorius). Обработанную среду использовали для размножения клеток М. Hyopneumoniae, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" выше. Полностью инактивированную культуру (включая клетки) формулировали в конечную вакцину.

Т06: Инактивированные клетки М. hyopneumoniae получали, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" в Примере 1 выше. Инактивированную ферментационную жидкость центрифугировали при ~20,000×g (Sorvall RC5B) в течение 30 мин., и супернатант стерилизовали фильтрацией 0,2 мкМ. 115 мл Протеин А смолы (номер партии 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) паковали в хроматографическую колонку (5×6 см). После удаления буфера для хранения и обработки двумя объемами колонки 1М, смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки буфера 50 мМ NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизительно 1,2 литры очищенной/профильтрованной жидкости, которая содержит антиген М. Hyopneumoniae, пропускали через смолу со скоростью потока 120 см/час. Пропущенную жидкость собирали и стерилизовали с помощью фильтра 0,2 мкМ.

Т07: Инактивированные клетки М. hyopneumoniae получали, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" в Примере 1 выше. Инактивированную ферментационную жидкость очищали фильтрацией тангенциальным потоком. Коротко, фильтр из полиэфир сульфона (GE HealthCare, номер партии 56-4102-71) с номинальным размером пор 0,2 мкМ санировали 0.5N раствором гидроксида натрия, после чего тщательным образом промывали стерильной USP водой. Инактивированную культуральную жидкость микоплазм вводили в аппарат со скоростью рециркуляции, которая приближалась к 14,6 л/мин. и трансмембранным давлением 2-3,4 PSI. Очистку осуществляли при комнатной температуре. Пермеат фильтра собирали и хранили при 2-8°С до последующей обработки. 115 мл Протеин А смола (номер партии 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) паковали в хроматографическую колонку (5×6 см). После удаления буфера для хранения и обработки двумя объемами колонки 1М, смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки буфера 50 мМ NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизительно 2,3 л очищенной/профильтрованной жидкости, которая содержит антиген М. Hyopneumoniae, пропускали через смолу со скоростью потока 120 см/час. Пропущенную жидкость собирали и стерилизовали с помощью фильтра 0,2 мкМ.

Т08: Инактивированные клетки М. hyopneumoniae получали, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" выше. Инактивированную ферментационную жидкость центрифугировали при ~20,000×g (Sorvall RC5B) в течение 30 мин., и супернатант стерилизовали через фильтр 0,2 мкМ. 115 мл Протеин А Сефароза (номер партии 17-5199-03 GE Healthcare) паковали в хроматографическую колонку (5×6 см). После удаления буфера для хранения и обработки двумя объемами колонки 1М, смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки буфера 50 мМ NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизительно 1,2 л очищенной/профильтрованной жидкости, которая содержит антиген М. Hyopneumoniae, пропускали сквозь смолу со скоростью потока 120 см/час. Пропущенную жидкость собирали и стерилизовали с помощью фильтра 0,2 мкМ.

Композиции экспериментальной вакцины получали с антигенами M.hyo, обработанными, согласно обработок Т02-Т08 выше. Т02, Т03 и Т04 отвечают позитивным контролям. Кроме этого, Обработка Т01 отвечала плацебо (стерильный солевой раствор).

Эти экспериментальные композиции описаны в Таблице 11 ниже. M.hyo антиген отвечает M.hyo антигену из супернатанта глобального посева M.hyo, обработанного Протеином А. Информация в разделе "Обработка Протеином А" указывает на то, или супернатант M.hyo обрабатывали Протеином А перед или после ферментации.

Свиней возрастом 3 недели внутримышечно инокулировали одной дозой разных композиций вакцин, описанных в Таблице 11 выше. В каждую группу обработки включали по 18 свиней.

Животных заражали через 21 сутки после вакцинации вирулентным изолятом M.hyo из исследуемой станции. Трупы животных разрезали на 28-е сутки после заражения, и легкие удаляли и оценивали на содержание уплотнений совместимых с инфекцией M.hyo. Фигура 8 (А и В) показывают оценку поражения легких для соответствующих групп обработки. Статистическая значимость определялась по анализу смешанной модели оценок легких в каждой группе.

