СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/48 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в хирургии, гепатологии, гастроэнтерологии.

Известен патент РФ №2161036 на способ лечения хронических диффузных заболеваний печени. Больному вводят фетальные ткани человека в круглую связку печени (прокалывают толстой иглой апоневроз белой линии живота, т.е. достигают жировой ткани круглой связки печени, и вводят 8-10⁷ клеток взвеси живых эмбриональных гепатоцитов в 5 мл физиологического раствора). Затем в подкожную клетчатку передней брюшной стенки, например левой подвздошной области, инъекционно вводят взвесь других фетальных тканей (селезенки, надпочечников и вилочковой железы).

По сравнению с подкожным введением трансплантата в данном способе происходит увеличение количества трансплантируемых гепатоцитов в печень, соответственно увеличивается эффективность лечения. Однако, следует отметить, что несмотря на интенсивный лимфоотток в портальные ворота печени, не все вводимые гепатоциты достигают непосредственно печени. Также следует отметить малое количество вводимых эмбриональных гепатоцитов (80-100 миллионов), т.к. известно, что часть клеток погибает. Кроме того, в ходе проведения манипуляции возможны осложнения: гематома в круглой связке печени с последующим нагноением, повреждение внутренних органов брюшной полости, что может повлечь за собой оперативное лечение.

Известен патент РФ №2247565 на способы выделения и криоконсервации клеток-предшественников из печени человека, включающие обработку ткани печени человека для получения одноклеточной суспензии, содержащей клетки-предшественники и клетки, не являющиеся клетками-предшественниками, одной или более линий клеточной дифференцировки.

Здесь же заявлен способ лечения дисфункции печени, в частности цирроза печени, включающий введение эффективного количества указанных клеток (прототип). Клетки-предшественники печени предлагается вводить различными путями, в частности, напрямую в печень - хирургическим путем, через воротную вену, брыжеечную вену, печеночную артерию, печеночный желчный проток.

В основном, данное изобретение относится к получению печеночных стволовых клеток человека. Что касается способа, то, например, непонятно, какое количество клеток необходимо использовать при каждом из указанных способов введения (внутрибрюшинном, парентеральном, напрямую в печень), так как предлагается общий диапазон доз: 10³-10¹⁰ клеток. Указанная в качестве оптимальной доза в 10⁶ клеток будет, скорее всего, малоэффективной.

Следует сказать, что при введении клеток в вышеуказанные крупные сосуды не все клетки задерживаются непосредственно в печени, часть их с током крови разносится по всему организму, что снижает эффективность вводимой дозы. Кроме того, введение клеток в печень хирургическим путем предусматривает достаточно сложное хирургическое вмешательство. Наконец, следует сказать, что применение данного способа, как указывают авторы, позволяет только смягчить нарушения или дисфункции печени.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа лечения цирроза печени различной этиологии состоит в том, что суспензию клеток, полученных из печени плода человека сроком гестации 16-18 недель, и содержащую стволовые клетки, вводят больному внутрипеченочно, или внутривенно, или комбинируют оба эти способа введения. Внутрипеченочно вышеуказанную взвесь вводят чрезкожно под капсулу печени на глубину 0.5-1.0 см под контролем аппарата УЗИ в левую и/или правую доли в количестве 200-300 миллионов клеток (жизнеспособностью 80-90%) в 2.0-3.0 миллилитрах стерильного физиологического раствора (0.9% хлористого натрия). Внутривенно вводят 1.0-1.5 миллиарда клеток (жизнеспособностью 80-90%) в 100.0-200.0 миллилитрах стерильного физиологического раствора. При комбинировании обоих способов вводимая доза не должна превышать 1.5 миллиарда клеток.

Приготовление клеточного трансплантата

Ткань печени плода 16-18 недель гестации замораживают в жидком азоте при температуре -196°. Криоконсервант включает в себя диметилсульфоксид для предотвращения образования кристаллов льда. Материал донора тестируют на антитела к ВИЧ, вирусам гепатита В и С. Осуществляют реакции на Hbs-Ag и RW; пробы методом ПЦР на наличие в клетках вируса герпеса (II типа), вируса гепатита В и С, цитомегаловируса, ВИЧ. По мере необходимости материал размораживают. Ткань печени плода отмывают от криоконсерванта, мягко механически выделяют клетки, осаждают конгломераты. Взвесь клеток еще раз отмывают, клетки осаждают и разводят в необходимом объеме стерильного 0.9% физиологического раствора. Предварительно проверяют долю жизнеспособных клеток с красителем трипановым синим. Она составляет 80-90%.

Полученная популяция клеток, выделенных из печени плода 16-18 недель гестации не более чем через 6 часов после аборта, содержит более 50% ядерных клеток, из которых эритроидные клетки составляют 60%, CД34⁺ - около 10%. Содержание эритроцитов - 10-15%, печеночные клетки представлены единичными живыми клетками. Стандартная доза для введения в печень составляет (2-3)×10⁸ клеток; для внутривенного введения - 10⁹-1.5×10⁹ клеток жизнеспособностью 80-90%. Срок хранения готового трансплантата составляет не более 48 часов при температуре 4-8°С.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ характеризуется:

- меньшей травматичностью и малоинвазивностью - за счет того, что хирургическое вмешательство минимально и представляет собой введение клеточной суспезии чрезкожно под капсулу печени под контролем аппарата УЗИ;

- более эффективным внутрипеченочным путем введения суспензии клеток - под капсулу печени, минуя крупные сосуды, что позволяет введенной в печень дозе клеток здесь же и сохраниться;

- использованием более эффективных доз.

Использование предлагаемого способа может способствовать стабильному восстановлению функций печени (срок наблюдения за пролеченными больными составляет 1 год 2 месяца); позволяет проводить повторные трансплантации суспензии клеток в течение нескольких недель и таким образом получать устойчивый эффект частичной или полной компенсации нарушенных функций, а также существенно улучшать психоэмоциональную сферу пациента; улучшить качество его жизни.

Изобретение осуществляют следующим образом

Пациенту проводят следующие виды обследования: ультразвуковое исследование внутренних органов, компьютерную томографию, биохимическое исследование крови (определяют билирубин общий, прямой, непрямой, АЛТ, ACT, щелочную фосфатазу, мочевину, общий белок, альбумин, глобулины, сахар крови, маркеры гепатитов В, С), общий анализ крови, общий анализ мочи, коагулограмму, проводят биопсию печени. Если диагноз - цирроз печени - подтверждается, проводят лечение по предлагаемому способу: осуществляют трансплантацию вышеописанной взвеси клеток в печень больного или введение в периферическую вену. Также возможна комбинация введения суспензии клеток печени плода человека в печень больного и внутривенно.

В операционной укладывают больного на спину. После обезболивания места прокола (кожи, подкожно-жировой клетчатки, мышечного слоя) раствором новокаина (0.5% - 50.0 мл) под контролем аппарата УЗИ проводят прокол передней брюшной стенки в правом подреберье или через межреберья в правой половине грудной клетки. Иглу (диаметр 1,5 мм с метками, видимыми под аппаратом УЗИ) вводят под капсулу печени на глубину 0.5-1.0 см, после чего через иглу с помощью шприца вводят суспензию клеток печени плода человека сроком гестации 16-18 недель, содержащую стволовые клетки, в дозе 200-300 миллионов клеток. Жизнеспособность клеток составляет не менее 80-90%. Трансплантат можно вводить как в правую, так и в левую доли печени. После введения осуществляют контрольное ультразвуковое исследование и больного помещают в ОРИТ на сутки, где проводят наблюдение за состоянием пациента. Измеряют частоту сердечных сокращений, пульс, артериальное давление, температуру тела, частоту дыхательных движений, осуществляют контроль общего анализа крови. Проводят лечение: холод на место прокола, гемостатическую терапию. При развитии пирогенной реакции ее купируют в течение 2-3 часов антипиретиками. Через 14 дней после первой трансплантации проводят вторую, затем через 14 дней после второго введения - третью. При комбинированном введении внутривенное введение трансплантата (в периферическую вену, используют систему для переливания крови) осуществляют в ОРИТ под контролем врача.

Через каждые 3 месяца также проводят биохимическое исследование крови, общий анализ крови, общий анализ мочи, ультразвуковое исследование внутренних органов брюшной полости, компьютерную томографию.

Осуществление изобретения

Пример 1. Больная Ш., 62 лет. Поступила в городскую клиническую больницу в терапевтическое отделение в феврале 2004 года. Диагноз: первичный билиарный цирроз печени, синдром портальной гипертензии, печеночная недостаточность. Состояние больной при поступлении тяжелое, находится в бессознательном состоянии (кома I). Печень увеличена (правая доля - 17.3 см, левая - 11.2 см × 10.3 см), селезенка увеличена (15.0 см × 6.5 см × 7.0 см), скорость кровотока по v.portae - 17,0 см/сек., анорексия, печеночные пробы повышены (общий билирубин - 127.9 мкМ/л, прямой - 68.4 мкМ/л, АЛТ - 0,98 мкМ/мл·ч, ACT - 0.73 мкМ/мл·ч, альбумин - 14.8 г/л, щелочная фосфатаза - 936 Е/л). Отмечается анемия (эритроциты - 1.9×10¹²/л, гемоглобин - 61 г/л), слабость. Больной проводилась консервативная терапия, однако эффекта от лечения не было. Развилось кровотечение из варикозных вен пищевода, пациентка переведена в хирургическое отделение. После остановки кровотечения трижды (в марте, апреле 2004 года с интервалом в 2 недели) больной проводилось лечение по предлагаемому способу: вводили суспензию клеток печени плода человека сроком гестации 16-18 недель, содержащую стволовые клетки, в объеме 300 миллионов клеток - всего 900 миллионов клеток. После первой трансплантации была отмечена положительная динамика - отмечалось улучшение общего состояния организма, уменьшение печени (правая доля - 16.2 см, левая 10.8 см×9.3 см), появился аппетит. Печеночные пробы сразу после введения возрастали (общий билирубин - 156.3 мкМ/л, прямой - 77.2 мкМ/л, АЛТ - 1,08 мкМмл·ч, ACT - 0.91 мкМ/мл·ч, щелочная фосфатаза - 1043 Е/л), затем в течение 14 дней постепенно уменьшались до уровня исходных значений. После второго введения слабость прошла, пациентка стала активной, улучшилось настроение, нормализовался аппетит, печеночные пробы снизились ниже исходного уровня (общий билирубин - 98.7 мкМ/л, прямой - 53.1 мкМ/л, АЛТ - 0,78 мкМ/мл·ч, ACT - 0.62 мкМ/мл·ч, щелочная фосфатаза - 654 Е/л), печень уменьшилась до нормальных размеров (правая доля - 14.8 см, левая - 9.6 см×6.3 см), уменьшилась желтушность кожных покровов, пациентка выписана домой. После третьей трансплантации отмечалось уменьшение селезенки (13.4 см × 5.8 см×6.6 см), скорость кровотока по v.portae увеличилась до 21,0 см/сек, уменьшился общий билирубин до 45.1 мкМ/л, прямой - до 14.6 мкМ/л, нормализовались АЛТ (0,58 мкМ/мл·ч), ACT (0.40 мкМ/мл·ч), щелочная фосфатаза (265 Е/л), увеличился альбумин до 33.0 г/л, также отмечалось повышение уровня эритроцитов (3.3×10¹²/л), гемоглобина (92 г/л), кожные покровы и склеры приобрели обычную окраску. В течение 1 года 2 месяцев наблюдения восстановление функций печени сохраняется.

