СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СРОКА ЭКСПЛУАТАЦИИ СОРБЕНТА ПРИ ПРОМЫШЛЕННОЙ ОЧИСТКЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

Рекомбинантный проинсулин, полученный из генетически модифицированных микроорганизмов, после предварительных стадий правильного замыкания дисульфидных связей и очистки подвергается ферментативному расщеплению, образуя инсулин. Однако в гидролизате помимо целевого белка в результате содержатся нежелательные примесные продукты, обладающие физико-химическими свойствами, близкими к свойствам инсулина, что усложняет задачу очистки инсулина. В связи с этим разработка эффективного способа очистки инсулина является актуальной задачей.

Известен способ очистки инсулина с помощью гидрофобной хроматографии низкого давления. Инсулин, полученный с помощью ферментативного расщепления рекомбинантного проинсулина трипсином и карбоксипептидазой Б, подвергают очистке с помощью гидрофобной хроматографии на сорбенте Бутил-тойоперл. Для чего инсулин осаждают 2 М хлоридом натрия, осадок отделяют и растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М и доводят рН до 6,6. Хроматографическую колонну уравновешивают раствором 0,5 М хлорида натрия (рН 6,6). Наносят раствор инсулина на колонну, упакованную сорбентом Butyl Toyopearl 650S. Инсулин десорбируют этиловым спиртом в цитратном буфере (концентрация этилового спирта от 10 до 23%). Основную фракцию инсулина, элюированного с колонны, осаждают 3 М хлоридом натрия. Осадок отделяют, растворяют в 1,0 М уксусной кислоте и подвергают гель-фильтрации на сорбенте сефадекс G50 с последующей кристаллизацией и лиофилизацией продукта. Полученную субстанцию инсулина используют для изготовления готовых лекарственных форм.

(Пат. РФ №2322504, МПК С12Р 21/00, опублик.20.04.2008.)

К недостаткам способа следует отнести низкий выход целевого продукта (не более 40%) и значительный расход реагентов на приготовление подвижных фаз.

Известен способ очистки инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). К раствору-гидролизату инсулина, полученного в результате ферментативного расщепления рекомбинантного предшественника, добавляют трифторуксусную кислоту (для снижения рН до 3,0) и ацетонитрил до концентрации 20% об. ВЭЖХ-колонну, упакованную сорбентом Кромасил С8, уравновешивают водным раствором ацетонитрила (30% об.), содержащим 0,25% пентафторпропионовой кислоты. Раствор инсулина наносят на колонну при 30°С. Десорбируют инсулин подвижной фазой, содержащей 0,25% пентафторпропионовой кислоты, в градиенте концентрации ацетонитрила. Основную фракцию элюированного инсулина собирают и анализируют.

(Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "Integrated production of human insulin and its C-peptide", Journal of biotechnology, 1996, v.48, p.241-250.)

К недостаткам способа следует отнести относительно низкий выход целевого белка (54%), а также использование дорогостоящего и опасного ацетонитрила.

Известен способ очистки инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на полимерном сорбенте (например, PLRP-S). Хроматографическую колонну уравновешивают подвижной фазой, содержащей 0,05 М ацетата аммония, 0,1 М глицина (рН 9,0). Наносят образец инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой, содержащей 0,05 М ацетата аммония, 0,1 М глицина (рН9,0), в градиенте пропанола-1 или пропанола-2. Основную фракцию инсулина собирают и анализируют.

(W. Sievers et al, Procedure of the Chromatographic purification of insulins, Patent USA №6710167, 2004.)

К недостаткам способа следует отнести низкую производительность, использование высоких значений рН, а также низкую степень очистки инсулина от иммуннореактивных полипептидов.

Известен способ очистки инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на полимерном сорбенте (Source S 15). Хроматографическую колонну уравновешивают подвижной фазой, содержащей 30% пропанола-1, 50 мМ молочной кислоты, 0,01 М хлорида натрия (рН 3,5). Наносят образец инсулина. Затем снова уравновешивают колонну той же подвижной фазой. Десорбируют инсулин подвижной фазой, содержащей 30% пропанол-1, 50 мМ молочной кислоты, в градиенте концентрации хлорида натрия от 0,01 до 0,15 М. Основную фракцию инсулина собирают и анализируют.

(R.Obermeier, Process for isolating insulin by high-pressure liquid chromatography, United States Patent №5977297, 1999.)

