Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии. В частности, настоящее изобретение относится к микро/наноадъюванту на основе ризедроната цинка с функцией замедленного высвобождения, образованному путем минерализации ионов цинка и ризедроновой кислоты в качестве основных компонентов, а также к его применению в качестве вакцинного адъюванта. Настоящее изобретение также относится к способу получения микро/наноадъюванта на основе ризедроната цинка. Настоящее изобретение также относится к химической композиции, вакцинному адъюванту и вакцинной композиции, содержащей микро/наноадъювант на основе ризедроната цинка. Настоящее изобретение также относится к применению микро/наноадъюванта на основе ризедроната цинка в качестве вакцинного адъюванта.
Уровень техники
Адъюванты представляют собой вещества, которые могут специфически или неспецифически связываться с иммуногенами, стимулировать организм к выработке долгосрочных и эффективных специфических иммунных ответов и играть дополнительную роль. Иммунобиологические эффекты адъювантов включают уменьшение количества используемого иммуногена, повышение иммуногенности антигенов и изменение типа иммунного ответа и т. д. Алюминиевые адъюванты представляют собой первые адъюванты, одобренные для использования в вакцинах для человека, история которых насчитывает более 80 лет. Алюминиевые адъюванты обычно считаются наиболее широко используемыми, самыми безопасными и эффективными адъювантами. Однако у алюминиевых адъювантов все еще есть недостатки: они могут только стимулировать иммунный ответ Th2 и гуморальный иммунный ответ и имеют ограниченный эффект в отношении стимуляции иммунного ответа Th1 и ответа CTL; алюминиевые адъюванты обладают определенной антигенной специфичностью, и в результате они не оказывают адъювантного действия на вакцины против вируса гриппа, вируса иммунодефицита человека и т. д.; по сравнению со многими новыми вакцинными адъювантами алюминиевые адъюванты обладают более слабой активностью, и их иммунный эффект на большинство генетически сконструированных антигенов, кроме антигенов вирусоподобных частиц, не идеален и т. д. Среди недостатков алюминиевых адъювантов их неспособность эффективно стимулировать организм для выработки клеточного иммунного ответа ограничивает их применение в терапевтических вакцинах, а их более слабая стимуляция также ограничивает их применение в некоторых генетически сконструированных вакцинах, таких как вакцины на основе полипептидов или нуклеиновых кислот. Исходя из этого, люди сделали ряд изобретений и моделей на основе алюминиевого адъюванта, таких как AS04 от GlaxoSmithKline. Адъювантная система AS04 была разработана GlaxoSmithKline (GSK), в которую был добавлен агонист TLR-4 (Toll-подобный рецептор 4, TLR4): 3-O-дезацил-4'-монофосфориллипид A (MPL) на основе алюминиевых адъювантов; из-за фосфорилирования его глюкозамина он имеет высокую аффинность к Al3+ и адсорбируется алюминиевым адъювантом с образованием композитного адъюванта. В то же время он может стимулировать сильный и сбалансированный гуморальный и клеточный иммунный ответ, что имеет большое значение для терапевтических вакцин и противоопухолевых вакцин, требующих клеточного иммунного ответа.
Алюминиевые адъюванты адсорбируют антигены посредством водородных связей, гидрофобного взаимодействия, электростатического притяжения и лигандного обмена, что является одной из причин его механизма усиления иммунитета, а также является важным фактором, влияющим на стабильность антигенов. MPL в AS04 образует новый тип композитного адъюванта за счет адсорбции фосфатных групп алюминиевым адъювантом и хорошо используется в клинической практике. Кроме того, растворимый низкомолекулярный агонист TLR7/8 может вызывать сильную местную и системную токсичность при тестировании на человеке, поэтому он плохо переносится. Хотя нерастворимый низкомолекулярный агонист TLR7/8 обладает хорошим адъювантным эффектом, существуют значительные трудности в его получении и стабилизации его состава. Присоединение фосфатных групп может сделать его функционализированным с получением способности адсорбироваться алюминиевыми адъювантами, а использование химической модификации и оптимизации состава может улучшить фармакокинетику адъюванта, что может снизить местную и системную токсичность, обеспечивая при этом его адъювантную активность.
Эффект адсорбции между алюминиевыми адъювантами и антигенами является одной из причин их механизма усиления иммунитета. Лигандный обмен представляет собой самую мощную силу взаимодействия между адъювантом и антигеном, которая создается лигандным обменом между фосфатной группой в антигене и гидроксигруппой в гидроксиде алюминия или фосфате алюминия, и которая является концепцией «фосфофильности» алюминиевого адъюванта, предложенный изобретателем Zhao в 2001 г. (Analytical Biochemistry, 2001, 295 (1): 76-81). Использование химической модификации для присоединения групп фосфорной (фосфоновой) кислоты к низкомолекулярным иммунным потенциаторам (SMIP), таким как низкомолекулярные агонисты TLR7/8, так что они становятся функционализированными и приобретают способность адсорбироваться алюминиевыми адъювантами, что усиливает накопительный эффект молекулярных адъювантов и снижает системную токсичность, обеспечивая при этом адъювантную активность (J Pharm Sci, 2018. 107(6): p. 1577-1585; Science translational medicine, 2014. 6 (263): 263ra160). SMIP имеют хорошие перспективы применения в области вакцинных адъювантов из-за их четкой химической структуры, простоты модификации и синтеза и масштабируемого производства.
Подобно SMIP, бисфосфонаты (BP) представляют собой класс искусственных соединений, которые имеют высокую аффинность к ионам кальция, алюминия, цинка и магния и используются при лечении заболеваний костей и заболеваний метаболизма кальция, таких как остеопороз, болезнь костей Педжета, а также гиперкальциемия и боли в костях, вызванные метастазами злокачественных опухолей в кости. В то же время клинические исследования показали, что использование бисфосфонатов, особенно ризедроновой кислоты, в адъювантном лечении множественной миеломы, рака груди, рака почек, рака простаты и т. д. может снизить частоту заболеваний, связанных с костями, у пациентов, частоту рецидивов рака, а также улучшить выживаемость пациентов и клинический исход. Кроме того, бисфосфоновая кислота обладает положительным иммунорегуляторным действием и проявляет адъювантную активность. Также сообщалось о патентах или изобретениях бисфосфоновой кислоты, используемой в качестве усилителя иммунитета в вакцинных составах (патент Китая: CN103768595B; патент США: US20170281759A1; патент Китая: CN 108289902A).
Цинк является важным химическим элементом двухвалентного металла, и его содержание играет важную роль в функционировании иммунной системы. Цинк в следовых количествах присутствует примерно в 300 ферментах, участвующих в метаболизме клеток как важный структурный и каталитический фактор, и играет важную роль в жизнедеятельности, такой как обмен информацией между клетками, деление и дифференцировка клеток, а также активация иммунной функции (Nutrients, 2017. 9(12): 1286; Nutrients, 2018. 10 (1): 68); Команда Wang Fudi опубликовала обзор, в котором описан механизм регуляции гомеостаза ионов цинка в макрофагах, а дисбаланс гомеостаза цинка может привести к повреждению фагоцитарной функции макрофагов и аномальному иммунному ответу (Journal of immunology research, 2018. 2018: 6872621); в эксперименте с участием группы добровольцев было обнаружено, что недостаток цинка приводит к несбалансированному иммунному ответу, обусловленному Th1 и Th2, что проявляется в снижении секреции цитокинов Th1, таких как IFN-γ и IL-2, в то время как секреция Th2-связанных цитокинов, таких как IL-4, IL-6 не подвергалась воздействию (J Infect Dis, 2000. 182 Suppl 1: p. S62-8); в другом интересном исследовании исследователи использовали металлоорганический каркас (MOF), образованный ацетатом цинка и метилимидазолом, после обертывания им вирусного антигена не только стабильность антигена была значительно улучшена, но и иммуногенность антигена у мышей (ACS Applied Materials & Interfaces, 2019. 11(10): p. 9740-9746).
Содержание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к микро/наноадъюванту с функцией замедленного высвобождения, который образуется за счет минерализации ионов цинка и ризедроновой кислоты в качестве основных компонентов, который упоминался как ризедронат цинка, к его основным компонентам, способу его получения, способу измерения его физических и химических свойств и его применению в производстве вакцинных адъювантов, в профилактических вакцинах и терапевтических вакцинах.
В конкретном варианте осуществления адъювант на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению может быть получен путем получения осадка посредством реакции ионов цинка с ризедроновой кислотой, фосфатным радикалом и гидроксидным радикалом.
В конкретном варианте осуществления можно использовать различные методы смешивания для получения осадка посредством реакции ионов цинка с группой ризедроновой кислоты, фосфатным радикалом и гидроксидным радикалом. В предпочтительном варианте осуществления указанные различные способы смешивания включают, но не ограничиваются ими, последовательное осаждение, раздельное осаждение с последующим смешиванием или совместным осаждением. См. Принципиальную схему процесса: Фигура 1.
В варианте осуществления настоящего изобретения соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты в адъюванте на основе ризедроната цинка обычно не ограничивается. В предпочтительном варианте осуществления соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты в адъюванте на основе ризедроната цинка может составлять (1-8):1. Предпочтительно соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты выбирают из 1:1, 4:1 или 8:1.
В одном варианте осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка ризедроновая кислота имеет соотношение молярных концентраций Zn/ризедроновая кислота 1:1, 4:1 или 8:1, таким образом образуя адъювант на основе ризедроната цинка посредством осаждения ионов цинка и групп фосфоновой кислоты.
В другом варианте осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка адъювант на основе ризедроната цинка может дополнительно включать фосфат, например, ризедроновая кислота может быть заменена фосфатом в различных молярных пропорциях (не полностью заменена), а адъювант на основе ризедроната цинка готовится посредством осаждения ионов цинка с группами фосфоновой кислоты и фосфатными радикалами различными методами смешивания (например, последовательным осаждением, раздельным осаждением с последующим смешиванием или одновременным осаждением и т. д.). В таком адъюванте на основе ризедроната цинка соотношение молярных концентраций Zn:фосфатного радикала, как правило, не ограничено. В предпочтительном варианте соотношение молярных концентраций Zn:фосфатного радикала может составлять (1-8):1. Предпочтительно соотношение молярных концентраций Zn:фосфатного радикала выбирают из 1,5:1 и 4:1, с образованием таким образом органическо-неорганического гибрида адъюванта на основе ризедроната цинка.
В другом варианте осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка адъювант на основе ризедроната цинка может дополнительно содержать алюминий (Al); например, Zn может быть заменен на Al в различных пропорциях (не полностью заменен), и адъювант на основе ризедроната цинка готовят посредством осаждения ионов цинка и ионов алюминия с группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами или гидроксидными радикалами различными методами смешивания (например, последовательным осаждением, раздельным осаждением с последующим смешиванием или одновременным осаждением и т. д.). В таком адъюванте на основе ризедроната цинка и алюминия соотношение молярных концентраций Zn:Al, как правило, не ограничено. В предпочтительном варианте осуществления соотношение молярных концентраций Zn:Al может составлять (0,02-1):1, и предпочтительно соотношение молярных концентраций Zn:Al выбирают из 0,375:1.
В варианте осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка конкретный тип соединения цинка не ограничивается, например, это может быть гидроксид цинка, фосфат цинка, сульфат цинка, карбонат цинка или другие типы адъювантов на основе цинка, известные в данной области, при условии, что адъювант на основе ризедроната цинка получают путем осаждения ионов цинка группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами и гидроксидными радикалами.
В некоторых вариантах осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка фосфатный раствор может быть выбран, но не ограничиваясь этим, из фосфата натрия, гидрофосфата динатрия (безводного, дигидрата, гептагидрата или додекагидрата), дигидрофосфата натрия (безводного или дигидрата), фосфата калия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия, пирофосфорной кислоты, полифосфорной кислоты и любых их смесей.
В некоторых вариантах осуществления адъюванта на основе ризедроната цинка-алюминия конкретный тип соединения алюминия не ограничен, например, это может быть гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия или другие типы алюминиевых адъювантов, известные в данной области, при условии, что адъювант на основе ризедроната цинка-алюминия получают путем осаждения ионов цинка и алюминия группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами и гидроксидными радикалами.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения адъюванта на основе ризедроната цинка, который включает:
получение адъюванта на основе ризедроната цинка путем осаждения ионов цинка посредством реакции ионов цинка с группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами и гидроксидными радикалами по отдельности или одновременно в растворе растворимой соли.
В конкретном варианте осуществления способ включает:
a) получение растворимого солевого раствора, содержащего ионы цинка,
b) совместное осаждение ионов цинка с группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами и гидроксидными радикалами путем смешивания растворимого солевого раствора стадии а) со щелочным раствором ризедроновой кислоты и гидроксида натрия или
с щелочным раствором ризедроновой кислоты и фосфата натрия;
различными способами с получением адъюванта на основе ризедроната цинка.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения раствор растворимой соли, как правило, не ограничивается, и, например, он предпочтительно представляет собой раствор соляной кислоты.
В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает стерилизацию суспензии адъюванта на основе ризедроната цинка, полученной на стадии b), которая образуется после смешивания, путем автоклавирования при условиях высокой температуры и высокого давления 121°C в течение 60 минут, охлаждения до комнатной температуры и затем выдерживания при 2-8 °C, которую предпочтительно хранят при 4°C для дальнейшего использования. В одном варианте осуществления соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты в адъюванте на основе ризедроната цинка, полученном способом по настоящему изобретению, может составлять (1-8):1. В предпочтительном варианте осуществления соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты выбирают из 1:1, 4:1 или 8:1.
В другом варианте осуществления в способе получения адъюванта на основе ризедроната цинка-алюминия по настоящему изобретению Al вводят при соотношении молярных концентраций Zn/Al, равном 0,375, и адъювант на основе ризедроната цинка-алюминия получают осаждением ионов цинка и ионов алюминия с группами фосфоновой кислоты, фосфатными радикалами и гидроксидными радикалами; различными методами смешивания (например, последовательным осаждением, раздельным осаждением с последующим смешиванием или одновременным осаждением и т. д.).
Раствор растворимой соли ионов цинка, используемый в настоящем изобретении, может быть любым раствором растворимой соли ионов цинка и предпочтительно раствором ионов цинка в соляной кислоте.
Используемый в настоящем изобретении раствор ризедроната предпочтительно представляет собой щелочной раствор ризедроновой кислоты и гидроксида натрия.
Используемый в настоящем изобретении способ осаждения групп цинка и фосфоновой кислоты может представлять собой любой метод, в котором реакция осаждения происходит путем тщательного смешивания раствора растворимой соли ионов цинка со щелочным раствором ризедроновой кислоты и гидроксида натрия. Предпочтительно адъювант на основе ризедроната цинка может быть получен любыми способами, такими как последовательное осаждение, раздельное осаждение с последующим смешиванием или одновременное осаждение и т. д.
Используемая в настоящем изобретении стерилизация может представлять собой любой метод, подходящий для стерилизации адъюванта на основе ризедроната цинка, предпочтительно метод стерилизации паром при высокой температуре и высоком давлении, например стерилизация, выполняемая при 121°C в течение 30-60 минут, предпочтительно 60 минут.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способам измерения физических и химических свойств полученного адъюванта на основе ризедроната цинка. В одном варианте осуществления измеряют значение pH, размер частиц, дзета-потенциал, точка нулевого заряда (PZC) частиц, скорости адсорбции и диссоциации белков, скорость осаждения ионов металлов, скорость осаждения органической фосфоновой кислоты, скорости растворения in vivo и in vitro осадков и т. д. адъюванта. Физические и химические свойства адъюванта можно измерить обычными методами, например, см. US 9573811; Ai Xulu et al., Analysis of physicochemical properties of three aluminum hydroxide adjuvant, «Chinese Journal of Biological Products», 2015, 28(1): 44-47; и как описано в приведенных здесь примерах.
В одном варианте осуществления адъювант на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем документе, имеет одно или более из следующих свойств: адъювант на основе ризедроната цинка имеет pH 8-9 перед стерилизацией, адъювант на основе ризедроната цинка имеет pH 6-8 после стерилизации, адъювант на основе ризедроната цинка имеет размер частиц 1-10 мкм, адъювант на основе ризедроната цинка имеет точку нулевого заряда частиц 4-11,4, адъювант на основе ризедроната цинка имеет скорость осаждения ионов металла> 99%, и адъювант на основе ризедроната цинка имеет степень адсорбции белка> 60%.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в частности фармацевтическому составу или композиции, содержащей адъювант на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем описании.
Способ получения фармацевтического состава или композиции включает стадию объединения адъюванта на основе ризедроната цинка с носителем и/или необязательно с одним или более вспомогательными компонентами.
Вообще говоря, составы готовят путем однородного и тщательного объединения адъюванта на основе ризедроната цинка с жидкими носителями или измельченными твердыми носителями, или с обоими, а затем, если необходимо, путем придания продукту формы.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения активных ингредиентов включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к адъюванту на основе ризедроната цинка жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот безводного сорбитана и их смеси.
Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции также могут включать адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые агенты, красители, отдушки и консерванты.
Составы суспензий, в дополнение к адъюванту на основе ризедроната цинка, могут содержать суспендирующие агенты, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбитол и сложные эфиры безводного сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, смесь агар-агар и трагакантовую камедь.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению для ректального или вагинального введения может быть представлена в виде суппозитория, который может быть получен путем смешивания адъюванта на основе ризедроната цинка с одним или более подходящими нераздражающими наполнителями или носителями (включая, например, масло какао, полиэтилен гликоль, воск для суппозиториев или салицилат), который является твердым при комнатной температуре и жидким при температуре тела, тем самым тая в прямой кишке или влагалище с высвобождением адъюванта на основе ризедроната цинка. Составы, подходящие для вагинального введения по настоящему изобретению, также включают вагинальный суппозиторий, тампон, крем, гель, пасту, пену или спрей, содержащие подходящие носители, известные в данной области.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, подходящая для парентерального введения, включает адъювант на основе ризедроната цинка и один или более фармацевтически приемлемых стерильных изотонических водных или неводных носителей в комбинации с ним, включая раствор, дисперсию, суспензию или эмульсию или стерильный порошок, который может быть восстановлен перед применением до стерильного раствора или дисперсии для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента, или суспендирующие агенты или загустители.