Пример 2. Больная Я., 57 лет. Поступила в городскую клиническую больницу в хирургическое отделение в июне 2004 года. Диагноз: первичный билиарный цирроз печени, синдром портальной гипертензии, печеночная недостаточность. При поступлении состояние средней степени тяжести, сознание ясное. Печень увеличена (правая доля - 16.8 см, левая 10.8 см × 11.3 см), скорость кровотока по v.portae составляет 18,5 см/сек, селезенка увеличена (19.5 см × 6.9 см × 17.0 см). Отмечалось снижение аппетита, печеночные пробы резко повышены (общий билирубин - 270.5 мкМ/л, прямой - 177.0 мкМ/л, АЛТ - 0,87 мкМ/мл·ч, ACT - 0.64 мкМ/мл·ч, альбумин - 23.2 г/л, щелочная фосфатаза - 872 Е/л), отмечалась анемия (эритроциты 2.7×10¹²/л, гемоглобин 88 г/л), слабость. Больной проводилась консервативная терапия в ОКБ г. Омска, эффекта от лечения не получено. Направлена в г. Новосибирск на лечение с применением клеточной терапии. В июне, июле 2004 года трижды с интервалом в 2 недели было проведено лечение по предлагаемому способу: трансплантировано по 200 миллионов клеток вышеописанной суспензии в печень, всего 600 миллионов клеток. После первой трансплантации отмечалось улучшение общего состояния организма, прошла слабость, уменьшилась печень (правая доля - 16.0 см, левая 9.8 см × 9.6 см), улучшился аппетит. Печеночные пробы сразу после введения возросли (общий билирубин - 295.7 мкМ/л, прямой - 199.0 мкМ/л, АЛТ - 1,16 мкМ/мл·ч, ACT - 0.82 мкМ/мл·ч, щелочная фосфатаза - 1030 Е/л), затем в течение 14 дней постепенно уменьшились до исходных показателей. Пациентка выписана домой. После второго введения пациентка стала активной, улучшилось настроение, нормализовался аппетит, печеночные пробы снизились и стали ниже уровня исходных (общий билирубин - 189.7 мкМ/л, прямой - 96.0 мкМ/л, АЛТ - 0,74 мкМ/мл·ч, ACT - 0.53 мкМ/мл·ч, щелочная фосфатаза - 459 Е/л). Печень уменьшилась до нормальных размеров (правая доля - 15.0 см, левая 8.2 см × 6.9 см), уменьшилась желтушность кожных покровов. После третьей трансплантации уменьшилась селезенка (15.1 см×5.3 см×10.0 см), повысился уровень эритроцитов (3.4×10¹²/л), гемоглобина (113 г/л). Скорость кровотока по v.portae увеличилась до 22,0 см/сек, уменьшился общий билирубин до 76.8 мкМ/л, прямой - до 34.6 мкМ/л, щелочная фосфатаза - 310 Е/л. Нормализовались АЛТ (0,68 мкМ/мл·ч), ACT (0.45 мкМмл·ч), альбумин (37.5 г/л). В течение 11 месяцев наблюдения восстановление функций печени стабильно сохраняется.

Изобретение относится к медицине, в частности к гепатологии и гастроэнтерологии, и касается лечения цирроза печени. Для этого осуществляют введение суспензии клеток печени плода человека, в состав которых входят стволовые клетки, или в печень больного и/или парентерально. При этом суспензию вводят под капсулу печени на глубину 0,5-1,0 см под контролем аппарата УЗИ в количестве 200-300 миллионов клеток. При внутривенном введении доза составляет 1,0-1,5 миллиарда клеток. При комбинировании обоих способов введения общая доза не превышает 1,5 миллиарда клеток. За счет подбора оптимальной глубины введения, обеспечивающей, при малой травматизации печени, сохранение в ней клеточной суспензии, содержащей стволовые клетки, способ обеспечивает стабильное восстановление функции печени у данной категории больных на срок более 1 года.

Способ лечения цирроза печени, включающий введение суспензии клеток печени плода человека, в состав которых входят стволовые клетки, в печень и/или парентерально, отличающийся тем, что суспензию вводят под капсулу печени на глубину 0,5-1,0 см под контролем аппарата УЗИ в количестве 200-300 миллионов клеток; внутривенно вводят 1,0-1,5 миллиарда клеток; при комбинировании обоих способов введения общая доза не превышает 1,5 миллиарда клеток.