К недостаткам способа следует отнести использование дорогостоящего сорбента, низкую производительность (на одном литре сорбента очищают не более 6 грамм инсулина).

Известен способ очистки инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на сорбенте Кромасил С8. Хроматографическую колонну уравновешивают подвижной фазой, содержащей буфер ацетата аммония (рН 4) и этиловый спирт (10% об.). Наносят образец инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой, содержащей буфер ацетата аммония (рН 4), в градиенте концентрации этилового спирта от 27 до 30%.

(Degerman, N. Jakobsson, В. Nilsson, "Modeling and optimization of preparative reversed-phase liquid chromatography for insulin purification", Journal of Chromatography A (2007), V.1162, Issue 1, p.41-49.)

Недостатком известного метода является низкая концентрация инсулина в элюате, что связано с ограниченной растворимостью инсулина в буфере ацетата аммония.

Известен наиболее близкий к заявленному способ очистки инсулина, основанный на высокоэффективной жидкостной хроматографии на модифицированном силикагелевом сорбенте Кромасил С8. Хроматографическую колонну уравновешивают подвижной фазой, содержащей 10 мМ лимонной кислоты (рН 2-3) и 20% об. этилового спирта. Наносят образец инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой, содержащей 10 мМ лимонной кислоты, 70 мМ сульфата аммония (рН 2-3), в градиенте этилового спирта от 30 до 35%.

(Д.А. Гусаров, В.В. Востриков, Е.А. Ручко, В.А. Ласман, А.В. Михалев, Д.И. Баирамашвили, "Использование ОФ ВЭЖХ для очистки генно-инженерного инсулина человека", Биотехнология, 2006, №2, стр.44-49.)

Недостатками известного метода являются частичная полимеризация (волокнообразование) инсулина и инсулиноподобных пептидов в порах сорбента, что существенно сокращает срок эксплуатации сорбента (не более 30 циклов очистки в режиме рабочей нагрузки на сорбент, заявленной авторами известного метода), а следовательно, увеличивает стоимость одной стадии очистки.

Изобретение решает задачу продления срока эксплуатации сорбента за счет снижения степени полимеризации (волокнообразования) инсулина и инсулиноподобных пептидов внутри пор сорбента.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе промышленной очистки генно-инженерного инсулина человека, включающем высокоэффективную жидкостную хроматографию с использованием подвижной фазы и регенерацию сорбента, в качестве подвижной фазы используют смесь органического модификатора, органической кислоты и сложного эфира органической кислоты, при этом в качестве органического модификатора используют метиловый, этиловый, изопропиловый, пропиловый спирт или ацетонитрил, в качестве органической кислоты используют муравьиную, уксусную или пропионовую кислоту, а в качестве сложного эфира органической кислоты - метилацетат, этилацетат, метилформиат, этилформиат или этилацетоацетат, при следующем соотношении компонентов смеси, % об.:

органический модификатор 2,0-25,0 органическая кислота 0,2-5,0 сложный эфир органической кислоты 0,001-5,0 вода для инъекций остальное

Техническим результатом изобретения является увеличение срока эксплуатации сорбента (количества циклов очистки инсулина не менее 50) за счет использования в составе подвижной фазы смеси органической кислоты и сложного эфира органической кислоты, препятствующих образованию полимеров инсулина или инсулиноподобных пептидов внутри пор сорбента.

Способ осуществляют следующим образом.

Гибридный белок, содержащий проинсулин человека и полученный в ходе ферментации штамм-продуцента, выделяют из телец включения, растворяют с одновременным восстановлением дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА динатриевой соли, ренатурируют и очищают ионообменной хроматографией, затем подвергают совместному расщеплению ферментами трипсином и карбоксипептидазой Б, в ходе которого образуется инсулин человека и ряд примесей. Очистку инсулина проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующией гель-фильтрацией и кристаллизацией в присутствии солей цинка.

Подвижная фаза, используемая для хроматографической очистки инсулина, содержит 2-25% об. органического модификатора, выбранного из группы, содержащей метиловый, этиловый, изопропиловый, пропиловый спирты и ацетонитрил, 0,2-5,0% об. органической кислоты, в которой минимально протекает полимеризация (волокнообразование) инсулина или инсулиноподобных пептидов: муравьиной, уксусной или пропионовой, 0,001-5,0% сложного эфира органической кислоты, выбранного из группы, содержащей метилацетат, этилацетат, метилформиат, этилформиат или этилацетоацетат (остальное - вода для инъекций). Хроматографическую колонну упаковывают силикагелевым или полимерным сорбентом: YMC-Basic, Кромасил С8, Daiso С18 и т.п.