Примеры подходящих носителей на водной и не водной основе, которые можно использовать в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц (в случае дисперсий) и за счет использования поверхностно-активных веществ.
Эти композиции могут также содержать адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Также может быть желательно включить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть достигнута путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Формы депо для инъекций могут быть получены путем формирования микрокапсульных матриц из адъюванта на основе ризедроната цинка в биоразлагаемых полимерах (таких как полилактид-полигликолид). В зависимости от соотношения адъюванта на основе ризедроната цинка и полимера и природы конкретного используемого полимера скорость высвобождения адъюванта на основе ризедроната цинка можно контролировать. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Инъецируемые составы депо также получают путем включения адъюванта на основе ризедроната цинка в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями тела. Инъецируемые материалы для инъекций можно стерилизовать, например, путем фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии.
Составы могут быть представлены в герметичных контейнерах для однократных или многократных доз (например, в ампулах и флаконах) и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для немедленной инъекции могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного выше типа.
В одном аспекте настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей адъювант на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем описании, и один или более антигенов.
Используемая в настоящем изобретении иммуногенная композиция при введении пациенту или животному стимулирует защитный иммунный ответ против указанного одного или более содержащихся в ней антигенов.
В одном аспекте настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей адъювант на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем описании, и один или более антигенов.
Используемая в настоящем изобретении вакцинная композиция при введении пациенту или животному стимулирует защитный иммунный ответ, например, против микроорганизма, или для эффективной защиты пациента или животного от инфекции.
Вакцинная композиция может использоваться для предотвращения или облегчения патологического состояния, которое будет благоприятно реагировать на модуляцию иммунного ответа. Такая вакцинная композиция может быть профилактической вакциной или терапевтической вакциной. Предпочтительно вакцинная композиция включает генетически сконструированную вакцину, такую как белковая вакцина, такая как вакцина рекомбинантного белка вируса ветряной оспы.
В одном аспекте настоящее изобретение также относится к вакцинному адъюванту, содержащему адъювант на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем описании. Например, такой вакцинный адъювант может также включать вторичный адъювант, как описано ниже.
Используемый в настоящем изобретении термин «адъювант» или «вакцинный адъювант» относится к веществу, способному неспецифически ускорять, пролонгировать или усиливать иммунный ответ против антигена.
Преимущественно адъюванты могут также уменьшить количество раз иммунизации или количество антигена, необходимого для защитного иммунного ответа.
Хорошо известно, что адъювант сам по себе не стимулирует или почти не стимулирует иммунный ответ, но адъювант увеличивает иммунный ответ против антигена. Следовательно, адъювант на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению можно комбинировать с одним или более антигенами для получения иммуногенной композиции или вакцины, которые можно использовать для стимуляции иммунного ответа у индивидуума. В качестве антигенов в комплексе или составе иммуногенного или вакцинного типа можно использовать различные вещества. Например, ослабленные и инактивированные вирусные и бактериальные патогены, очищенные макромолекулы, белки, полисахариды, токсоиды, рекомбинантные антигены, организмы, содержащие чужеродный ген патогена, синтетические пептиды, полинуклеотиды, антитела и опухолевые клетки и т. д. Антигены можно использовать как в профилактических, так и в терапевтических вакцинах. Антигены включают белковые антигены, такие как гликопротеиновый антиген gE вируса ветряной оспы (VZV gE).
Различные иммуномодулирующие молекулы также можно использовать в комбинации с адъювантом на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению для изменения иммунного ответа у индивидуума. Описанные в настоящем описании иммуномодуляторы относятся к классу составов, которые могут регулировать, уравновешивать и восстанавливать иммунную функцию организма. Обычно используемые иммуномодуляторы включают три основные категории: иммунные промоторы, иммунодепрессанты и двунаправленные иммунные модуляторы.
Количество антигена и адъюванта на основе ризедроната цинка в вакцинной композиции по настоящему изобретению и их вводимая доза определяется методами, хорошо известными специалистам в области фармацевтики, при этом следует учитывать такие факторы, как следующие: специфический антиген, возраст, пол, вес, вид и состояние конкретного животного или пациента, а также способ введения.
В предпочтительном варианте осуществления вакцинная композиция по настоящему изобретению дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из: поверхностно-активных веществ, промоторов абсорбции, водоабсорбирующих полимеров, веществ, которые ингибируют ферментативную деградацию, спиртов, органических растворителей, масел, агентов, регулирующих pH, консервантов, агентов, регулирующих осмотическое давление, пропеллентов, воды и любых их смесей.
Вакцинная композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Количество носителя будет зависеть от количества, выбранного для других ингредиентов, желаемой концентрации антигена, выбора пути введения (перорального или парентерального) и т. д. Носитель можно добавить в вакцину в любое удобное время. В случае лиофилизированной вакцины носитель можно, например, добавить до введения. В качестве альтернативы, конечный продукт может быть изготовлен с использованием носителя.
Примеры подходящих носителей включают, но не ограничиваются ими, стерильную воду, физиологический раствор, буферы, фосфатно-солевой буфер, забуференный хлорид натрия, растительные масла, минимальную необходимую среду (MEM), MEM с буфером HEPES и т. д.
Необязательно, вакцинная композиция по изобретению может содержать обычные вторичные адъюванты в различных количествах в зависимости от адъюванта и желаемого результата.
Примеры подходящих вторичных адъювантов включают, но не ограничиваются ими, стабилизаторы; эмульгаторы; регуляторы pH, такие как гидроксид натрия, соляная кислота и т. д.; поверхностно-активные вещества, такие как Tween®. 80 (полисорбат 80, коммерчески доступный от Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури); липосомы; адъювант iscom; синтетические гликопептиды, такие как мурамилдипептиды; наполнители, такие как декстран; карбоксиполиметилен; бактериальные клеточные стенки, такие как экстракт микобактериальных клеточных стенок; их производные, такие как Corynebacterium parvum; Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis, например, Bovine Calmette Guerin (BCG); белки вируса коровьей оспы или животного поксвируса; адъюванты субвирусных частиц, таких как орбивирус; токсин холеры; N, N-диоктадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин(пиридин); монофосфориллипид А; бромид диметилдиоктадециламмония (DDA, коммерчески доступный от Kodak, Rochester, N.Y.); синтетические вещества и их смеси.
Примеры подходящих стабилизаторов включают, но не ограничиваются ими, сахарозу, желатин, пептон, экстракты расщепленного белка, такие как NZ-амин или NZ-амин AS. Примеры эмульгаторов включают, но не ограничиваются ими, минеральное масло, растительное масло, арахисовое масло и другие стандартные, метаболизируемые, нетоксичные масла, пригодные для инъекционных или интраназальных вакцинных композиций.
Для целей настоящего изобретения эти адъюванты идентифицированы здесь как «вторичные» просто для контраста с описанным выше адъювантом на основе ризедроната цинка, поскольку комбинация адъюванта на основе ризедроната цинка и антигенного вещества может значительно усилить гуморальный иммунный ответ на антигенное вещество. Вторичные адъюванты в первую очередь включаются в состав вакцины в качестве вспомогательных средств обработки, хотя некоторые адъюванты действительно обладают в некоторой степени иммунологически усиливающими свойствами и имеют двойное назначение.
К вакцинной композиции можно добавлять обычные консерванты в эффективных количествах в диапазоне от примерно 0,0001% до примерно 0,1% по массе. В зависимости от консерванта, используемого в составе, могут быть полезными количества ниже или выше этого диапазона. Типичные консерванты включают, например, сорбат калия, метабисульфит натрия, фенол, метилпарабен, пропилпарабен, тимеросал и т. д.
Выбор инактивированной, модифицированной или вакцинной композиции другого типа и получение улучшенного состава вакцинной композиции по настоящему изобретению известны или легко определяются специалистами в данной области.
Как правило, вакцинную композицию по настоящему изобретению можно удобно вводить перорально, парентерально (подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно или внутрибрюшинно), внутрибуккально, интраназально или трансдермально. Способ введения, предусмотренный настоящим изобретением, будет зависеть от антигенного вещества и сопутствующих составов. Например, если вакцинная композиция содержит сапонины, будучи нетоксичной для перорального или интраназального введения, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не вводить гликозиды сапогенина в кровоток, поскольку они действуют как сильные гемолитики. Кроме того, многие антигены не будут эффективны при пероральном приеме. Предпочтительно вакцинная композиция вводится внутримышечно.
Дозировка вакцинной композиции будет зависеть, в частности, от выбранного антигена, пути введения, вида и других стандартных факторов. Предполагается, что специалист в данной области может легко оттитровать соответствующую дозу для иммуногенного ответа на каждый антиген, чтобы определить эффективное количество иммунизации и путь введения.
