КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ИНЪЕКЦИОННЫХ РАСТВОРОВ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/00 A61K9/10 

1. Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение главным образом относится к способам контролируемого высвобождения инъецируемых лекарственных средств и более конкретно к контролируемому высвобождению вакцин, которые продлевают действие инъецируемых лекарственных средств, или регулируют длительность индукции иммунного ответа в течение длительного времени после инъекции за счет медленного высвобождения лекарственного средства или вакцины в кровеносную систему.

2. Предпосылки к созданию изобретения

В настоящее время вакцинации включают необходимость проведения многократных инъекций в течение времени для формирования защитной памяти иммунного ответа. Поскольку иммунная система только умеренно отвечает на первичный контакт с антигенами, необходимо повторение инъекций. Иммунитет представляет собой адаптивный или изученный процесс, при котором каждое последующее воздействие антигена на организм вызывает более сильный ответ антител. Этот ответ более сильный не только по количеству образовавшихся антител, но также по средней аффинности (эффективности присоединения или связывания антитела с антигеном). Аффинность увеличивается, так как только те В клетки, которые обладают высокоаффинными рецепторами, селективно запускаются в пролиферацию и продолжают функционировать на более поздних стадиях иммунного ответа при снижении концентрации антигена. Сразу после инъекции несомненно концентрация антигена является достаточно высокой для активации рецепторов как высокой, так и низкой аффинности. При повторных инъекциях антигена образуется большее количество В лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела через усиленную пролиферацию и продолжающих функционировать как клетки «памяти», увеличивая таким образом количество антител.

Обычно при вакцинации детей от дифтерии, столбняка и коклюша (КДС) первоначальную дозу вакцины необходимо вводить в возрасте 2 месяцев, первую инъекцию активной иммунизации - в возрасте 4 месяцев, вторую активную иммунизацию - в возрасте 6 месяцев, другие дозы - в 15-18 месяцев и рекомендуемую конечную дозу - в возрасте 4-6 лет (Центры контроля и профилактики заболеваний, Национальная программа иммунизации). Для других вакцин требуются похожие схемы. Эти инъекции вакцин причиняют боль и вызывают тяжелое недомогание, особенно у младенцев; поэтому для последующих инъекций детей зачастую не приводят.В результате схема иммунизации срывается и дети не защищены от заболеваний должным образом. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила этот отказ - соблюдать схему иммунизации - как широко распространенное явление, в результате подвергающее риску кампании по массовой иммунизации. (Jodar L., Aguado T., Lloyd J. и Lambert P-H (1998) Revolutionizing Immunizations Gen. Bug. News 18 p.6).

Для того чтобы решить эту проблему, было предпринято множество попыток для разработки методик, уменьшающих количество необходимых инъекций. Один подход представляет собой вакцины с контролируемым высвобождением, которые продлевают продолжительность индукции иммунного ответа в течение долгого времени после каждой инъекции, посредством медленного высвобождения вакцины в кровоток. Большинство работ до настоящего времени направлены на противостолбнячную вакцину, инкапсулированную в биоразлагаемые пластические микросферы из полилактид/гликолидных полимеров [(Xing D.K.L., McLellan K., Corbel M.J., и Sesardic D. (1996) Estimation of antigenic tetanus toxoid extracted from biodegradable microspheres. Biologicals 24, 57-65]. Биоразлагаемые пластмассы медленно растворяются в жидкостях организма, тем самым постепенно высвобождая вакцину из разрушенных гидрофобных частиц после инъекции. Однако было обнаружено, что данные вакцины не стабильны в организме, поэтому предыдущие результаты были неутешительными, но благодаря современным составам эти проблемы преодолены, и теперь противостолбнячная вакцина действительно приемлемо работает в этой системе. Однако другие недолговечные вакцины не стабильны в пластических частицах в организме при 37°С. По этой причине отсутствует другой регулятор высвобождения вакцины, используемый в настоящее время.

В ходе разработки стабильных жидкостей для инъекций [патентная заявка США №09/271204 Композиция и способ получения стабильных жидкостей для инъекций] были изучены стабилизированные составы противостолбнячной вакцины в растворимых микросферах сахарного стекла, суспендированных в безводных маслах или перфторуглеродных жидкостях. Используемый стабилизирующий агент представлял собой растворимое сахарное стекло сахарного спирта маннита, которое предположительно при контакте с жидкостью организма сразу растворяется и высвобождает вакцину в виде стандартной первоначальной дозы. В доклинических испытаниях стабильные жидкие составы вводили подкожно группам из 10 морских свинок. Сухая вакцина была испытана вскоре после изготовления (фигура 1) и затем была испытана на стабильность 3 месяцами ускоренного старения при 37°С (фигура 2).

Аликвоты сухой вакцины, стабилизированной в сахарном стекле, растворяли в воде перед инъекцией и использовали в качестве контроля так же как и вакцину из только что полученного источника в качестве стандарта биологического контроля приготовления вакцины. Реакции антител оценивали на 4, 8, и 12 неделях после инъекции.

Было обнаружено, что все контрольные вакцины вызывали типичную кинетическую реакцию титра антител после первоначальной дозы, а именно уровни антител достигали максимума на 4-8 неделях и затем снижались к 12 неделе. Однако в тех случаях, когда инъекции в обеих группах проводили вакциной, стабилизированной в микросферах стеклянного композиционного материала из сахара и фосфата кальция, суспендированных в безводных биосовместимых жидкостях, уровни антител у этих животных продолжали нарастать на протяжении всех 12 недель после инъекции. Такой результат, ранее не наблюдаемый при иммунизации морских свинок столбнячным анатоксином, показал четко выраженное изменение кинетики продукции антител. При сравнении исторических результатов изучения кинетики антител у морских свинок, которым проводили инъекции повторяющихся доз стандартных вакцин, настоящие исследования указывали на контролируемое высвобождение антигена. Возрастающие уровни антител, наблюдаемые в настоящем исследовании на 12 неделе, указывали на защиту животных, равноценную той, которую наблюдали после курса многократных инъекций стандартной растворимой вакцины.

Хотя подтверждено, что сахарные стекла являются эффективными для обеспечения стабильной среды для нестабильных биологических молекул, другие водорастворимые стекла, такие как карбоксилаты металлов и подобные стекла (Стеклоподобные системы медленного высвобождения PCT № WO 90/11756) и фосфатные стекла (Фосфатная стеклокерамика для биологического и медицинского применения Патент США №4,698,318) также могут быть изготовлены в виде стеклянных микросфер или в сочетании с сахарными стеклами, или отдельно (Аморфные стекла для стабилизации чувствительных продуктов. Заявка PCT WO 99/47174) и обладать другими желаемыми свойствами, которые удовлетворяют требованиям использования в этой системе. Эти свойства включают возможность предварительного определения скорости, при которой растворяется стекло путем формирования его из смеси солей с отдельными различными скоростями растворения в воде (Устройство регулируемой доставки, Патент США №5270048).

Стабильные жидкие составы в безводных биосовместимых жидкостях первоначально были разработаны для решения двух главных проблем, а именно: необходимости замораживания лекарственных средств или вакцин для хранения и необходимости их восстановления стерильной водой перед инъекцией. Это не только несомненное технологическое преодоление этих недостатков, по-видимому, эти составы в безводных жидкостях также решают проблему соблюдения схемы иммунизации. Согласно настоящему изобретению удобная, готовая к введению стабильная вакцина обеспечивает полный курс иммунизации с однократной инъекцией.

Существует гипотеза, что некоторые из микросфер из растворимого стекла, содержащих стабилизированную вакцину, защищены от разложения на составные части в жидкости организма за счет остаточного окружения безводной жидкостью. Они разлагаются только через некоторое время после инъекции для высвобождения вакцины, которая затем действует как активная иммунизирующая доза, дающая возрастающие уровни антител на протяжении всех 12 недель эксперимента.