Результаты поражения легких, показанные на Фигурах 8А и 8В, указывают на то, что среди всех обработок только две (Т07 и Т08) имели 100% свиней в категории <5% поражения легких. Отмечено, что в этом исследовании наблюдали значительную статистическую разницу.

Результаты данного примера демонстрируют значительную эффективность M.hyo в экспериментальной композиции PCV2/M.hyo в одном флаконе, которая использует супернатант M.hyo, обработанный Протеином А, и SP-масло как адъювант. Кроме этого, Пример 7 выше демонстрирует PCV2 эффективность в композиции PCV2/M.hyo в одном флаконе, которая использует супернатант M.hyo, обработанный Протеином А, и SP-масло как адъювант.Была продемонстрирована эффективность как M.hyo, так и PCV2 в комбинациях PCV2/M.hyo в одном флаконе, которые используют супернатант M.hyo, обработанный Протеином А.

Пример 10: In vivo безопасность экспериментальных вакцин PCV2/M.hvo

Это исследование осуществляли для оценки in vivo безопасности экспериментальных вакцин PCV2-M.hyo, формулируемых с максимальной дозой антигена в разных композициях адъюванта, на животном хозяине, которые вводили животным в очень молодом возрасте (возрастом 3 недели). Разные платформы адъювантов оценивали для определения того, какая из платформ будет обеспечивать приемлемый профиль безопасности на основе температуры, реакций по месту введения инъекции и клинических наблюдений. Композицию 20% SLCD/10% SP-масло использовали в качестве позитивного ("небезопасного") контроля исходя из предыдущих данных относительно реакций по месту введения инъекции, которые наблюдали для этой группы исследования и других.

Обработка жидкостей:

Все вакцины получали с инактивированным антигеном М. Hyopneumoniae, как описано в разделе "Ферментация и Инактивация" в Примере 1. Использовали полный материал антигена M.hyo в силу того, что известно, что он содержит растворимый и нерастворимый антигены M.hyo, кроме иммуноглобулинов и иммунокомплексов, которые будут удалены при обработке протеином А. Справедливо заключить, что удаление кусков нерастворимых клеток и иммуноглобулинов и иммунокомплексов только дополнительно улучшит безопасность композиций. Целью этого исследования было жесткое тестирование безопасности разных композиций адъюванта, которые содержат PCV2 антиген и M.hyo антиген. PCV2 и M.hyo антигены формулировали с максимальным уровнем высвобождения для дополнительной оценки безопасности. Эти экспериментальные композиции описаны в Таблице 12 ниже. ИВП означает Исследуемый Ветеринарный Продукт (ИВП).

Параметры безопасности, примененные в этом исследовании, включали профиль ректальной температуры и реакцию по месту инъекции. Результаты этого исследования указывают на то, что все платформы адъюванта обеспечивали приемлемые профили безопасности в рамках профиля ректальной температуры и клинических наблюдений (результаты не приведены). Только 20% SLCD+10% SP-масло (то есть, позитивный контроль) значительно отличался от вакцины из плацебо и имел несколько жестких реакций по месту инъекции (результаты не приведены).

Пример 11: Получение антигена M.hyo. обработанного Протеином А. для базовых исследований

Фигура 9 является блок-схемой, которая показывает один вариант воплощения способа получения, использованного для приготовления PCV2 совместимого антигена M.hyo, обработанного протеином А. Инактивированные полные культуры M.hyo очищали от клеток фильтрацией в тангенциальном потоке. Коротко, фильтр полиэфир сульфона (GE Healthcare, номер партии 56-4102-49) с номинальным размером пор 0,45 мкМ санировали 0.5N раствором гидроксида натрия, после чего тщательным образом промывали стерильной USP водой. Инактивированную культуральную жидкость микоплазм вводили в аппарат со скоростью рециркуляции, которая приближается до 11,0 л/мин. и трансмембранным давлением ~5 PSI. Очистку осуществляли при комнатной температуре. Пермеат фильтра собирали и хранили при 2-8°С до последующей обработки.