В качестве вакцинного адъюванта адъювант на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению может повышать эффективность вакцины за счет повышения иммуногенности более слабых антигенов (например, высокоочищенных или рекомбинантных антигенов), за счет уменьшения количества антигенов, необходимых для иммунного ответа, или за счет уменьшения частоты иммунизации, необходимой для защитной иммунизации. Адъювант на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению может повысить эффективность вакцины у лиц (например, новорожденных, пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом) со сниженными или ослабленными иммунными ответами и может повысить эффективность вакцины в тканях-мишенях. Альтернативно, адъювант на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению может способствовать клеточно-опосредованному иммунному ответу и/или гуморальному иммунному ответу путем запуска определенного цитокинового профиля.
Комбинация антигена и/или иммуномодулирующей молекулы и адъюванта на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению может быть протестирована в различных доклинических токсикологических исследованиях и исследованиях безопасности, хорошо известных в данной области.
Например, такую комбинацию можно оценить на животной модели, в которой антиген оказался иммуногенным и которую можно воспроизводимо иммунизировать тем же путем, который был предложен для клинических испытаний на людях.
Комбинация антигена и/или иммуномодулирующей молекулы и адъюванта на основе ризедроновой кислоты по настоящему изобретению может быть протестирована, например, с помощью подхода, установленного Центром оценки и исследований биологии/Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов и Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (Goldenthal, KL et al. AID Res Hum Retroviruses, 9: S45-9 (1993)).
Специалистам в данной области будет понятно, как определить для конкретной комбинации антигена и/или иммуномодулирующей молекулы с композитным адъювантом по изобретению подходящую нагрузку антигена, путь иммунизации, дозу, чистоту антигена и схему вакцинации, полезную для лечения конкретного патологического состояния у определенных видов животных.
Иммуногенная композиция или вакцина по изобретению для индукции иммунного ответа может вводиться в виде раствора или суспензии вместе с фармацевтически приемлемой средой.
Такой фармацевтически приемлемой средой может быть, например, вода, фосфатно-буферный солевой раствор, нормальный солевой раствор или другой физиологически забуференный солевой раствор, или другой растворитель или носитель, такой как гликоль, глицерин, и масло, такое как оливковое масло или органический сложный эфир для инъекций. Фармацевтически приемлемая среда также может содержать липосомы или мицеллы и может содержать иммуностимулирующие комплексы, полученные путем смешивания полипептидных или пептидных антигенов с детергентом и гликозидом (таким как Quil A).
Иммуногенная композиция или вакцина по изобретению могут вводиться различными путями для стимуляции иммунного ответа. Например, иммуногенная композиция или вакцина может быть доставлена подкожно, внутрикожно, внутрилимфатически, внутримышечно, внутриопухолево, внутрипузырно, внутрибрюшинно и интрацеребрально.
Специалистам в данной области известно, как выбрать подходящие пути доставки для конкретных составов адъюванта на основе ризедроната цинка по настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ вакцинации для лечения или профилактики инфекции у млекопитающего включает использование вакцины по настоящему изобретению, при котором вакцина будет конкретно вводиться внутримышечно. Вакцина может вводиться в виде однократной дозы или предпочтительно несколько раз, например, два, три или четыре раза в неделю или в месяц в соответствии со стратегией первичной иммунизации/бустерной иммунизации. Подходящая доза зависит от множества параметров.
В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению адъюванта на основе ризедроната цинка, как описано в настоящем описании, для производства вакцинного адъюванта, фармацевтической композиции, иммуногенной композиции или вакцинной композиции. Предпочтительно вакцина включает белковую вакцину, такую как рекомбинантная белковая вакцина вируса ветряной оспы.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Принципиальные схемы трех процессов приготовления адъювантов.
Фигура 2: электронно-микроскопическое изображение адъюванта на основе ризедроната цинка.
Фигура 3: размер частиц адъюванта на основе ризедроната цинка.
Фигура 4: определение адъювантной активности адъюванта на основе ризедроната цинка в сочетании с рекомбинантным белком gE VZV, среднее значение ± стандартное отклонение: n=5, *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001, ****p <0,0001.
Фигура 5: эффект адъюванта на основе ризедроната цинка в сочетании с рекомбинантным белком gE VZV в отношении изотипов мышиных антител, среднее ± стандартное отклонение: n=5, *p <0,05; **р <0,01; ***p <0,001, ****p <0,0001.
Фигура 6: определение адъювантной активности адъюванта на основе ризедроната натрия и адъюванта на основе ризедроната цинка в сочетании с терапевтическим белком для лечения гепатита В, среднее ± стандартное отклонение: n=5, *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001, ****p <0,0001.
Фигура 7: исследование зависимости доза-эффект активности адъюванта на основе ризедроната цинка, среднее ± стандартное отклонение: n=5, *p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001, ****p <0,0001.
Конкретные модели для осуществления настоящего изобретения
Ниже подробно описаны варианты осуществления настоящего изобретения вместе с примерами. Для тех, кто не указывает конкретные условия в примерах, они должны выполняться в соответствии с обычными условиями или условиями, предложенными производителем. Реагенты или инструменты, используемые без указания производителя, являются обычными продуктами, которые можно приобрести на коммерческой основе.
Пример получения 1: Приготовление адъюванта на основе ризедроната цинка (Zn-ризедроновая кислота (1/0,25))
Ризедронат натрия (C7H10NNaO7P2): приобретен в Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd.
Безводный хлорид цинка (ZnCl2): приобретен у Xilong Chemical.
Додекагидрат гидрофосфата натрия (Na2HPO·12H2O): приобретен у Xilong Chemical
Гидроксид натрия (NaOH): приобретен у Xilong Chemical.
Приготовление растворов:
В соответствии с соотношением молярных концентраций Zn/ризедроновой кислоты, равным 1:0,25, получали 50 мл 31,11 мМ раствора хлорида цинка, который определяли как раствор A; готовили 50 мл раствора (7,78 мМ ризедроновой кислоты+36 мМ гидроксида натрия+15,55 мМ гидрофосфата динатрия), который определяли как раствор B. Раствор A и раствор B фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм для последующего использования.
Приготовление суспензии адъюванта Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25) и определение ее физико-химических свойств:
Раствор A и раствор B использовали для образования суспензии адъюванта на основе ризедроната цинка в соответствии со схемой, показанной на Фигуре 1A, то есть приготовленный раствор B добавляли по каплям к раствору A в объемном соотношении 1:1 до тех пор, пока все не было добавлено с образованием суспензии.
После стадии смешивания, показанной на Фигуре 1A, полученный адъювант на основе ризедроната цинка стерилизовали один раз паром под высоким давлением при 121°C в течение 60 мин и измеряли его физические и химические свойства, такие как значение pH, размер и морфология частиц после стерилизации.
Пример получения 2: Приготовление адъюванта на основе ризедроната цинка (Zn-ризедроновая кислота (1/1))
Источник реагентов можно найти в Примере получения 1.
Приготовление растворов:
В соответствии с соотношением молярных концентраций Zn/ризедроновой кислоты 1:1, 50 мл 31,11 мМ раствора хлорида цинка были приготовлены и определены как Раствор A; готовили 50 мл раствора (31,11 мМ ризедроновой кислоты+60 мМ гидроксида натрия), который определяли как раствор B. Раствор A и раствор B фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм для последующего использования.
Приготовление суспензии адъюванта Zn-ризедроновой кислоты (1/1) и определение ее физико-химических свойств:
Пожалуйста, обратитесь к Примеру 1 для получения подробной информации.
Пример получения 3: Приготовление адъюванта на основе ризедроната цинка (Zn-ризедроновая кислота (1/0,25))
Источник реагентов можно найти в Примере получения 1.
Приготовление растворов:
В соответствии с соотношением молярных концентраций Zn/ризедроновой кислоты, равным 1:0,125, был приготовлен 1 л 124,44 мМ раствора хлорида цинка, который был определен как раствор A; готовили 1 л раствора (15,56 мМ ризедроновая кислота+60 мМ гидроксид натрия+184 мМ динатрий гидрофосфата), который был определен как раствор B. Раствор A и раствор B фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм для дальнейшего использования.
Приготовление суспензии адъюванта Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) и определение ее физико-химических свойств:
Пожалуйста, обратитесь к Примеру 1 для получения подробной информации.
Пример получения 4: Получение алюминиевого адъюванта Al-002
Приготовление растворов: источник реагентов можно найти в Примере получения 1.
В соответствии с соотношением молярных концентраций фосфатный радикал/Al 0,3:1,5 мл был приготовлен 62,22 мМ раствор хлорида алюминия, который был определен как Раствор A; готовили 50 мл 9,33 мМ раствора гидрофосфата динатрия (50 мМ гидроксида натрия), который определяли как раствор B. Растворы повторно фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм для последующего использования.
Приготовление суспензии алюминиевого адъюванта Al-002
Раствор A и раствор B были приготовлены в объемном соотношении 1:1. Приготовление осуществляли в соответствии со схемой на Фигуре 1А, где приготовленный раствор В добавляли по каплям к раствору А в объемном соотношении 1:1 до тех пор, пока не было добавлено все, с образованием суспензии. Полученную после перемешивания суспензию стерилизовали при 121°C в течение 60 мин.
Пример получения 5: Получение алюминиевого адъюванта Al-001-840
Приготовление растворов: источник реагентов можно найти в Примере получения 1.
В соответствии с соотношением молярных концентраций фосфата/Al 0,15 было приготовлено 0,5 л 124 мМ раствора хлорида алюминия, который был определен как Раствор A; готовили 0,5 л 18,6 мМ раствора гидрофосфата динатрия, который был определен как раствор B, который также содержал 150 мМ гидроксида натрия. Растворы фильтровали через мембрану 0,22 мкм для дальнейшего использования.
Суспензию алюминиевого адъюванта Al-001-840 готовили тем же способом, что и суспензию алюминиевого адъюванта Al-002.
Пример 1: Определение физических и химических свойств адъюванта на основе ризедроната цинка (Zn-ризедроновая кислота (1/0,125))
Суспензию ризедроната цинка, полученную после смешивания, стерилизовали один раз при 121°C в течение 60 минут и измеряли физические и химические свойства, такие как значение pH, размер и морфология частиц, скорость осаждения ионов металлов и другие физические и химические свойства после стерилизации.
Следующие ниже методы обнаружения применимы к любому молярному соотношению Zn/ризедроновая кислота, то есть к любому адъюванту на основе ризедроната цинка, такому как адъювант на основе ризедроната цинка, допированный неорганической фосфорной кислотой;
(1) Наблюдение за морфологией адъювантных частиц
После того, как адъювант на основе ризедроната цинка разбавляли в 50 раз деионизированной водой, наблюдение осуществляли с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ) JEM-2100 от Japan Electronics. Конкретные стадии были следующими: нанесение образца адъюванта на медную сетку, покрытую углеродной пленкой, выдержка 10 минут для абсорбции, удаление остаточной жидкости фильтровальной бумагой, отправка образцов в камеру для образцов просвечивающего электронного микроскопа для наблюдения за морфологией образца и фотографирование для дальнейшего анализа.
Результаты экспериментов: как показано на Фигуре 2, адъювант на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/1) имел форму аморфного кластера, в то время как в адъювантах на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25) и Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) были ясно видны сферические наноядерные частицы.
(2) измерение pH
Брали образцы для тестирования, уравновешивали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут и измеряли с помощью стеклянного электрода Sartorius pH.
Стандартный буфер (pH 7), стандартный буфер (pH 4,01) и стандартный буфер (pH 10,01) были выбраны для калибровки прибора в соответствии с требованиями инструкции по эксплуатации.
Кнопка «Mode» может быть нажата для переключения между режимами pH и мВ. Обычно режим pH выбирают при определении значения pH раствора.
Кнопку «SETUP» нажимали до тех пор, пока на дисплее не отображалось сообщение «Чистый буфер», а затем нажимали кнопку «ENTER» для подтверждения и удаления данных предыдущей калибровки.
Нажимали кнопку «SETUP» до тех пор, пока на дисплее не отображалась группа буферного раствора «4,01, 7,00, 10,01», а затем нажимали кнопку «ENTER» для подтверждения.
Электрод осторожно извлекали из раствора для хранения электрода, электрод тщательно промывали деионизированной водой, а воду на поверхности высушивали фильтровальной бумагой после тщательного ополаскивания (будьте осторожны, чтобы не уничтожить электрод).
Электрод погружали в первый буферный раствор (pH 7,00) до тех пор, пока значение не стабилизировалось и не появлялась буква «S», затем нажимали кнопку «STANDARDIZE» до тех пор, пока прибор автоматически не откалибруется. После успешной калибровки отображалось «7,00» и крутизна электродной функции.
Электрод вынимали из первого буферного раствора, тщательно промывали деионизированной водой и последовательно погружали электрод во второй буферный раствор (pH 4,01) до тех пор, пока значение не становилось стабильным и не появилось «S», затем нажимали кнопку «STANDARDIZE» до тех пор, пока прибор не откалибруется автоматически. После успешной калибровки отображается «4,01 7,00» и сообщение «Slope (крутизна)». Крутизна отображает измеренное значение крутизны электрода, которое было приемлемым в диапазоне 90-105%.
Если было большое отклонение от теоретического значения, отобразилось бы сообщение об ошибке (Err), затем следует очистить электрод и повторить описанные выше стадии для калибровки.
Вышеупомянутые операции повторяли для завершения калибровки третьей точки (pH 10,01).
После завершения калибровки электрод тщательно промывали деионизированной водой, а затем осторожно сушили фильтровальной бумагой. Раствор образца равномерно встряхивали, стеклянный электрод погружали в раствор образца до тех пор, пока значение pH не изменилось не более чем на ± 0,05 в течение 1 минуты, после чего показания подтверждали.
Раствор образца равномерно встряхивали и снова проводили измерение. Разница между двумя значениями pH не должна превышать 0,1. Среднее значение двух показаний было принято за значение pH тестируемого продукта.
Результаты экспериментов: адъювант на основе цинк-ризедроновой кислоты (1/0,125) имел pH 6,9-7,3 до стерилизации и 6,4-6,8 после стерилизации;
(3) Определение размера частиц
Лазерный анализатор размера частиц Beckman LS 13320 включали и прогревали в течение 15 минут.
Программное обеспечение управления анализатором запускали, и закрытое отделение ячейки для образца открывалось, ячейку для образца брали из отсека для образца и добавляли с 12 мл очищенной воды.
Ячейку для образца помещали в резервуар для образца, и дверцу отсека закрывали.
Нажимали «start cycle (запуск цикла)», по очереди выбирали «Measure Offsets (измерение смещения)», «Align (Выравнивание)», «Measure Background (Измерение фона)», и, наконец, нажимали «start (запуск)», нажимали «ОК» во всплывающем диалоговом окне, чтобы начать калибровку пустого фона.
Брали ячейку для образца и в нее добавляли определенное количество стандартного образца (поставляется с анализатором); нажимали «start cycle (запуск цикла)», по очереди выбраны «Measure Loading (загрузка измерения)», «Enter Sample Info (введение информации об образце)», «Enter run setting (введение установок прогона)», «start run (запуск прогона)», и, наконец, нажимали «start (запуск)», вводили название стандартного образца во всплывающем диалоговом окне, нажимали «ОК», когда параметр «Obscuration (затемнение)» в программном обеспечении составлял от 8% до 12%, поэтому проводили измерение стандартного образца.
Чтобы обеспечить точность и надежность экспериментальных данных, перед каждым измерением следует откалибровать пустой фон и измерить размер стандартного образца.
Закрытый отсек ячейки для образца открывали, и ячейку для образца извлекали.
Водный раствор, содержащий стандартный образец в ячейке для образца, удаляли, и в ячейку для образца добавляли деионизированную воду для очистки ячейки для образца 3 раза.
После очистки добавляли 12 мл деионизированной воды, ячейку для образца помещали в отсек для образца, а дверцу отсека закрывали.
Нажимали «start cycle (запуск цикла)», по очереди выбирали «Measure Offsets (измерение смещения)», «Align (Выравнивание)», «Measure Background (Измерение фона)», и, наконец, нажимали «start (запуск)», нажимали «ОК» во всплывающем диалоговом окне, чтобы начать калибровку пустого фона.
Ячейку для образца извлекали, добавляли определенный объем тестируемого образца, дверцу камеры для тестирования образцов открывали, ячейку для образца помещали в отсек для образца и дверцу камеры закрывали.
Нажимали «start cycle (запуск цикла)», по очереди выбирали «Enter Sample Info (введение информации об образце)», «Enter run setting (введение установок прогона)», «start run (запуск прогона)», и, наконец, нажимали «start (запуск)», вводили название стандартного образца во всплывающем диалоговом окне, нажимали «ОК», когда параметр «Obscuration (затемнение)» в программном обеспечении составлял от 8% до 12%, размеры частиц измеряемых образцов регистрировались.
Результаты экспериментов: Как показано на Фигуре 3, на примере адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) размер частиц составлял 0,4-30 мкм, и большинство частиц имели размер 6-7 мкм.
(4) Обнаружение PZC:
Инструмент для измерения: Nanobrook Omni (Brookhaven)
Экспериментальная операция: использовали 0,1 М NaOH/1% HNO3, чтобы довести pH Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) до: 6,00/5,50/5,00/4,50/4,00/3,50/3,00/2,50/2,00.
Пассивированный электрод: в пробирку для образца добавляли 3-4 мл адъюванта. После того, как электрод был вставлен, цикл в SOP устанавливали на 50, и прибор запускали для пассивирования электрода.
Измерение образца: после извлечения электрода его нижний конец промывали деионизированной водой, а затем добавляли соответствующий образец, цикл был установлен на 15 в SOP, показатель был установлен на 3, pH устанавливали на соответствующее pH каждого образца, и прибор запускали.
Обработка данных: были получены соответствующие дзета-потенциалы при различных значениях pH, программное обеспечение, поставляемое с прибором, было запущено для получения значений PZC.
Результаты: PZC адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) составлял 4,11.
(5) Определение скорости адсорбции адъюванта на основе ризедроната цинка.
Построение стандартной кривой для стандарта BSA: 150 мМ NaCl использовали в качестве буфера для разведения, стандарт BSA (2 мг/мл) серийно разбавляли и оптическую плотность при 280 нм определяли с помощью UV2100 pro. OD280 показал высокую точность 0,2-0,8 (расширение до 0,2-1,5).