Уравновешивают колонну подвижной фазой. Подвижная фаза содержит 2-25% органического модификатора, 0,2-5,0% органической кислоты, 0,001-5,0% сложного эфира органической кислоты и 50-98% воды для инъекций.

Раствор инсулина, полученного в ходе ферментативного расщепления рекомбинантного предшественника инсулина, осаждают 0,1 М ацетатом цинка, осадок отделяют и растворяют в подвижной фазе до концентрации инсулина 5-25 мг/мл. Полученный раствор наносят на хроматографическую колонну.

Десорбируют инсулин подвижной фазой, повышая в ней концентрацию органического модификатора методом градиентного элюирования до начала выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину или дезамидированному инсулину (например, А21-дезамидоинсулину), после чего элюирование ведут в изократическом режиме концентрации органического модификатора в подвижной фазе.

После выхода основной фракции инсулина проводят регенерацию сорбента раствором 50% об. органического модификатора в воде для инъекций. Очищенный инсулин подвергают гель-фильтрации, кристаллизации цинком и последующей лиофилизации.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Используют хроматографическую систему Akta Design 100 (Amersham Biosciences, Швеция), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Хроматографическую колонну, размером 20x100 мм, упаковывают силикагелевым сорбентом Daiso С18 (размер частиц 10 мкм, пористость 20 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 2% об. этилового спирта, 0,2% об. уксусной кислоты, 0,001% об. метилацетата, остальное - вода для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой в объеме 60 мл со скоростью 5 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 5 мл/мин, повышая концентрацию этилового спирта с помощью системы для создания градиента до начала выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации этилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 77%, чистота инсулина 98,5%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным этиловым спиртом в объеме 45 мл со скоростью 5 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 56 циклов очистки инсулина.

Пример 2

Используют хроматографическую систему Akta Design 100 (Amersham Biosciences, Швеция), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Хроматографическую колонну, размером 20×100 мм, упаковывают силикагелевым сорбентом Кромасил С8 (размер частиц 10 мкм, пористость 10 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 10% об. этилового спирта, 2,5% об. уксусной кислоты, 2,5% об. этилацетоацетат и 85% об. воды для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой в объеме 60 мл со скоростью 5 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 5 мл/мин, повышая концентрацию этилового спирта с помощью системы для создания градиента до появления хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации этилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 81%, чистота инсулина 98,5%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным этиловым спиртом в объеме 45 мл со скоростью 5 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 62 цикла очистки инсулина.

Пример 3

Используют хроматографическую систему Akta Design 100 (Amersham Biosciences, Швеция), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Хроматографическую колонну, размером 20×100 мм, упаковывают полимерным сорбентом HPR10 (размер частиц 10 мкм, пористость 10 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 2% об. метилового спирта, 5% об. муравьиной кислоты, 5% об. этилацетата и 88% об. воды для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой в объеме 60 мл со скоростью 5 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 5 мл/мин, повышая концентрацию метилового спирта с помощью системы для создания градиента до появления хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации метилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 79%, чистота инсулина 98,4%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным метиловым спиртом в объеме 45 мл со скоростью 5 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 68 циклов очистки инсулина.

Пример 4

Используют хроматографическую систему Agilent 1100 (Agilent Technologies, США), включающую насос для подачи подвижной фазы и УФ-детектор. Используют хроматографическую колонну, размером 20×250 мм, упакованную силикагелевым сорбентом YMC-Basic (размер частиц 10 мкм, пористость 20 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 25% об. ацетонитрила, 1,0% об. пропионовой кислоты, 0,05% об. этилформиата, остальное - вода для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой в объеме 80 мл со скоростью 5 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 5 мл/мин в изократическом режиме концентрации ацетонитрила в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 87%, чистота инсулина 98,5%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным ацетонитрилом в объеме 80 мл со скоростью 5 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 69 циклов очистки инсулина.