С препаратами безводных жидкостей на 4 неделе существует более низкий средний уровень антител, чем с растворимым антигеном. Такой более низкий начальный титр в группе, которой вводили безводную жидкую суспензию вакцин, является спорным результатом более низкой дозы антигена, которая высвобождалась вскоре после инъекции. Некоторые могут утверждать, что это указывает на проблему иммунной реакции замедленного типа, однако, протективный уровень антител в этой системе приблизительно составляет 0,1 международных единиц на миллилитр крови. Уровни, наблюдаемые у морских свинок на 4 неделе, были более 1 международной единицы на миллилитр, значительно выше протективного уровня даже на такой ранней стадии.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет собой композицию и способ контролируемого высвобождения инъекционных растворов с использованием стеклянных микросфер, суспендированных в безводных жидкостях, таких как масла, силиконовые жидкости или перфторуглероды, причем медленное, контролируемое растворение микросфер и высвобождение антигена происходит на протяжении значительного периода времени после инъекции.

Для лучшего понимания настоящего изобретения, а также с другой и последующей целями сделаны ссылки на описание, изобретение вместе с прилагаемыми чертежами и объем его притязаний будет показан в прилагаемой формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлены средние титры антител в группе из 10 морских свинок, которым парентерально вводили в день 0 0,5 мл вакцины и брали кровь на 4, 8 и 12 неделе после этого.

На фиг.2 представлены средние титры антител в группе из 10 морских свинок, которым парентерально вводили в день 0 по 0,5 мл вакцины и брали кровь на 4, 8 и 12 неделе после этого.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном воплощении изобретения, со ссылкой на фиг.1, группам из 10 морских свинок парентерально вводили в день 0 по 0,5 мл вакцины и брали кровь на 4, 8 и 12 неделях после этого. В первой группе животным парентерально вводили свежую жидкую вакцину от производителя (Medeva batch T022). Средний титр антител у животных, получавших свежую вакцину, был выше, чем в группах, получавших сухую вакцину, что говорит о некоторой потере иммуногенности вследствие процесса высушивания. Другим 10 животным парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер сахарного стекла и повторно гидратированную водой непосредственно перед инъекцией, как показано во второй группе. Третья группа показывает животных, которым парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер сахарного стекла, суспендированных в 0,5 мл масла сквалана. Четвертая группа показывает животных, которым парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер сахарного стекла, суспендированных в 0,5 мл перфтордекалина. Наконец, в пятой группе животным парентерально вводили порошок микросфер сахарного стекла, несодержавших вакцины, суспендированных в 0,5 мл сквалана, и в шестой группе животным парентерально вводили порошок микросфер сахарного стекла, не содержащих вакцины, суспендированных в 0,5 мл перфтордекалина. Тогда как титр антител в первых двух группах животных, которым парентерально вводили водные вакцины, снижался на 12 неделе после инъекции, титр в группах, которым парентерально вводили вакцину в масле или ПФУ, не снижался к 12 неделе. В пятой и шестой группах животных, которым парентерально вводили только состав наполнителя, отсутствовал антительный ответ.

Фигура 2 иллюстрирует вариант осуществления изобретения, где средние титры антител в группах из 10 морских свинок были измерены после парентерального введения им в день 0 0,5 мл вакцины и взятия крови на 4, 8 и 12 неделе после этого. В первой группе животным парентерально вводили свежую жидкую вакцину от производителя, которую хранили при 4°C в течение 3 месяцев. Другой группе животных парентерально вводили свежую жидкую вакцину от производителя, которую хранили при 37°C в течение 3 месяцев, как показано во второй группе. Третья группа представляет животных, которым парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер сахарного стекла, которую хранили при 37°C в течение 3 месяцев и регидрировали водой непосредственно перед инъекцией. Четвертая группа показывает животных, которым парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер из сахарного стекла и суспендированную в 0,5 мл сквалана и хранившуюся в сквалане при 37°C в течение 3 месяцев до инъекции. Наконец, пятая группа показывает животных, которым парентерально вводили вакцину, высушенную до порошка микросфер сахарного стекла и суспендированную в 0,5 мл перфтордекалина и хранившуюся в ПФУ при 37°C в течение 3 месяцев до инъекции. В этом конкретном варианте осуществления титр антител у животных, получавших свежую вакцину, был выше, чем в группах, получавших сухую вакцину, что означает некоторую потерю иммуногенности вследствие процесса высушивания. Тогда как титр антител в двух группах животных, которым парентерально вводили водные вакцины, хранившиеся либо влажными либо сухими при 37°C, снижался на 8 и 12 неделях после инъекции, титр в двух группах, которым парентерально вводили вакцину в масле или ПФУ прогрессивно увеличивался на протяжении 12 недель.