После очистки, жидкость с антигеном обрабатывали протеин А смолой для уменьшения уровня антитела. Коротко, MAbSelect протеин А смолу (GE Healthcare) паковали в стеклянную колонку до уровня 12 см. Смолу уравновешивали 5-ю объемами колонки 50 мМ фосфата натрия, 250 мМ буфера NaCl (pH 7,0). Жидкость с антигеном, эквивалент до 10 объемов колонки, загружали на смолу с линейной скоростью потока 100 см/час. Пропущенную через колонку жидкость собирали и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 микрон. Восстановление колонки получали с помощью последующих 3-х объемов колонки 25 мМ раствора ацетата при pH 3,7, после чего 4-мя объемами колонки 1М раствора. Уровни анти-PCV2 антител и антигена М. hyopneumoniae измеряли в конечной антигенной жидкости с помощью количественной ELISA PCV2 специфического антитела и ELISA р46 антигена, соответственно.

Пример 12: Оценка вирулицидной активности против вируса PRRS

Исследование, представленное в данном примере, разработано для оценки разных платформ адъювантов на вирулицидную активность против вируса PRRS. Начальные эксперименты сфокусированы только на адъюванте (то есть, композиции не содержали антигены PCV или M.hyo). Оценка адъюванта для вирулицидной активности против PRRS представлена на Фигуре 10. Предыдущие оценки вирулицидности указывают на то, что 10% SP-масло, 0,2% Carbopol и 2,5% Amphigen являются не вирулицидными против вируса PRRS. Напротив, 20% SLCD адъювант оказался вирулицидным против вируса PRRS.

Следующие исследования осуществляли для оценки того или композиции PCV/M.hyo с разными платформами адъювантов являются вирулицидными против вируса PRRS. Эти результаты представлены в Таблице 13 ниже, где символ * указывает на те серийные вакцины, которые оказались вирулицидными против вируса PRRS.

Результаты представлены в Таблице 13 выше указывают на то, что 10% SP-масло является невирулицидным против вируса PRRS.

Также серийные вакцины PCV/M.hyo получали, используя 10% SP-масло как адъювант (Таблица 14). Антигенную активность этих вакцин сравнивали со сравнительной серийной вакциной PCV/M.hyo (L1211RK15), которая содержала 0,688% 20Х концентрированного антигена PCV2 (полученного как описано в Примере 11); и 9,40% антигена M.hyo, полученного как описано в Примере 11, описана выше. Результаты, показанные в Таблице 14 ниже, также указывают на то, что 10% SP-масло является невирулицидным против вируса PRRS. Значения тест образца в Таблице 14 все были более высокими (отметка +) чем вирулицидность контроля, что выражено в геометрически среднем титре (GMT) приблизительно 5,9±0,5 log/мл.

Результаты, представленные в этом примере, демонстрируют, что 10% SP-масло является не вирулицидным против вируса PRRS. Результаты, представленные в этом примере, также демонстрируют, что композиция PCV/M.hyo с адъювантом 10% SP-масло была среди тех вакцин, которые считались не вирулицидными против вируса PRRS (Таблица 13 та Таблица 14). Подытоживая, композиция PCV/M.hyo с адъювантом 10% SP-масло считается эффективной платформой для трехвалентной комбинации, которая содержит PCV, M.hyo и вирус PRRS.

Пример 13: Получение комбинированной вакцины PCV/M.hvo/PRRS

Композиция PCV/M.hyo с адъювантом, который является не вирулицидным против вируса PRRS (смотреть Таблицы 13 и 14 выше), обеспечивается в виде готовой к использованию жидкой композиции в одном флаконе. Эта композиция PCV/M.hyo в одном флаконе использует супернатант M.hyo, обработанный Протеином А. Как M.hyo, так и PCV2 продемонстрировали эффективность в таких композициях PCV2/M.hyo, которые используют супернатант M.hyo, обработанный Протеином А (смотреть Примеры 7-9). В данном примере, эта двухвалентная композиция PCV2/M.hyo комбинирована с моновалентным антигеном вируса PRRS.

