СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 A61K35/50 A61P1/16 

Описание патента на изобретение RU2739855C1

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных.

Известен способ восстановления биохимических показателей крови лабораторных животных с токсическим гепатитом путем использования спиртового эктракта лавра благородного (Laurus nobilis). Токсическое повреждение печени моделировали путем внутрибрюшинного введения четыреххлористого углерода (CCl4). Экстракт лавра вводился в количестве 0,2 мл/100 г массы лабораторного животного (https://docplayer.ru/69619930-Biohimicheskie-pokazateli-krovi-krys-s-toksicheskim-gepatitom-pri-deystvii-spirtovogo-ekstrakta-lavra-blagorodnogo-laurus-nobilis.html). Недостатком данного подхода является то, что спиртовый экстракт лаврового листа нельзя употреблять пациентам с мочекаменной болезнью, при острой или хронической почечной недостаточности, при нефритах, тяжелой форме сахарного диабета. (Лавренов В.К., Лавренова Г.В. «Энциклопедия лекарственных растений народной медицины, Санкт-Петербург, Издательский дом «Нева», 2003 - 126 с.).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных путем введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 4 млн кл./кг ММСК. (Изменение биохимических показателей крови лабораторных животных с токсическим гепатитом после введения ММСК // Сборник материалов VI Международной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований: перспективы развития», Чебоксары 2018. С 44-46.) Недостатком данного подхода является использование высокой концентрации клеток в единице объема вводимой суспензии. Так, было суспендировано 4 млн кл./кг ММСК в 0,2 мл. 0,9% раствора NaCl. Эта концентрация клеток (ММСК) может вызвать эмболию, при этом отмечается достаточно высокая активность ферментов цитолиза гепатоцитов.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с токсическим гепатитом.

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в исключении возможности развития эмболии трансплантированными клетками, а также в более существенном снижении уровня в крови показателей, характеризующих цитолиз гепатоцитов - аланинаминотрансфераза (ACT), аспартатаминотрансфераза (ACT), щелочной фосфатазы.

Технический результат достигается путем внутривенной сочетанной аллогенной трансплантации ММСК, полученных из хориона плаценты лабораторных животных в дозе 2 млн. клеток/кг и полученных из хориона плаценты лабораторных животных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в дозе 300 тыс. клеток/кг.

Способ позволяет обеспечить восстановление биохимических показателей периферической крови при циррозе печени и исключить возможность развития эмболии трансплантированными клетками.

Сущность изобретения обеспечена проведением сочетанной трансплантации лабораторным животным плацентарных ММСК и ГСК в количестве 4 млн клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг соответственно.

Эффективность применения ММСК обусловлена тем, что они вырабатывают противовоспалительные цитокины (интерлейкин-10, трансформирущий фактор роста -β), факторы роста, необходимые для дифференцировки звездчатых клеток печени (клетки Ито) в гепатоциты. ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Способность ММСК в заявляемой дозировке оказывает иммуносупрессивное действие, обеспечивающее приживление аллогенного трансплантата.

ГСК способны дифференцироваться в гепатоциты. (Роль стволовых клеток в регенерации печени и перспективы их использования в лечении печеночной недостаточности / А.Н. Лызиков, А.Г. Скуратов, Е.В. Воропаев, А.А. Призенцов // Проблемы здоровья и экологии. - 2012, №2 (32). - С. 7-13.). В то же время известно, что ММСК способны вырабатывать хемоаттрактант для ГСК, обеспечивая их направленную миграцию (Стволовые клетки, их свойства, источники получения и роль в регенеративной медицине / А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, И.Ю. Маклакова. - Екатеринбург, 2016. - 282).

Заявляемая дозировка ММСК и ГСК подобрана эксперементальным путем и способствует активации регенерации печени и исключает возможность развития эмболии трансплантированными клетками.

Из анализа научно-технической и патентной литературы использования плацентарных ММСК и ГСК для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 28 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 7-8 месяцев с массой 25-30 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.

Лабораторные животные были разделены на опытные и контрольные группы (по 7 животных в каждой группе). Лабораторным животным опытных групп внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 2 млн. клеток/кг и 300 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольных групп вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно. Токсический гепатит вызывали путем внутрибрюшинного введения CCl4 (четыреххлористый углерод) в дозе 50 мкг/кг. Трансплантация клеток осуществлялась в хвостовую вену через 1 час после введения четыреххлористого углерода однократно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 3 и 7 сутки после трансплантации клеток.

Клеточные культуры

Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты.

Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (X. Muniraetal., 2009).

Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, C3e, Ly-6G, M1/70, Ter-119).

В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).

Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.

Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-) был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).

Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из ткани плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×106 клеток на 1 см2. Культивирование ММСК проводилось в условиях CO2-инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.

При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.

Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagentypeI и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).

Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски vonKossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguelletal., 2004).

Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.

Производилась оценка биохимических показателей периферической крови на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе Chem Well 2910 (Combi) на 3 и 7 сутки после трансплантации клеток. Изучались следующие биохимические показатели: альбумин, мочевина, глюкоза, общий билирубин, аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), щелочная фосфатаза.

Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).

Сравнительные данные показателей приведены в таблицах 1 и 2.

Как видно из таблицы 1 и 2, на 3 и 7 сутки по заявляемому способу биохимические показатели периферической крови, отражающие степень выраженности цитолиза гепатоцитов существенно ниже, чем в прототипе. Таким образом, выявлено, что сочетанная аллогенная трансплантация плацентарных ММСК и ГСК (заявляемый способ) влияет на восстановление биохимических показателей в существенно большей степени, чем прототип. Заявляемое изобретение исключает возможность развития эмболии трансплантированными клетками.

Похожие патенты RU2739855C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ 2019
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Гаврилов Илья Валерьевич
RU2729931C1
Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки 2017
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Ястребов Анатолий Петрович
RU2654228C1
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ СЕЛЕЗЕНКИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ 2016
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Ястребов Анатолий Петрович
RU2639404C1
Способ лечения фиброза печени аллогенной трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) лабораторных животных 2022
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Слаутин Василий Николаевич
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Ковтун Ольга Петровна
  • Сазонов Сергей Владимирович
RU2802673C1
СПОСОБ АКТИВАЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ МИЕЛОИДНОЙ ТКАНИ СТАРЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ 2013
  • Ястребов Анатолий Петрович
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Леонтьев Сергей Леопольдович
  • Сазонов Сергей Владимирович
RU2523574C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РЕГЕНЕРАТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЭПИТЕЛИЯ КИШЕЧНИКА КРЫС ПОСЛЕ ЛУЧЕВОЙ НАГРУЗКИ 2013
  • Ястребов Анатолий Петрович
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Леонтьев Сергей Леопольдович
  • Сазонов Сергей Владимирович
RU2524804C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 2012
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Ястребов Анатолий Петрович
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Леонтьев Сергей Леопольдович
  • Сазонов Сергей Владимирович
RU2474610C1
СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СЕЛЕЗЕНКИ ПОСЛЕ ЛУЧЕВОЙ НАГРУЗКИ 2013
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Ястребов Анатолий Петрович
  • Маклакова Ирина Юрьевна
  • Леонтьев Сергей Леопольдович
  • Сазонов Сергей Владимирович
RU2551937C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ИММУНОМАГНИТНОЙ СЕПАРАЦИИ 2011
  • Ястребов Анатолий Петрович
  • Гребнев Дмитрий Юрьевич
  • Маклакова Ирина Юрьевна
RU2481396C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОГО МОЗГА 2010
  • Савченко Валерий Григорьевич
  • Дризе Нина Иосифовна
  • Кузьмина Лариса Анатольевна
  • Петинати Наталья Арнольдовна
  • Паровичникова Елена Николаевна
  • Шипунова Ирина Николаевна
  • Свинарева Дарья Анатольевна
  • Момотюк Кира Сергеевна
  • Ольшанская Юлия Вячеславовна
RU2454247C1

Реферат патента 2020 года СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных (мышей, крыс). Способ предотвращения развития эмболии трансплантированными клетками у лабораторных животных заключается в том, что осуществляют внутривенную сочетанную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), полученных из хориона плаценты лабораторных животных, и полученных из хориона плаценты лабораторных животных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) соответственно: ММСК в дозе 2 млн клеток/кг, ГСК в дозе 300 тыс. клеток/кг. Изобретение обеспечивает восстановление биохимических показателей периферической крови при циррозе печени и исключает возможность развития эмболии трансплантированными клетками. 2 табл.

Формула изобретения RU 2 739 855 C1

Способ предотвращения развития эмболии трансплантированными клетками у лабораторных животных с токсическим гепатитом, заключающийся в том, что осуществляют внутривенную сочетанную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), полученных из хориона плаценты лабораторных животных, и полученных из хориона плаценты лабораторных животных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) соответственно: ММСК в дозе 2 млн клеток/кг, ГСК в дозе 300 тыс. клеток/кг.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2739855C1

В.С
РУДАКОВ и др
Влияние трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на регенерацию печени после обширной резекции в эксперименте / Гены и Клетки, 2018, т
XIII, N 2, стр
Пуговица 0
  • Эйман Е.Ф.
SU83A1
XIAO-PENG TANG et al
Clinical and experimental study on therapeutic effect of umbilical cord blood transplantation on

RU 2 739 855 C1

Авторы

Маклакова Ирина Юрьевна

Гребнев Дмитрий Юрьевич

Вахрушева Виктория Чаукатовна

Гаврилов Илья Валерьевич

Даты

2020-12-29Публикация

2020-01-09Подача