Пример 5

Используют хроматографическую систему Agilent 1100 (Agilent Technologies, США), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Используют хроматографическую колонну, размером 20×250 мм, упакованную силикагелевым сорбентом YMC-Basic (размер частиц 10 мкм, пористость 20 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 2% об. изопропилового спирта, 2,5% об. уксусной кислоты, 2,5% об. метилформиат и 93% об. воды для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой в объеме 80 мл со скоростью 3 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 3 мл/мин, повышая концентрацию изопропилового спирта с помощью системы для создания градиента до появления хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации изопропилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 67%, чистота инсулина 98,5%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным изопропиловым спиртом в объеме 80 мл со скоростью 3 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 52 цикла очистки инсулина.

Пример 6

Используют хроматографическую систему Agilent 1100 (Agilent Technologies, США), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Используют хроматографическую колонну, размером 20×250 мм, упакованную силикагелевым сорбентом YMC-Basic (размер частиц 10 мкм, пористость 20 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 2% об. пропилового спирта, 2,5% об. уксусной кислоты, 2,5% об. метилацетат и 93% об. воды для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну первой подвижной фазой в объеме 80 мл со скоростью 3 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 3 мл/мин, повышая концентрацию пропилового спирта с помощью системы для создания градиента до появления хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации пропилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 65%, чистота инсулина 98,3%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным пропиловым спиртом в объеме 80 мл со скоростью 3 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 52 цикла очистки инсулина.

Пример 7.

Используют хроматографическую систему YMC (YMC Europe Со, Германия), включающую насос для подачи подвижной фазы, систему для создания градиента и УФ-детектор. Хроматографическую колонну аксиального сжатия, размером 150×600 мм (высота слоя сорбента около 200 мм), упаковывают силикагелевым сорбентом YMC-Basic (размер частиц 15 мкм, пористость 20 нм). Готовят подвижную фазу, которая содержит 10% об. этилового спирта, 0,8% об. уксусной кислоты, 0,02% об. этилацетата, остальное - вода для инъекций. Уравновешивают хроматографическую колонну первой подвижной фазой в объеме 5000 мл со скоростью 200 мл/мин. Наносят на колонну раствор инсулина. Десорбируют инсулин подвижной фазой со скоростью 200 мл/мин, повышая концентрацию этилового спирта с помощью системы для создания градиента до появления хроматографического пика, соответствующего инсулину, после чего ведут процесс в изократическом режиме концентрации этилового спирта в подвижной фазе до окончания выхода хроматографического пика, соответствующего инсулину. Основную фракцию, содержащую инсулин, собирают и анализируют. Выход основной фракции 82%, чистота инсулина 98,6%. Хроматографическую колонну регенерируют 50% об. водным этиловым спиртом в объеме 5000 мл со скоростью 200 мл/мин.

Эксплуатация сорбента таким способом позволила провести 60 препаративных циклов очистки инсулина.

Способ относится к области биотехнологии, а именно к способу увеличения срока эксплуатации сорбента при промышленной очистке генно-инженерного инсулина человека. Способ включает высокоэффективную жидкостную хроматографию с использованием подвижной фазы, содержащей смесь органического модификатора, органической кислоты и сложного эфира органической кислоты, с последующей регенерацией сорбента раствором 50% органического модификатора в воде для инъекций. В качестве органического модификатора используют метиловый, этиловый, изопропиловый, пропиловый спирт или ацетонитрил. В качестве органической кислоты используют муравьиную, уксусную или пропионовую кислоту. В качестве сложного эфира органической кислоты - метилацетат, этилацетат, метилформиат, этилформиат или этилацетоацетат. Изобретение позволяет увеличить срок эксплуатации сорбента при промышленной очистке генно-инженерного инсулина человека.

Способ увеличения срока эксплуатации сорбента при промышленной очистке генно-инженерного инсулина человека, включающий высокоэффективную жидкостную хроматографию с использованием подвижной фазы и регенерацию сорбента раствором 50%-ного органического модификатора в воде для инъекций, отличающийся тем, что в качестве подвижной фазы используют смесь органического модификатора, органической кислоты и сложного эфира органической кислоты, при этом в качестве органического модификатора используют метиловый, этиловый, изопропиловый, пропиловый спирт или ацетонитрил, в качестве органической кислоты используют муравьиную, уксусную или пропионовую кислоту, а в качестве сложного эфира органической кислоты - метилацетат, этилацетат, метилформиат, этилформиат или этилацетоацетат при следующем соотношении компонентов смеси, об.%:
органический модификатор 2,0-25,0 органическая кислота 0,2-5,0 сложный эфир органической кислоты 0,001-5,0 вода для инъекций остальное