СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ Российский патент 2020 года по МПК A61M5/14 A61K35/50 A61P1/16 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных (крыс).

Известен способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных путем продедения после облучения внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в дозе 6,2 млн клеток/кг и гемоплэтичных стволовых клеток (ГСК) в дозе 330 тыс клеток/кг (RU, патент №2639404, МПК G09B/23/28, А61К 35/28, опубл. 21.12.2017 бюл. №36).

Недостатком данного способа является высокая концентрация ММСК (6,2 млн клеток/кг) при их сочетанном введении с ГСК, что может вызвать нарушения гемостаза. (Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Макаревич П.И. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. - Москва, 2017. - С. 303.).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных (крыс) с циррозом печени введением аутогенных ММСК из костного мозга бедренной кости в дозе 2 млн на 100 г (2 млн на кг) Цирроз печени моделировали путем подкожного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в виде 50% масляного раствора из расчета 0,3 мл/100 г массы животного, дважды в неделю в течение 12 недель. (Экспериментальное исследование аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в лечении цирроза печени / Б.А. Агаев, P.M. Агаев, А.Г. Попандопуло, Р.Э. Джафарли // Гены и клетки, Том IX, №1. - 2014. С. 58-63.

Недостатком данного способа является высокая концентрация ММСК (6,2 млн клеток/кг) при их сочетанном введении с ГСК, что может вызвать нарушения гемостаза.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени.

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в восстановлении уровня в крови показателей, характеризующих цитолиз гепатоцитов - алананаминотрансфераза (ACT), аспартатаминотрансфераза (ACT), лактатдегидрогенызы (ЛДГ), а также показателей, характеризующих белковый обмен - общий белок, содержание альбуминов.

Технический результат достигается за счет сочетанной внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн. клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг.

Способ позволяет обеспечить восстановление биохимических показателей периферической крови при циррозе печени.

Сущность изобретения обеспечена проведением сочетанной трансплантации лабораторным животным плацентарных ММСК и ГСК в количестве 4 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг соответственно.

Учитывая способность ММСК к выработке фактора роста стволовой клетки (SCF), который через увеличение количества звездчатых клеток печени Ито, обеспечивает увеличение количества гепатоцитов, а также способность ММСК к выработке противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, трансформирующий фактор роста - β), представляется перспективным изучение возможностей активации регенерации печени после ее повреждения с использованием данного вида клеток.

В то же время известно, что ММСК, выделенные из плаценты, обладают большей пролиферативной активностью и большим пролиферативным потенциалом по сравнению с ММСК, выделенными из других источников. Способность ММСК к выработке иммуносупрессивных факторов определяет возможность проведения аллогенной трансплантации.

Заявляемая дозировка подобрана эксперементальным путем и способствует активации регенерации печени.

Из анализа научно-технической и патентной литературы использования плацентарных ММСК и ГСК для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных крысах-самцах в возрасте 6-8 месяцев с массой 150-180 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.

Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 4 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно (в портальную вену). Забой лабораторных животных осуществлялся на 8 неделе после трансплантации клеток.

Клеточные культуры

Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты.

Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (X. Muniraetal., 2009).

Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD 117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).

В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).

Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.

Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-) был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).

Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из ткани плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×10⁶ клеток на 1 см². Культивирование ММСК проводилось в условиях CO₂-инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.

При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.

Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител MesenchymalStemCellCharacterizationKit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagentypeI и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).

Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCellT echnologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски vonKossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil RedO (J. J. Minguelletal., 2004).

Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.

Моделирование цирроза печени

Цирроз печени моделировали путем подкожного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в виде 50% масляного раствора из расчета 0,3 мл/100 г массы животного, дважды в неделю в течение 12 недель. Цирроз печени был верифицирован по биохимическим и морфологическим критериям (фиброз с формированием соединительнотканных септ и ложных долек, дистрофия и некроз гепатоцитов).

Трансплантация ММСК и ГСК

Трансплантацию плацентарных ММСК и ГСК осуществляли в портальную вену.

Производилась оценка биохимических показателей периферической крови на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе Chem Well 2910 (Combi) после трансплантации клеток. Изучались следующие биохимические показатели: альбумин, общий белок, аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ).

Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).

Как видно из таблицы №1, по заявляемому способу биохимические показатели периферической крови, отражающие степень выраженности цитолиза гепатоцитов существенно ниже (АЛТ, ACT, ЛДГ), чем в прототипе. При этом показатели белкового обмена (общий белок, альбумины) увеличились и достоверно отличаются от прототипа. Таким образом, полученные биохимические данные периферической крови свидетельствуют о снижении цитолиза в печени и восстановлении до значений нормы белок синтетической функции печени. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что сочетанная трансплантация плацентарных ММСК и ГСК способствует восстановлению биохимических показателей периферической крови при циррозе печени в большей степени, чем трансплантация аутогенных ММСК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной медицине. Для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени проводят введение мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн клеток/кг. Дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг. Способ позволяет восстановить биохимические показатели периферической крови при циррозе печени. 1 табл.

Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени, включающий введение мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК), отличающийся тем, что используют ММСК, выделенные из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн клеток/кг и дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг.