СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОПТЕРИНА В КРОВИ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/49 

Описание патента на изобретение RU2313092C1

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии.

Неоптерин относится к птеридинам, которые представляют собой гетерогенную группу веществ, производных гуанозинтрифосфата. По химической структуре неоптерин - D-эритро-1`,2`,3`-тригидроксипропилптеридин - промежуточный продукт биохимической трансформации гуанозинтрифосфата в тетрагидробиоптерин. Известно, что последний является естественным кофактором для моноаминоксидаз ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) и NO-синтазы, а также участвует в синтезе таких нейромедиаторрв, как серотонин и дофамин [1]. Нарушение биосинтеза тетрагидробиоптерина вызывает серьезное неврологическое заболевание (атипичная фенилкетонурия). Биологическая функция самого неоптерина до конца не выяснена, хотя установлено, что метаболиты неоптерина являются антиоксидантами. Однако исследования in vitro показали, что совместное действие фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) и 7,8-дигидронеоптерина усиливает апоптоз клеток за счет действия активного кислорода. Кроме того, неоптерин играет определенную роль в механизме цитотоксического действия активированных макрофагов. Повышенная экскреция неоптерина с мочой была обнаружена при заболеваниях, связанных с гиперактивацией клеточного иммунного ответа: инфекциях, вызванных вирусами и внутриклеточными паразитами, реакции отторжения трансплантата, при некоторых неопластических процессах [2]. Гиперпродукция неоптерина характерна для большинства больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями. Уровень неоптерина как в сыворотке крови, так и в моче часто коррелирует с тяжестью и активностью болезни и может использоваться для оценки эффективности терапии. С клинической точки зрения важное значение имеет тот факт, что уровень неоптерина нередко сильнее коррелирует с клинико-лабораторными проявлениями активности и тяжести болезни, чем уровни других маркеров активации клеточного иммунитета - растворимых рецепторов цитокинов: ФНО (рФНО-55Р) и интерлейкина-2 (рИЛ-2Р) [3].

В клинической практике используют измерение уровня неоптерина в различных биологических жидкостях: чаще исследуются сыворотка крови и моча, реже концентрацию неоптерина определяют в синовиальной, спинно-мозговой и амниотической жидкостях [2, 3, 4, 5].

Известен способ определения неоптерина в сыворотке крови методом W.E.Slazyk and F.W.Splerto (1990) [4], заключающийся в том, что к 2 мл плазмы добавляют 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 0,25 мл раствора йода, тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем центрифугируют образцы 30 мин при 4°С и 3100 g и супернатант в объеме 1,75 мл наносят на колонку с катионообменным сорбентом. Колонку промывают 5 мл деионизированной дистиллированной воды и элюируют неоптерин 2 мл 1 М NH4ОН. Элюат нейтрализуют добавлением 30 мкл ледяной уксусной кислоты и 50 мкл получившейся смеси вводят в инжектор. ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Excalibur 250×4,6 мм с сорбентом октадецилсилан (octadecylsilane-ODS) размером частиц 5 мкм со скоростью 1 мл/мин, подвижная фаза метанол-вода в соотношении 15:85, фильтры возбуждения 360-370 нм, фильтры эмиссии 418-700 нм. Применяется предколонка 70×4,6 мм с 5-микронным сорбентом Spherisorb ODS. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ определения неоптерина имеет ряд недостатков. Способ сложен по причине того, что для осуществления его требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Способ требует дополнительного определения креатинина для пересчета конечной концентрации неоптерина. Кроме того, уменьшается точность способа за счет того, что применяемая ТХУ обладает собственной флюоресценцией и ее пик накладывается на пик неоптерина.

Известен способ определения неоптерина в сыворотке крови методом C.Carru et al. (2004) [5], заключающийся в том, что к 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл 5% ТХУ (рН смеси равен 3), перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 g, затем к 50 мкл супернатанта добавляют 200 мкл бидистиллированной воды и из полученной смеси 30 мкл вводят в инжектор. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Waters 250×4,6 мм с сорбентом Spherisorb C18 размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза вода-ацетонитрил в соотношении 99:1 v/v, изократический режим, длина волны возбуждения 353 нм, эмиссии 438 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ определения неоптерина имеет ряд недостатков. Способ сложен по причине того, что для осуществления его также требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Кроме того, уменьшается точность способа за счет того, что применяемая ТХУ обладает собственной флюоресценцией и ее пик накладывается на пик неоптерина.

В качестве прототипа взят способ определения неоптерина по J.J.Rippin (1992) [6], заключающийся в том, что к 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Экстракцию неоптерина проводят на колонке SCX Bond-Elut (propylbenzenesulfonic acid silica sorbent), промытой 1 мл 0,18 M HCl. После нанесения пробы колонку промывают 1 мл метанола и неоптерин элюируют 1 мл смеси NH4OH (308 г/л) в ацетонитриле (1:5), элюат упаривают на воздухе. Сухой остаток растворяют в 100 мкл мобильной фазы, тщательно перемешивают и 20 мкл вводят в петлю. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке 250×4,5 мм с сорбентом ODS2 размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза - 50 мл метанола в 1 л 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,2; изократический режим, длина волны возбуждения 360 нм, эмиссии 440 нм. Применяют предколонку с сорбентом ODS2. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ за счет необходимости экстрагирования неоптерина на колонке SCX Bond-Elut удлиняет время исследования. Способ недостаточно чувствителен, так как при растворении сухого остатка в мобильной фазе с рН 6,2 (в слабокислой среде) снижается растворимость неоптерина, который частично выпадает в осадок и это снижает точность определения. Кроме этого, при использовании подвижной фазы с рН 6,2 вызывается эффект «карамелизации» верхнего слоя сорбента, что снижает точность определения и неблагоприятно действует на колонку, уменьшая срок ее службы.

Для повышения точности способа и скорости определения неоптерина экстракцию проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, а в качестве мобильной фазы для ВЭЖХ-анализа используют смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5.

Способ осуществляют следующим образом. К 100 мкл сыворотки добавляют 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, добавляют смесь хлороформа и метанола в соотношении 1:1, встряхивают в течение 1 мин, центрифугируют 10 мин при 1000 g, отбирают верхний водно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 100 мкл 0,02 М глицинового буфера, 20 мкл полученного раствора вводят в инжектор. Анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер С18 размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин, в качестве мобильной фазы используют смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5; изократический режим, длина волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что применяется жидко-жидкостная экстракция смесью метанол-хлороформ. После добавления в сыворотку данной смеси, встряхивания и центрифугирования образуется чистый водно-метанольный слой, под которым остается хлороформ, удерживающий все неполярные соединения, что позволяет получить экстракты особой чистоты и значительно продлить срок эксплуатации колонки. Если в прототипе сухой остаток после упаривания растворяют в мобильной фазе, то предлагаемый способ подразумевает растворение в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, так как при растворении в мобильной фазе с рН 6,2 снижается растворимость неоптерина и тем самым снижается точность способа. Если в прототипе используется мобильная фаза: 50 мл метанола в 1 л 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,2, то в предлагаемом способе используют в качестве мобильной фазы смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5, так как: а) метанол придает вязкость элюенту, что обусловливает высокое давление в хроматографической системе и износ оборудования; б) применение ацетонитрила позволяет получать высокие и узкие пики, что повышает чувствительность и точность способа, а метанол обусловливает широкие «размытые» пики; в) изопропанол применяется в качестве стабилизатора времен удерживания, так как чем стабильнее время удерживания, тем специфичнее и лучше идентификация вещества; г) используемый элюент устраняет эффект «карамелизации» верхнего слоя сорбента, что увеличивает срок службы колонки; д) в интервале рН 3,5-4,5 определяется максимум флюоресценции неоптерина (таблица 1).

Таблица 1
Зависимость степени флюоресценции неоптерина от молярности и рН буферного компонента мобильной фазы
Тип мобильной фазыМаксимум флюоресценции 10 нг вещества, мВольтМолярностьацетонитрил-изопропанол - 0.001 М цитратный буфер (1:1:98)150ацетонитрил-изопропанол - 0.01-2000.05 М цитратный буфер (1:1:98)ацетонитрил-изопропанол - 0.1 М160цитратный буфер (1:1:98)рНацетонитрил-изопропанол - 0.01-1750.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН 2ацетонитрил-изопропанол - 0.01-2000.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН3,5-4,5ацетонитрил-изопропанол - 0.01-1600.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН 6