В одном варианте воплощения, комбинация PCV/M.hyo в 10% SP-масло и соответствующие серийные вакцины L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 и L0711RK14, в Таблице 11 выше обеспечиваются в виде готовой к использованию жидкой композиции в одном флаконе. Результаты представленные в Примере 12 выше демонстрируют, что 10% SP-масло является не вирулицидным против вируса PRRS. Пример 12 также демонстрирует, что композиции PCV2/M.hyo с адъювантом 10% SP-масло были среди тех серийных вакцин, которые оказались не вирулицидными против вируса PRRS. В данном примере, такая PCV2/M.hyo жидкая композиция в одном флаконе используется для регидратации лиофилизированной генетически модифицированной живой вирусной композиции PRRS, которая содержится во втором флаконе, так что все антигены содержатся в единственном флаконе перед введением свинье в приемлемом возрасте (например, возрасте 3 недели или старшие).

В одном варианте воплощения, вирус PRRS имеет геномную последовательность, которая соответствует SEQ ID NO: 16 или ее варианту. В другом варианте воплощения, вирус PRRS, примененный в трехвалентной композиции, является изолятом вируса PRRS, обозначенным ISU-55, который депонируется в АТСС под номером доступа VR 2430. Пригодные количества соответствующих антигенов описаны в данном документе. Желательно, все антигены вводят свинье с однократным введением.

Изобретения касаются иммуногенной композиции, способа иммунизации, набора для осуществления такой иммунизации и способа получения иммуногенной композиции. Композиция содержит эффективное количество растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); где растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo содержит M.hyo-специфические растворимые протеиновые антигены и является отделенной от нерастворимого клеточного материала, в сущности, является свободной как от (i) lg G, так и от (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину. Изобретения могут быть использованы для индуцирования иммунного ответа у субъекта против заболевания, вызванного M.hyo. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 14 табл., 13 пр.

1. Иммуногенная композиция для индуцирования иммунного ответа у субъекта против заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), которая содержит эффективное количество растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); где растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo содержит M.hyo-специфические растворимые протеиновые антигены и является отделенной от нерастворимого клеточного материала, в сущности является свободной как от (i) lg G, так и от (ii) иммунокомплексов, состоящих из антигена, присоединенного к иммуноглобулину.

2. Композиция по п. 1, где растворимую часть препарата M.hyo обрабатывали протеином-А или протеином-G перед добавлением к иммуногенной композиции.

3. Композиция по п. 1, где композиция дополнительно содержит адъювант.

4. Композиция по п. 3, где адъювант выбирают из группы, которая состоит из следующих: адъювант масло в воде, полимерный и водный адъювант, адъювант вода в масле, адъювант гидроксид алюминия, адъювант витамин Е и их комбинации.

5. Композиция по п. 1, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

6. Композиция по п. 1, где композиция вызывает защитный иммунный ответ против M.hyo при введении одной дозы.

7. Способ иммунизации свиньи против Mycoplama hyopneumoniae (M.hyo), который включает введение свинье композиции по п. 1.

8. Способ по п. 7, где композицию вводят внутримышечно, интрадермально, трансдермально или подкожно.

9. Способ по п. 7, где композицию вводят в виде одной дозы.

10. Способ по п. 7, где композицию вводят свиньям, которые имеют материнские антитела против M.hyo.

11. Способ по п. 7, где композицию вводят свиньям в возрасте 3 недели или старшим.

12. Набор для осуществления способа по п. 7, который включает: флакон, содержащий иммуногенную композицию, которая содержит растворимую часть цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), где растворимая часть цельноклеточного препарата M.hyo содержит M.hyo-специфические растворимые протеиновые антигены и является отделенной от нерастворимого клеточного материала и в сущности является свободной как от (i) lg G, так и от (ii) иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин; и инструкцию для пользователя, содержащую информацию касательно введения иммуногенной композиции.

13. Способ получения иммуногенной композиции по п. 1, где способ включает:

i) культивирование M.hyo в пригодной среде в течение периода в диапазоне 18-144 часа;

ii) потом инактивацию культуры M.hyo;

iii) сбор жидкости инактивированной культуры, где жидкость инактивированной культуры содержит цельноклеточный препарат M.hyo, который содержит как растворимую жидкую фракцию, так и нерастворимый клеточный материал;

iv) отделение растворимой жидкой фракции от нерастворимого клеточного материала; и

v) существенное удаление как lg G, так и иммунокомплексов антиген/иммуноглобулин из отделенной растворимой жидкой фракции.