Эксперименты in vitro дали возможность предположить, что ПФУ могли обеспечить непосредственное высвобождение из стеклянных микросфер, суспендированных в них. Эксперименты включали в себя внесение водорастворимого красителя (Mordant Blue 9) в микросферы сахарного стекла и суспендирование их в 10% мас./об. перфтордекалине. При добавлении 0,5 мл этой непрозрачной темно-синей суспензии к 1,5 мл воды. ПФУ суспензия опускалась на дно пробирки с четким водным слоем наверху. После перемешивания интенсивным встряхиванием приблизительно в течение одной минуты и выдерживания в течение дополнительной минуты верхний водный слой становился насыщенно ярко-синим, а слой ПФУ становился прозрачным. Осветление непрозрачного слоя указывало на то, что частицы, суспендированные в ПФУ жидкости, растворились. Перемещение синей окраски из ПФУ в водный слой показало, что, как ожидалось, весь гидрофильный краситель растворился в воде.

ПРИМЕР 1

Использование легко анализируемого белка в качестве модели вакцины подтверждает вышеуказанные результаты. Был выбран фермент - щелочная фосфатаза. Готовили следующий раствор: фосфат кальция в качестве адъюванта (Adjuvant grade) 10% мас./об. (Superphos Kemi a/s); Трегалоза, 10% мас./об.; ZnCl₂ 1 мМ; MgCl₂, 1 мМ; Щелочная фосфатаза, 20 Ед/мл в 5 мМ Трис HCl буфере, pH 7,6.

Суспензию хорошо перемешивали в течение 10 минут при 37°C, чтобы дать возможность нерастворимому фосфату кальция адсорбировать растворимую щелочную фосфатазу. Абсорбцию измеряли центрифугированием малых аликвот суспензии для осаждения фосфата кальция из суспензии, взятием пробы раствора супернатанта и определением его ферментативной кинетики с использованием п-нитрофенилфосфата в качестве субстрата и при длине волны 405 нм. Оставшуюся суспензию затем сушили распылением до получения тонкоизмельченного порошка. Любую десорбцию фермента после регидратации порошка определяли в супернатанте, как указано выше. Порошок суспендировали при 20% мас./об. в перфторфенантрене и получали образование стабильной суспензии.

Таблица 1.Тестируемый образецПоглощение/мин (405 нм)%Исходный раствор (25 мкл)0,409100Супернатант (25 мкл) из вышеуказанного0,0348Регидратированный порошок (25 мкл 20% мас./об. в воде)0,425104Супернатант из вышеуказанного (25 мкл)0,004120% мас./об. порошка в ПФУ (25 мкл)0,430105

Таким образом, 92% фермента было адсорбировано на адъювант фосфат кальция (таблица 1). В конечном счете, весь фермент был восстановлен для исследования ферментативной активности после суспендирования в ПФУ в микросферах трегалозного стекла. Их повторно растворяли в воде как в вышеприведенном примере с синим красителем.

Этот эксперимент дает возможность предположить, что стеклянные микросферы, суспендированные в ПФУ, быстро растворяются при смешивании с водой in vitro, что могло бы указывать на то, что эти препараты также быстро высвобождали бы антиген in vivo. Однако, по-видимому, это не так. Неожиданно они продемонстрировали медленное контролируемое высвобождение антигена в рассматриваемый период времени после инъекции. Высвобождение антигена в этой системе сходно тому, которое, полагают, встречается в некоторых жидких эмульсиях адъюванта, основанных на масле, которые используют у животных, например полный адъювант Фрейнда. Полагают, что медленное просачивание антигена из капель раствора антигена, диспергированного в минеральном масле, в составе адъювант Фрейнда, является ответственным за сильное увеличение иммунных ответов, обнаруженное у животных, иммунизированных таким образом. [(Freund J. Some aspects of active immunization. Ann. Rev. Microbiol 1 291 (1947).] Сходные результаты были получены после иммунизации антигенами, стабилизированными в микросферах сахарного стекла, суспендированных в безводных биосовместимых жидкостях. Главное отличие между адъювантом Фрейнда и настоящей системой состоит в том, что первый представляет собой жидкую эмульсию капель раствора антигена в масле и, следовательно, по своей природе нестабилен, тогда как последняя представляет собой стабилизированное сухое твердое вещество в суспензии стеклянных микросфер, и, следовательно, по своей природе стабильна. Кроме того, адъювант Фрейнда является сильным раздражающим средством и неприемлем для использования у людей [(Immunological adjuvants report of a WHO scientific group meeting held in Geneva from 6 to 10 October 1975) 1976], тогда как ПФУ состав, используемый в настоящем изобретении, не является токсичным. Он не вызывает ни немедленного, ни отсроченного раздражения или воспаления после инъекции. Следовательно, он идеально подходит для разработки однократной дозы вакцины для применения у людей, особенно у детей, поскольку отсутствие раздражения является дополнительным преимуществом. Возможность этих составов контролировать высвобождение активных веществ, стабилизированных в растворимых стеклянных микросферах, конечно не ограничено вакцинами. Для большого разнообразия других лекарственных средств требуются повторные инъекции для их терапевтического действия. Действительно, необычно, чтобы лекарственное средство, вводимое парентерально, было эффективно в однократной дозе. В каждом случае скорость высвобождения активной молекулы из твердого раствора в растворимом стекле в свободный раствор в жидкости тела нуждалась бы в точном контроле и была бы различной для каждой другой активной молекулы.

Хотя в данной системе могут быть использованы разнообразные биосовместимые жидкости, предпочтительными являются ПФУ благодаря их высокой химической и физической стабильности, отсутствию токсичности, низкой вязкости и поверхностному натяжению и высокой плотности.

ТАБЛИЦА 2.
Физико-химические свойства некоторых перфторуглеродов.ПФУММПлотность (кг/л)Вязкость (мПа)Поверхностное натяжение (мН/м)Давление пара (мБар)-гексан3881,680,6611,10294-н-октан4381,750,12716,9852-декалин4621,925,1017,608,8-фенантрен6242,0328,4019,00<1

Может быть получено большое число ПФУ жидкостей в зависимости от конкретной исходной молекулы углеводорода, которая фторирована. Возможно, что скорость поступления из тканей в кровоток и удаление из организма в выдыхаемый воздух является функцией давления пара ПФУ при температуре тела. Это, в свою очередь, в большинстве случаев пропорционально молекулярной массе. (таблица 2). При тщательном выборе конкретного ПФУ, вероятно, что скорость контролированного высвобождения может изменяться в широком диапазоне. Поскольку ПФУ жидкости также могут быть смешаны вместе, скорости высвобождения могут быть точно установлены путем выбора соответствующей смеси ПФУ жидкостей.

Фосфат кальция, используемый в качестве вещества для подбора плотности, не растворим в воде и может быть образован в виде мелкой высокогидратированной коллоидной суспензии, которая обладает способностью обратимо связывать большие количества макромолекул, особенно белков, из раствора. Значительная часть антигенов, присутствующих в вакцине столбнячного анатоксина, используемой в данных исследованиях, была связана как с адъювантом гидроксидом алюминия, обычно используемым в вакцине, так и с суспензией фосфата кальция, используемой в качестве вещества для подбора плотности. Белковые антигены, связанные с этими неорганическими коллоидными растворами, действуют как резервуар для замедленного высвобождения, наблюдаемого в исследованиях на животных. Степень задержки в профиле высвобождения, по-видимому, больше, в тех случаях, когда вакцина представляет собой суспензию в ПФУ жидкостях, чем в случае с водной суспензией, используемой в качестве контроля. Это позволяет предположить, что безводная ПФУ жидкость является важным компонентом для контролирования скорости высвобождения из неорганического коллоидного раствора. Это потребуется в дальнейшем эксперименте для установления, может ли в равной степени иметь место замедленное высвобождение из ПФУ жидкости, при условии, что белок является свободным в твердом растворе в стеклянных микросферах, а не связанным с неорганическим коллоидным раствором.

Использование в этих составах фосфата кальция имеет дополнительные преимущества по сравнению с вышеупомянутым подбором плотности микросфер из сахарного стекла к ПФУ жидкости. Поскольку неорганическая фракция кости сама состоит из фосфата кальция в форме гидроксиапатита, химия этой добавки является биосовместимой и нетоксичной. Можно с уверенностью предположить, что фосфат кальция, вводимый парентерально этим путем, будет нетоксичным локально и будет медленно рассасываться в месте инъекции и/или регионального дренированного лимфатического узла, не оставляя остатка.

Перед тем, как это произойдет, отложение фосфата кальция в области инъекции действует как позитивный маркер иммунизации, который определяется медицинскими методиками визуализации, такими как рентген или ЯМР-томографии, или даже возможно ультразвуком или магнитометрией. Возможность точно определить пациентов, которые были иммунизированы, иногда действительно важно в программе ликвидации заболеваний, поскольку местное хранение записей несовершенно и знание пациента его собственной истории иммунизации может быть неполным. Заменяя другие материалы, регулирующие плотность, такие как сульфат бария, диоксид титана и другие нерастворимые и плотные неорганические преципитаты или их определенные смеси, возможно однозначно обозначить различные вакцины особыми химическими продуктами соответствующей плотности. В дальнейшем может быть определена точная история иммунизации с помощью относительно поверхностных медицинских способов визуализации или регистрации.

Поскольку здесь описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что кроме того могут быть сделаны другие и дополнительные изменения и модификации без отступления от сущности изобретения и в формуле изобретения обозначены все эти изменения и модификации, которые подпадают под объем настоящего изобретения.

Изобретение относится к области фармации и касается композиции, высвобождаемой лекарственное средство или вакцину в организм пациента. Фармацевтическая композиция содержит стабилизированное инъецируемое лекарственное средство или вакцину, доставляемые частицами, суспендированными в биосовместимой безводной жидкости, которые состоят из материала, который стабилизирует лекарственное средство или вакцину и включает растворимое стекло и фосфат кальция, посредством чего указанное лекарственное средство или вакцина медленно высвобождается в кровеносную систему. Композиция является недорогой и надежной и обеспечивает контролируемое высвобождение инъецируемых лекарственного средства или вакцины в кровеносную систему. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая стабилизированное инъецируемое лекарственное средство или вакцину, доставляемые частицами, суспендированными в биосовместимой безводной жидкости, которые состоят из материала, который стабилизирует лекарственное средство или вакцину и включающего растворимое стекло и фосфат кальция, посредством чего указанное лекарственное средство или вакцина медленно высвобождаются в кровеносную систему.2. Фармацевтическая композиция, содержащая лекарственное средство или вакцину, доставляемые частицами, содержащими растворимое стекло, которое стабилизирует лекарственное средство или вакцину, причем указанные частицы суспендированы в биосовместимой жидкости, отличающаяся тем, что плотности частиц и биосовместимой жидкости подобраны таким образом, что частицы остаются в суспензии.3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что вещество для подбора плотности смешивают со стеклом.4. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что веществом для подбора плотности является фосфат кальция.5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что фосфат кальция получают из гидратированной коллоидной суспензии.6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что частицы содержат стекло, выбранное из группы, состоящей из невосстановленных сахаров и сахарного спирта, карбоксилата металла и фосфатного стекла.