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Кровь у здорового донора Б., 22 года, брали из локтевой вены утром натощак и оставляли при комнатной температуре на 1 час до полной ретракции сгустка. Затем пробирку с кровью центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g и отделяли сыворотку для анализа. В одну пробирку типа эппендорф вносили 100 мкл сыворотки, в другую - 100 мкл раствора стандарта неоптерина известной концентрации (D-(+)-Neopterin, Sigma). Добавляли в каждую 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивали, инкубировали 20 мин при комнатной температуре, добавляли смесь хлороформа и метанола в соотношении 1:1, встряхивали в течение 1 мин, центрифугировали 10 мин при 1000 g, отбирали верхний водно-метанольный слой, упаривали, сухой остаток растворяли в 100 мкл 0,02 М глицинового буфера, 20 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора. Анализ проводили на обращенно-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер С18 размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин, в качестве мобильной фазы использовали смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5; изократический режим работы насоса, длина волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. Для регистрации хроматограмм использовался программно-аппаратный комплекс «Multichrom for Windows» («Амперсенд», Россия). Время удерживания пика стандарта (10 нг) - 2,7±0,5 мин, высота - 200 мВ. Время удерживания пика неоптерина биопробы - 2,7±0,5 мин, высота 7 мВ (см. чертеж). Конечную концентрацию неоптерина рассчитывали в программе ChemCalc (© Дутов А.А.), и она составила 3,5 нг/мл.

Пример 2. Больной Д., 52 года, диагноз: рак антрального отдела желудка, T3N1M0. Кровь брали и обрабатывали аналогично примеру 1. Время удерживания пика неоптерина биопробы - 2,7±0,5 мин, высота 31 мВ (см. чертеж). Концентрация неоптерина составила 20 нг/мл.

Данным способом проведено исследование у 15 здоровых доноров 18-23 лет и 10 больных с различной онкопатологией (таблица 2).

Таблица 2
Концентрации неоптерина, определяемые различными способами
ПрототипЗаявляемый способЗдоровые (n=7)<100 нмоль/л-Больные с трансплантацией костного мозга (n=5)100-200 нмоль/л-Здоровые (n=15)-15,9±1,05 нмоль/лБольные с различной онкопатологией (n=10)-20-100 нмоль/л

Воспроизводимость способа оценивали по значению коэффициента вариации (V):

V=(S/M)·100%,

где S - среднеквадратическое отклонение, М - средняя арифметическая. Коэффициент вариации (V) способа составил 6,6%.

Таким образом, предлагаемый способ является более точным, менее трудоемким и обладает высокой воспроизводимостью.

Источники информации

1. Фукс Д., Самсонов М.Ю., Вейс Г. и др. Клиническое значение неоптерина при заболеваниях человека//Тер. архив. - 1993. - №5. - С.80-87.

2. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Орлова О.В. Неоптерин//Лаб. Медицина. - 2001. - №4. - С.55-61.

3. Насонов Е.Л., Самсонов М.Ю., Тилз Г., Фукс Д. Неоптерин: новый иммунологический маркер аутоиммунных ревматических заболеваний//Клин. Медицина. - 2000. - №8. - С.43-46.

4. Slazyk W.E., Splerto F.W. Liquid-chromatographic measurement of biopterin and neopterin in serum and urine/Clin Chem - 1990. - Vol.36. - №7. - P.1364-1368.

5. Carru С., Zinellu A., Sotgia S. et all. A new HPLC method for serum neopterin measurement and relationships with plasma thiols levels in healthy/Biomed Chromatogr - 2004. - Vol.18. - P.360-366.

6. Rippin J.J. Analysis for fully oxidized neopterin in serum by high-performance liquid chromatography/Clin Chem - 1992. - Vol.38. - №9. - P.1722-1724.

Похожие патенты RU2313092C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА 2006
  • Хышиктуев Баир Сергеевич
  • Дутов Алексей Александрович
  • Николаев Сергей Матвеевич
  • Цыдендамбаев Пурбо Будажапович
  • Савин Александр Владимирович
  • Федотова Анастасия Алексеевна
  • Кузнецова Надежда Сергеевна
RU2319141C1
СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ПЕНИЦИЛЛИНОВ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ 2008
  • Дутов Алексей Александрович
  • Пинелис Иосиф Семенович
  • Цыдендамбаев Пурбо Будажапович
  • Турчина Елена Викторовна
  • Хышиктуев Баир Сергеевич
  • Никитин Денис Александрович
  • Терешков Павел Петрович
  • Федотова Анастасия Алексеевна
RU2374648C2
Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии 2016
  • Герунова Людмила Карповна
  • Шитлина Алена Игоревна
  • Темерова Елена Валентиновна
  • Бойко Татьяна Владимировна
  • Герунов Тарас Владимирович
RU2633013C2
Способ определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии 2022
  • Шахова Валерия Николаевна
  • Беляев Валерий Анатольевич
  • Севостьянова Ольга Игоревна
  • Светлакова Елена Валентиновна
  • Говорова Милана Владимировна
  • Жиров Андрей Михайлович
  • Ковалев Дмитрий Анатольевич
RU2786839C1
СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ОКТРЕОТИДА 2010
  • Назаренко Анна Борисовна
  • Балаев Александр Николаевич
  • Федоров Владимир Егорович
  • Ручко Евсей Александрович
RU2441018C1
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТАЗОЛА В БИОСУБСТРАТАХ 1992
  • Маякова Т.И.
  • Кузнецова Э.Э.
  • Швалева А.Б.
RU2091788C1
СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СРОКА ЭКСПЛУАТАЦИИ СОРБЕНТА ПРИ ПРОМЫШЛЕННОЙ ОЧИСТКЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА 2008
  • Гусаров Дмитрий Алексеевич
  • Соколова Ирина Владимировна
  • Ласман Владимир Александрович
  • Баирамашвили Дмитрий Ильич
  • Мирошников Анатолий Иванович
RU2383624C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БЕНЗЭТОНИЯ ХЛОРИДА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ 2013
  • Осипов Алексей Сергеевич
  • Нечаева Екатерина Борисовна
RU2529814C1
НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ 2010
  • Черновская Татьяна Вениаминовна
  • Денисов Лев Александрович
  • Морозов Дмитрий Валентинович
  • Руденко Елена Георгиевна
  • Кленова Ангелина Всеволодовна
RU2447083C1
СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ БУСЕРЕЛИНА 2007
  • Карасев Виктор Семенович
  • Предельский Андрей Дмитриевич
  • Староверов Сергей Михайлович
RU2332248C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 313 092 C1

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОПТЕРИНА В КРОВИ

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается оптимизации ВЭЖХ-определения неоптерина в крови человека. Экстракцию сыворотки проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, после центрифугирования отбирают верхний водно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер C18 размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин в изократическом режиме длиной волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. В качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, изопропанола, 0,01-0,05 М цитратного буфера (1:1:98) с рН 3,5-4,5, который обеспечивает максимум флюоресценции неоптерина. Способ характеризуется относительной простотой и эффективностью экстракции (98%), отличается относительной быстротой определения аналита и высокой воспроизводимостью. 2 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 313 092 C1

Способ определения неоптерина в сыворотке крови, включающий инкубацию сыворотки с раствором Fe-EDTA, экстракцию и ВЭЖХ-анализ, отличающийся тем, что экстракцию проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, экстракт центрифугируют 10 мин. при 1000 g, отбирают верхний вводно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, ВЭЖХ-анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер C18 размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин. в изократическом режиме длиной волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм, а в качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, изопропанола, 0,01-0,05 М цитратного буфера в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2313092C1

RIPPIN J.J
Analysis for fully oxidized neopterin in serum by high-performance liquid chromatography
Clin
Chem., 09.1992, Vol.38, №9, p.1722-1724
CARRU С
et al
A new HPLC method for serum neopterin measurement and relationships with plasma thiols levels in healthy subjects
Biomed Chromatogr
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов 1921
  • Ланговой С.П.
  • Рейзнек А.Р.
SU7A1
SLAZYK et al.

RU 2 313 092 C1

Авторы

Дутов Алексей Александрович

Цыдендамбаев Пурбо Будажапович

Терешков Павел Петрович

Ринчинов Зорикто Цыбикжапович

Никитин Денис Александрович

Федотова Анастасия Алексеевна

Хышиктуев Баир Сергеевич

Даты

2007-12-20Публикация

2006-02-26Подача