Разведение в градиенте BSA (EP): 150 мМ NaCl использовали в качестве буфера для разведения, определенное количество образца BSA взвешивали и разбавляли до градиента концентрации, указанного в EP: 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, для дальнейшего использования.
BSA смешивали с адъювантом в соотношении BSA:адъювант=3: 1 (объемное соотношение), которое было установлено в качестве условия использования для измерения скорости адсорбции; после равномерного встряхивания адъюванта его смешивали с различными концентрациями BSA в соответствии с экспериментальными условиями, и адсорбцию при комнатной температуре проводили в течение 1 часа, и встряхивание выполняли 5 раз в течение этого периода; центрифугирование выполняли при 13000 об/мин в течение 3 минут, затем отбирали супернатант для дальнейшего использования.
Определение концентрации белка: для определения концентрации белка в EP использовали метод Лоури. В этом эксперименте, в соответствии с практической ситуацией, UV2100pro использовался для прямого определения оптической плотности супернатанта при 280 нм, показания поддерживались в пределах 0,2-0,8, в противном случае супернатант следовали разбавить.
Расчет скорости адсорбции: скорость адсорбции=[1 - OD280 (коэффициент разведения супернатанта X)/OD280 (когда скорость адсорбции разведения X равна 0)]*100
Результаты экспериментов: взяв в качестве примера Zn-ризедроновую кислоту (1/0,125), во-первых, была измерена стандартная кривая BSA. Содержание BSA в супернатанте адъюванта рассчитывали согласно стандартной кривой, а скорость адсорбции адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) к BSA рассчитывали по формуле абсорбции, которая могла достигать примерно 70%, когда BSA был 0,5 мг/мл.
Таблица 1: Скорость адсорбции адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125)
Пример 2: Определение скорости осаждения ионов металлов адъюванта на основе ризедроната цинка
Метод: пламенная атомно-абсорбционная спектрометрия, путем измерения содержания элемента цинка в супернатанте адъюванта, рассчитывали скорость осаждения его иона металла.
Пламенный метод (коррекция фона лампы D2) использовали для определения содержания цинка в адъювантах на основе ризедроната цинка, и процедура определения была стандартизирована. Детектором был атомно-абсорбционный спектрофотометр: Shimadzu AA6300C (P/N 206-52430).
Приготовление стандартного раствора и образца для определения: построение стандартной кривой: исходная концентрация цинкового стандарта составляла 500 мкг/мл, и его разбавляли 0,1 М раствором соляной кислоты до стандартов получения 500 нг/мл, 1000 нг/мл, 1500 нг/мл, 2000 нг/мл и 2500 нг/мл.
Приготовление исследуемого раствора: образец разбавляли в 400 раз 0,1 М раствором соляной кислоты и хорошо перемешивали с помощью вихревой мешалки при вибрации.
Адъювант на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125) центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин и супернатант удаляли. Для измерения образец разбавляли в 5 раз сверхчистой водой. Процесс измерения был следующим:
Способ работы AA-6300C и использование программного обеспечения WizAArd:
Включение питания: включены компьютер, выключатель питания AA-6300C, выключатель воздушного компрессора (давление 0,35 МПа), выключатель системы вентиляции;
Отверстие для ацетилена: клапан для ацетилена медленно открывали, чтобы убедиться, что первичное давление составляет 0,5 МПа, а вторичное давление - 0,1 МПа;
Базовая процедура работы программного обеспечения WizAArd: войдите в WizAArd → выберите элемент → на странице «неподключенный прибор/параметр отправки» нажмите <подключить/отправить параметр> → установить на странице «инициализация прибора» → проверьте и отметьте каждый пункт в «анализе пламени каталога проверки приборов», нажмите <OK> → установите длину волны [213,86], ширину щели [0,7], метод освещения [излучение], [настройка положения лампы] на странице« оптических параметров », чтобы убедиться, что фактическое положение и заданное положение Zn Лампы с полым катодом идентичны, выберите [лампа включена] → поиск строки → регулировка исходного положения горелки → выберите [параметр] в строке меню → [изменить параметр] → измените метод освещения на <BGC-D2> → поиск строки → зажигание: Убедившись, что C2H2 включен и давление соответствует требованиям, одновременно нажмите кнопки PURGE и IGNITE на центральной панели до тех пор, пока не произойдет зажигание → автоматическое обнуление → установите группу пустого контроля (BLK), стандартный продукт (STD) и тестовый образец (UNK) на листе MRT введите теоретическую концентрацию стандарта и название образца, и вручную загрузите образец через пробирку для образца, выходящую из распылителя, устанавливайте объем образца по меньшей мере 1 мл каждый раз, выберите [start] для проверки → остановите пламя → сохраните данные и отключите прибор от компьютера → выключить;
Результаты экспериментов: на примере Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125).
Таблица 2: Построение стандартной кривой концентрации цинка и Абс.
Таблица 3: Результаты испытаний скорости осаждения цинка в адъюванте на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125)
Пример 3: Определение скорости осаждения ризедроновой кислотой адъюванта на основе ризедроната цинка
Метод: УФ-спектрофотометрия, прибор: UV800 (Beckman coulter).
Ризедроновая кислота содержит пиридиновое кольцо с максимумом поглощения при 260 нм. Конкретный процесс обнаружения супернатанта адъюванта при 260 нм с помощью ультрафиолетового спектрофотометра был следующим:
Сначала готовили раствор ризедроната натрия 2,374 мг/мл (содержание ризедроната натрия, добавленного в адъювант на основе Zn-ризедроната (1/0,125)) с физиологическим солевым раствором, разбавленным физиологическим солевым раствором до 0,08 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,04 мг/мл, 0,03 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,015 мг/мл, 0,01 мг/мл и измеряли при длине волны 260 нм для получения значений OD260, соответственно. Одновременно центрифугировали Zn-ризедроновую кислоту (1/0,125) при 13000 об/мин в течение 10 мин, а затем отбирали супернатант. Супернатант адъюванта находился в изотонической среде и определялся при длине волны 260 нм для получения оптической плотности ризедроната натрия в супернатанте. Результаты были следующими:
Таблица 4: Концентрация ризедроната натрия и стандартная кривая OD260
Таблица 5: Скорость осаждения ризедроновой кислотой адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125)
Пример 4: Определение адъювантной активности адъюванта на основе ризедроната цинка в сочетании с рекомбинантным белком VZV gE
Приготовленные адъюванты на основе Zn-ризедроновой кислоты использовали в качестве адъювантов, в которых соотношение молярных концентраций Zn/ризедроновой кислоты составляло 1:1 и 1:0,25 соответственно, и они были отдельно использованы в качестве адъювантов и смешивались с антигеном VZV gE в объемном соотношении 1:1 для создания вакцин, а затем вакцины вводили мышам путем внутримышечной инъекции для определения специфических титров продуцируемых антител. Конкретный метод был следующим:
Экспериментальные животные: мыши Balb/C, 6-8 недель, 5 мышей/группа, самки.
Экспериментальные группы: (1) группа алюминиевого адъюванта (Al-002); (2) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25); (3) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/1);
Протокол иммунизации: 5 мкг антигена на мышь, адъювант и антиген gE VZV смешивали в объемном соотношении 1:1 для образования вакцины, а затем вводили мышам внутримышечно, 100 мкл на мышь и 50 мкл на каждую заднюю ногу. Иммунизацию проводили на 0-й, 2-й и 4-й неделях, то есть через 2 недели после первой иммунизации животных в соответствии с группой иммунизации, образцы крови собирали из глазницы для определения титров специфических антител в сыворотке. Титры антител измеряли во вторую неделю после первой иммунизации, повторную иммунизацию проводили во вторую неделю, образцы крови брали из глазницы через 2 недели после второй иммунизации, измеряли титры специфических антител в сыворотке, третью иммунизацию проводили в В то же время через 2 недели из глазницы брали образцы крови и измеряли титры антител в сыворотке с помощью ИФА.
Определение титра связывания антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА):
1. Раствор антигенного покрытия: буферный раствор 1x PB 7,4 (4,343 г Na2HPO4 • 7H2O; 0,456 г NaH2PO4).
2. Промывочный раствор: PBST, INNOVAX Co. Набор для ИФА
3. Блокирующий раствор: 2X ED (разбавление фермента): 1X PBS+0,5% казеина+2% желатина+0,1% консерванта (проклин-300), разбавленный до 1X ультрачистой водой или дистиллированной водой для герметизации и разбавления образца.
4. Раствор для проявки цвета A: INNOVAX Co. Набор для ИФА.
5. Раствор для проявки цвета B: INNOVAX Co. Набор для ИФА.
6. Стоп-раствор: INNOVAX Co. Набор для ИФА.
Порядок проведения эксперимента:
(1) Планшет для покрытия: антиген VZV gE разбавляли буферным раствором для покрытия PB7.4 до определенной концентрации. Его добавляли в 96-луночный полистирольный планшет по 100 мкл/лунку, и наносили покрытие на планшет в течение ночи при 4 °C.
(2) Блокирование: раствор для покрытия в лунке удаляли, планшет один раз промывали промывочным раствором PBST, сушили центрифугированием, добавляли блокирующий раствор по 200 мкл/лунку и блокирование проводили в течение 4 часов при комнатной температуре.
(3) Добавление сыворотки определенной степени разбавления: блокирующий раствор в лунке удаляли, планшет промывали один раз PBST, центрифугировали, в первую лунку добавляли сыворотку для тестирования в количестве 150 мкл/лунку, в каждую из следующих лунок добавляли разбавитель ED по 100 мкл/лунку, разбавляли с градиентом в 3 раза, инкубировали и проводили реакцию при 25°C в течение 1 часа.
(4) Добавление меченного ферментом антитела (GAM-HRP): разбавитель сыворотки в лунке удаляли, планшет промывали 5 раз PBST, высушивали центрифугированием, добавляли меченое ферментом антитело (GAM-HRP, V:V=1:5000) по 100 мкл/лунку, инкубировали и проводили реакцию при 25°C в течение 1 часа.
(5) Проявка цвета: вторичное антитело в лунке отбрасывали, планшет промывали 5 раз PBST, высушивали центрифугированием, добавляли 100 мкл/на лунку раствора для проявки цвета, смешивали равный объем A и B, и проводили реакцию при 25°C в течение 10 мин.
(6) Остановка реакции: добавляли 2 М стоп-раствор серной кислоты по 50 мкл /на лунку, чтобы остановить реакцию.
(7) Планшет для считывания: две длины волны 450 нм и 630 нм были установлены в качестве длин волн измерения на считывающем устройстве для микропланшетов, и было измерено значение OD каждой реакционной лунки.
Результаты экспериментов показаны на Фигуре 4:
Через две недели после однократной иммунизации мышей титры антител в группах адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25, 1/1) были выше, чем у контрольной группы, то есть они более чем в 10 раз превышали титры группы алюминиевого адъюванта, демонстрируя особенности быстрого начала действия. После двух доз иммунизации преимущества усиления гуморального иммунного ответа все еще были заметны. На 4-й неделе титр антител в группе адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25) был в 7,5 раз выше, чем в группе адъюванта с алюминием, а в группе адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/1) был в 18 раз больше, чем в группе с алюминиевым адъювантом. После трех доз иммунизации на 6-й неделе титр антител в группе адъюванта на основе Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25) был в 10 раз выше, чем в контрольной группе, а в группе на основе адъюванта Zn-ризедроновой кислоты (1/1) был в 7,5 раза больше, чем в контрольной группе.
Пример 5: Влияние иммунизации мышей адъювантом на основе ризедроната цинка в сочетании с рекомбинантным белком VZV gE на специфические изотипы антител.
Приготовленный адъювант на основе Zn-ризедроновой кислоты использовали в качестве адъюванта, в котором соотношение молярных концентраций Zn/ризедроновой кислоты составляло 1:0,25, его использовали в качестве адъюванта в сочетании с антигеном VZV gE для внутримышечной инъекции мышам, и измеряли титр, производимый специфическим антителом. Конкретный метод был следующим:
Экспериментальные животные: мыши Balb/C, 6-8 недель, 5 мышей/группа, самки.
Экспериментальные группы: (1) группа алюминиевого адъюванта (Al-002); (2) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25);
Протокол иммунизации: 5 мкг антигена на мышь, адъювант и антиген gE VZV смешивали в объемном соотношении 1:1 для образования вакцины, а затем вводили мышам внутримышечно, 100 мкл на мышь и 50 мкл на каждую заднюю ногу. Иммунизацию проводили на 0-й, 2-й и 4-й неделе, после завершения 3 инъекций иммунизации, образцы крови собирали из глазницы через 2 недели для тестирования, и использовали ИФА для определения уровней специфических изотипов антител в сыворотке.
Экспериментальные материалы:
1. Раствор антигенного покрытия: 1X буферный раствор PB 7,4 (4,343 г Na2HPO4 ⋅ 7H2O; 0,456 г NaH2PO4).
2. Промывочный раствор: PBST, набор для ИФА от компании Beijing Wantai.
3. Блокирующий раствор: 2X ED (разбавление фермента): 1X PBS+0,5% казеина+2% желатина+0,1% консерванта (проклин-300), разбавленный до 1X ультрачистой водой или дистиллированной водой для герметизации и разбавления образца.
4. Раствор для проявки цвета A: набор для ИФА от компании Beijing Wantai.
5. Раствор B для проявки цвета: набор для ИФА от компании Beijing Wantai.
6. Стоп-раствор: набор ИФА компании Beijing Wantai.
Порядок проведения эксперимента:
(1) Планшет для покрытия: антиген VZV gE разбавляли буферным раствором для покрытия PB7.4 до определенной концентрации, добавляли в 96-луночный полистирольный планшет по 100 мкл/лунку, и на планшет наносили покрытие в течение ночи при 4 °C.
(2) Блокирование: раствор для покрытия в лунке отбрасывали, планшет один раз промывали PBST, сушили центрифугированием, добавляли блокирующий раствор по 200 мкл/лунку и блокирование проводили в течение 4 часов при комнатной температуре.
(3) Добавление тестируемой сыворотки: блокирующий раствор в лунке отбрасывали, планшет один раз промывали PBST, сушили центрифугированием, добавляли тестируемую сыворотку при определенной степени разбавления 100 мкл/лунку, инкубировали и проводили реакцию в течение 1 ч при 25 °C.
(4) Добавление меченного ферментом антитела: разбавитель сыворотки в лунке отбрасывали, планшет промывали 5 раз PBST, сушили центрифугированием, добавляли меченное ферментом антитело, которое специфически распознает каждый изотип антитела (IgG1, V:V=1:30000; IgG2a, V:V=1:1000; IgG2b, V:V=1:1000) по 100 мкл/лунку, инкубировали и проводили реакцию при 25°C в течение 1 часа.
(5) Проявка цвета: меченное ферментом антитело из лунки отбрасывали, планшет промывали 5 раз PBST, сушили центрифугированием, добавляли раствор для проявки цвета, который представлял собой равный объем смеси A и B, разбавленный в 3 раза, по 100 мкл/лунку, проводили реакцию при 25°C в течение 10 мин.
(6) Остановка реакции: для остановки реакции добавляли 50 мкл/лунку 2 М стоп-раствора серной кислоты.
(7) Планшет для считывания: две длины волны 450 нм и 630 нм были установлены в качестве длин волн измерения на считывающем устройстве для микропланшетов, и измеряли значение OD каждой реакционной лунки.
Результаты экспериментов показаны на Фигуре 5:
Используя экспериментальную процедуру, описанную в примере 4, мышей иммунизировали путем внутримышечной инъекции адъюванта на основе ризедроната цинка или алюминиевого адъюванта в комбинации с рекомбинантным белком VZV gE, и процедура иммунизации была такой же, как в примере 4. После трех инъекций образцы крови собирали через 2 недели, и результаты уровня каждого изотипа мышиного сывороточного антитела были показаны на Фигуре 5. По сравнению с группой алюминиевого адъюванта, группа адъюванта на основе ризедроната цинка могла стимулировать более интенсивные уровни антител изотипов IgG2a и IgG2b, а отношения IgG1 к IgG2a и IgG2b были ниже, чем у группы с алюминиевым адъювантом, что указывает на то, что она оказывала определенный стимулирующий эффект на иммунный путь Th1.
Пример 6: Определение адъювантной активности адъюванта на основе ризедроната цинка в сочетании с терапевтическим белком для лечения гепатита В
Используя экспериментальную процедуру, описанную в Примере 4, мышей иммунизировали адъювантом на основе ризедроната цинка в комбинации с терапевтическим белком гепатита В путем внутримышечной инъекции и определяли титры сывороточных антител. Конкретный метод был следующим:
Экспериментальные животные: мыши Balb/C, 6-8 недель, 5 мышей/группа, самки.
Экспериментальные группы: (1) физиологический раствор; (2) группа алюминиевого адъюванта (Al-001-840); (3) группа ризедроната натрия; (4) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125); среди них содержание ризедроната натрия в группе (3) было таким же, как содержание ризедроната цинка в группе (4). Пожалуйста, обратитесь к Примеру 3 для получения подробной информации.
Протокол иммунизации: антиген 1,2 мкг/мышь, адъювант и терапевтический белок гепатита B смешивали в объемном соотношении 1:1 для образования вакцины, а затем вводили внутримышечно мышам, 150 мкл на мышь и 75 мкл на каждую заднюю ногу. Иммунизацию проводили на 0-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й и 6-й неделе, по 1,2 мкг антигена на мышь, образцы крови собирали из глазницы после 6-й недели, и ИФА использовали для определения уровней специфических антител в сыворотке. Пожалуйста, обратитесь к Примеру 4 для получения подробной информации.
Экспериментальные результаты: как показано на Фигуре 6, по сравнению с группой, получавшей алюминиевый адъювант, группа с адъювантом на основе ризедроната цинка характеризовалась быстрым и сильным проявлением после одной инъекции иммунизации мышей, и разница была статистически значимой; после 3 инъекций иммунизации, то есть на 4-й неделе, его преимущество в усилении гуморального иммунного ответа все еще было значительным по сравнению с группой с алюминиевым адъювантом; после 5 инъекций иммунизации оно было немного лучше, чем в группе с алюминиевым адъювантом, в то время как ризедронат натрия сам по себе также обладал определенным гуморальным иммуностимулирующим эффектом и не показал статистически значимых различий по сравнению с алюминиевым адъювантом.
Пример 7: Исследование зависимости доза-эффект адъювантной активности ризедроната цинка
Используя экспериментальную процедуру, описанную в Примере 4, мышей иммунизировали адъювантом на основе ризедроната цинка в комбинации с терапевтическим белком гепатита В путем внутримышечной инъекции и определяли титры сывороточных антител. Конкретный метод был следующим:
Экспериментальные животные: мыши Balb/C, 6-8 недель, 5 мышей/группа, самки.
Экспериментальная группа 1: (1) группа алюминиевого адъюванта (Al-001-840); (2) группа 2X Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125); (3) 0,75X группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125); (4) 0,35X группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,125).
Экспериментальные группы: (1) группа алюминиевого адъюванта (Al-002); (2) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/0,25); (3) группа Zn-ризедроновой кислоты (1/1);
Протокол иммунизации: антиген 1,2 мкг/мышь, адъювант и терапевтический белок гепатита В смешивали для образования вакцины в соотношении объемов 1:1, а затем вводили внутримышечно мышам, 100 мкл на мышь, 50 мкл на каждую заднюю ногу. Иммунизацию проводили на 0-й, 2-й и 4-й неделях, образцы крови собирали из глазницы на 0-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й и 6-й неделе, и использовали ИФА для определения уровней специфических антител в сыворотке. Пожалуйста, обратитесь к Примеру 4 для получения подробной информации.
Экспериментальные результаты: как показано на Фигуре 7, при сравнении титров сывороточных антител через 2 недели после 2 инъекций иммунизации было обнаружено, что, когда Zn-ризедроновая кислота (1/0,125) уменьшалась с 2X (2X была концентрация адъюванта в составе вакцины) до 0,75X и 0,35X, его уровень гуморального иммунного усиления и количество использованного адъюванта показали значительную взаимосвязь между дозой и эффектом; Между тем, когда Zn-ризедроновая кислота (1/0,125) снизилась с 2X до 1X, уровень усиления ее гуморального иммунного ответа не показал статистически значимой разницы. Принимая во внимание все данные, подтверждается, что Zn-ризедроновая кислота (1/0,125) обладает значительным эффектом усиления гуморального иммунитета и может быть использована в качестве усилителя иммунитета в вакцинах в будущем.
Группа изобретений относится к области фармацевтической технологии, а именно к адъюванту на основе микро/наночастиц ризедроната цинка и способу его получения, а также к средствам и композициям, содержащим указанный адъювант, и способу их получения. Предлагаемый адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинк содержит цинк и ризедроновую кислоту при соотношении молярных концентраций цинк:ризедроновая кислота 1-8:1. Способ получения адъюванта включает: a) получение растворимого солевого раствора, содержащего ионы цинка; b) равномерное смешивание раствора растворимой соли стадии а) с ризедроновой кислотой и гидроксидом натрия или равномерное смешивание раствора растворимой соли стадии а) с ризедроновой кислотой, гидроксидом натрия и раствором фосфата натрия способом последовательного осаждения, раздельного осаждения с последующим смешиванием или совместного осаждения для получения адъюванта ризедроната цинка, где полученный адъювант имеет соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты 1-8:1. Предлагаются также вакцинный адъювант, фармацевтическая композиция или иммуногенная композиция, которые содержат указанный выше адъювант, а также вакцинная композиция, которая содержит антиген и указанный выше адъювант. Способ получения вакцинного адъюванта, указанных выше композиций или носителя для доставки лекарственного средства включает получение адъюванта и включение его в состав указанных средств и композиций. Показано, что предлагаемый адъювант обладает значительным эффектом усиления гуморального иммунитета. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 табл., 7 пр., 7 ил.
1. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка, содержащий цинк и ризедроновую кислоту при соотношении молярных концентраций цинк:ризедроновая кислота 1-8:1.
2. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по п.1, где указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка имеет соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты, выбранное из 1:1, 4:1 и 8:1.
3. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп.1, 2, отличающийся любым из следующего:
(1) указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка дополнительно содержит фосфат при соотношении молярных концентраций цинк:фосфат 1-8:1; и
(2) указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка дополнительно содержит фосфат при соотношении молярных концентраций цинк:фосфат, выбранном из 1,5:1 и 4:1.
4. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-3, отличающийся любым из следующего:
(1) указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка дополнительно содержит алюминий при соотношении молярных концентраций цинк:алюминий 0,02-1:1; и
(2) указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка дополнительно содержит алюминий при соотношении молярных концентраций цинк:алюминий, выбранном из 0,375:1, 0,5:1 и 0,8:1.
5. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-4, где адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка получен способом, включающим следующие стадии:
a) получение растворимого солевого раствора, содержащего ионы цинка;
b) равномерное смешивание растворимого солевого раствора стадии а) с ризедроновой кислотой и гидроксидом натрия; или
равномерное смешивание раствора растворимой соли стадии а) с ризедроновой кислотой, гидроксидом натрия и раствором фосфата натрия,
способом последовательного осаждения, раздельного осаждения с последующим смешиванием или совместного осаждения для получения адъюванта ризедроната цинка.
6. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по п.5, отличающийся одним или более из следующего:
(1) указанный раствор растворимой соли включает раствор соляной кислоты; и
(2) указанный способ дополнительно включает стерилизацию смеси, полученной на стадии b), и хранение при 2-8°C для последующего использования.
7. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по п.6, отличающийся любым из следующего:
(1) указанная стерилизация включает стерилизацию с использованием метода стерилизации при высокой температуре и высоком давлении; и
(2) указанная стерилизация включает стерилизацию, выполняемую при 121°C в течение 30-60 минут.
8. Адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка имеет размер частиц 1-10 мкм.
9. Способ получения адъюванта на основе микро/наночастиц ризедроната цинка, включающий:
a) получение растворимого солевого раствора, содержащего ионы цинка;
b) равномерное смешивание раствора растворимой соли стадии а) с ризедроновой кислотой и гидроксидом натрия; или
равномерное смешивание раствора растворимой соли стадии а) с ризедроновой кислотой, гидроксидом натрия и раствором фосфата натрия,
способом последовательного осаждения, раздельного осаждения с последующим смешиванием или совместного осаждения для получения адъюванта ризедроната цинка,
где полученный адъювант ризедроната цинка имеет соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты 1-8:1.
10. Способ по п.9, где полученный адъювант на основе ризедроната цинка имеет соотношение молярных концентраций цинка:ризедроновой кислоты, выбранное из 1:1, 4:1 и 8:1.
11. Способ по п.9, отличающийся одним или более из следующего:
(1) указанный раствор растворимой соли включает раствор соляной кислоты; и
(2) указанный способ дополнительно включает стерилизацию смеси, полученной на стадии b), и хранение при 2-8°C для последующего использования.
12. Способ по п.11, отличающийся одним или более из следующего:
(1) указанная стерилизация включает стерилизацию с использованием метода стерилизации при высокой температуре и высоком давлении; и
(2) указанная стерилизация включает стерилизацию, выполняемую при 121°C в течение 30-60 минут.
13. Вакцинный адъювант, фармацевтическая композиция или иммуногенная композиция, содержащая адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-8.
14. Вакцинная композиция, содержащая антиген и адъювант на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-8.
15. Вакцинная композиция по п. 14, отличающаяся одним или более из следующего:
(1) указанный антиген включает белковый антиген; и
(2) указанный антиген включает гликопротеиновый антиген gE вируса ветряной оспы.
16. Способ получения вакцинного адъюванта, фармацевтической композиции, носителя для доставки лекарственного средства, иммуногенной композиции или вакцинной композиции, включающий получение адъюванта на основе микро/наночастиц ризедроната цинка по любому из пп. 1-8 в вакцинном адъюванте, фармацевтической композиции, носителе для доставки лекарственного средства, иммуногенной композиции или вакцинной композиции.
17. Способ по п. 16, отличающийся одним или более из следующего:
(1) указанная вакцина является белковой вакциной; и
(2) указанная вакцина представляет собой вакцину на основе рекомбинантного белка вируса ветряной оспы.
| WO 2018225784 A1, 13.12.2018 | |||
| LIN Y | |||
| et al | |||
| Calcium phosphate nanoparticles as a new generation vaccine adjuvant | |||
| Expert Rev Vaccines, 2017; V | |||
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| Способ многократной радиопередачи | 1922 |
|
SU895A1 |
| [онлайн], [найдено 11.11.2022] | |||
| Найдено в PubMed, PMID: 28712326, DOI: 10.1080/14760584.2017.1355733 | |||
| DE 4244422 A1, 30.06.1994 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАФЕЛЬ (ВАРИАНТЫ) | 2010 |
|
RU2431374C1 |
| CN 105669838 A, | |||
