СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ДЕРМАТАНСУЛЬФАТА Российский патент 2008 года по МПК C08B37/00 

Изобретение относится к области химии и биохимии, в частности к способу получения новых веществ, производных дерматансульфата, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.

Дерматансульфат (хондроитинсульфат В) является полисахаридом линейного строения, относится к классу кислых гликозаминогликанов, содержится в коже, сухожилиях, связках млекопитающих и человека, состоит из остатков L-идуроновой кислоты и N-ацетил -D-галактозамин-4-сульфата, связанных между собой (β1→3) и (β1→4) гликозидными связями.

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств кислых гликозаминогликанов, модифицированных по карбоксильной функции. Модификация полисахаридов позволяет изменить их физико-химические и биологические свойства, конъюгаты полисахаридов с лекарственными субстанциями могут обладать большей растворимостью или продолжительностью действия по сравнению с самими лекарствами, могут использоваться как препараты комбинированного действия.

Известен способ модификации хондроитин-6-сульфата по карбоксильной группе водорастворимым 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимидом (EDC) [US 20020013264; Pumphrey C.Y., Theus A.M., Li Sh., Parrish R.S., Sanderson R.D. Neoglycancs, Carbodiimide-modified Glycosaminoglycans. // Cancer Research. - 2002. - Vol.62. - P.3722-3728]. При этом способе в водный раствор хондроитинсульфата (5 мг/мл) добавляют 0.1 М водный раствор карбодиимида, смесь выдерживают в течение суток при 4°С. Образуются О-ацилмочевины хондроитинсульфата. Синтезированные конъюгаты обладают противоопухолевой активностью, выделены в новый класс соединений - неогликанов.

Для ковалентного связывания аминосодержащих соединений с гликозаминогликанами (ГАГ-СООН) в качестве конденсирующих реагентов также применяются водорастворимые карбодиимиды, например EDC. При этом образуются соответствующие амиды.

С помощью EDC получены конъюгаты хондроитинсульфатов с коллагеном (искусственная кожа) [L.Zhang, D. Ma, F. Wang, Q. Zang, // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2002 г., v. 30, p.319], желатином и гиалуроновой кислотой [Ch.-H. Chang, H.-C. Liu, С.-С.Lin, C.-H. Chou, F.-H. Lin, Biomaterials, 2003 г., v.24, p.4853-4858], а также с дигидразидом адипиновой кислоты (ДГАК) [К.R.Kirker, Y.Luo, J.H.Nielson, J.Shelby, G.D.Prestwich // Biomaterials, 2002, v.23, p.3661]; конъюгаты с ДГАК затем были подвергнуты межмолекулярной сшивке под действием терминальных альдегидных групп полиэтиленгликоля.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты*(* Гиалуроновая кислота, как и дерматансульфат, относится к классу гликозаминогликанов.). Гиалуроновая кислота была модифицирована по карбоксильной группе ароматическими аминокислотами (4- и 5-аминосалициловыми, антраниловой и n-аминобензойной) с помощью EDC в водной среде, рН 4.7-4.8, при комнатной температуре. Очистку от низкомолекулярных реагентов осуществляли с помощью трехкратного переосаждения конъюгатов этанолом. При этом содержание ариламидных групп в модифицированных продуктах достигало 9-43% в зависимости от природы аминокислоты и соотношения реагентов [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева Е.С., Голикова М.Т., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами. // Биоорг. химия. 2005 г. - Т.31. - №1. - С.90-95].

Авторами предлагается способ получения модифицированного дерматансульфата (из свиной кожи) путем его взаимодействия с соединениями, содержащими первичную аминогруппу (RNH₂), в водной среде (рН 4.7-4.8) в присутствии EDC при различных соотношениях реагентов ДС:RNH₂:EDC=1:1:0.75 и ДС:RNH₂:EDC=1:1:1.5. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 30 минут с образованием соответствующих конъюгатов с высокой конверсией карбоксильных групп дерматансульфата. В качестве аминосодержащих соединений были использованы фармакологически значимые n- и о-аминофенолы, 5- и 4-аминосалициловые, антраниловая и n-аминобензойная кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин), β-диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид), 2-аминоэтансульфоновая кислота (таурин), 7-аминоцефалоспориновая кислота, а также сульфаниламидные препараты, содержащие первичную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий) и др.

где R=C₆H₄OH (остатки n- или о-аминофенола), С₆Н₄СООН (остатки n-аминобензойной и антраниловой кислот), C₆H₃(OH)COOH (остатки 4- или 5-аминосалициловых кислот), С₆Н₄СООС₂Н₅ (остаток этилового эфира n-аминобензойной кислоты), С₆Н₄СОС(СН₂)₂N(С₂Н₅)₂ (остаток бета-диэтиламиноэтилового эфира n-аминобензойной кислоты), C₅H₄NCONH (остаток гидразида изоникотиновой кислоты), C₂HCH₂SO₃H (остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты), C₉O₅NSH₁₀ (остаток 7-аминоиефалоспориновой кислоты), а также остатки сульфаниламидных препаратов, содержащих свободную аминогруппу, таких как C6H₄SO₂NH₂ (остаток n-аминобензолсульфамида), C₆H₄SO₂N(Na)COCH₃, (остаток n-аминобензолсульфацетамид-натрия) и др.

Пример 1. К смеси 74.5 мг (0.15 ммоль) дерматансульфата*(* Дерматансульфат выделяли из свиной кожи, очищали методом колоночной анионобменной хроматографии. Идентифицировали методом ЯМР-спектроскопии. Содержание серы 6.02%, белка (по Лоури) - 0.83%.) (ДС) и 0.15 ммоль соответствующего аминосодержащего соединения (RNH₂) в 15 мл Н₂О добавляют 0.1 н. NaOH (или, если требуется, 0.1 н. HCl) до рН 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 21.5 мг (0.11 ммоль) EDC (соотношение реагентов ДС:RNH₂:EDC=1:1:0.75), поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. HCl. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до рН 7-8), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 45-60 мл охлажденного этанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 30-35 мл этанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают этанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре ≤60°С и пониженном давлении. Получают ˜65-80 мг соответствующих конъюгатов в виде белых порошков с розовым или желтым оттенком.

Пример 2. Реакцию дерматансульфата с соответствующим амином проводят аналогично примеру 1, но при этом используют следующее соотношение реагентов: ДС:амин:EDC=1:1:1.5, т.е. к 74.5 мг (0.15 ммоль) дерматансульфата прибавляют 0.15 ммоль соответствующего амина и 43 мг (0.22 ммоль) карбодиимида.

Конверсию карбоксильных групп дерматансульфата определяли из соотношения приведенных к одному протону суммарных интенсивностей сигналов протонов, отвечающих остаткам аминов, и сигналов метальных протонов ацетамидной группы N-ацетилгалактозамина в области 2.1 м.д. в ¹Н-ЯМР-спектрах.

Спектры ¹Н-ЯМР регистрировали для растворов в D₂O на спектрометре Bruker AMX-300 (рабочая частота для ¹Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Характеристика конъюгатов дерматансульфата приводится в таблице.

Изобретение относится к получению модифицированного дерматансульфата (ДС) путем его взаимодействия с аминосодержащими соединениями в водной среде при рН 4,7-4,8, в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC). При этом в качестве аминосодержащих веществ используют соединения общей формулы RNH₂, где R=C₆H₄OH (остатки n- или о-аминофенола), С₆H₄СООН (остатки n-аминобензойной или антраниловой кислот), С₆Н₃(ОН)СООН (остатки 4-или 5-аминосалициловых кислот), С₆Н₄СООС₂Н₅ (остаток этилового эфира n-аминобензойной кислоты), С₆Н₄СОО(СН₂)₂N(С₂Н₅)₂ (остаток β-диэтиламиноэтилового эфира n-аминобензойной кислоты), C₅H₄NCONH (остаток гидразида изоникотиновой кислоты), CH₂CH₂SO₃H (остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты), C₉O₅NSH₁₀ (остаток 7-аминоцефалоспориновой кислоты), а также остатки сульфаниламидных препаратов, содержащих свободную аминогруппу, таких как C₆H₄SO₂NH₂ (остаток n-аминобензолсульфамида), C₆H₄SO₂N(Na)COCH₃ (остаток n-аминобензолсульфацетамид-натрия) при мольном соотношении реагентов ДС:RNH₂:EDC=1:1:(0,75-1,50), с последующей очисткой от низкомолекулярных реагентов. Полученные производные дерматансульфата могут быть использованы в медицине и фармакологии. 1 табл.

Способ получения модифицированного дерматансульфата (ДС) путем его взаимодействия с аминосодержащими соединениями в водной среде, рН 4,7-4,8, в присутствии конденсирующего реагента 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (EDC), отличающийся тем, что в качестве аминосодержащих веществ используют соединения общей формулы RNH₂, где R=С₆Н₄ОН (остатки n- или о-аминофенола), С₆Н₄СООН (остатки n-аминобензойной или антраниловой кислот), С₆Н₃(ОН)СООН (остатки 4- или 5-аминосалициловых кислот), С₆Н₄СООС₂Н₅ (остаток этилового эфира n-аминобензойной кислоты), С₆H₄СОС(СН₂)₂N(C₂Н₅)₂ (остаток β-диэтиламиноэтилового эфира n-аминобензойной кислоты), C₅H₄NCONH (остаток гидразида изоникотиновой кислоты), CH₂CH₂SO₃H (остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты), C₉O₅NSH₁₀ (остаток 7-аминоцефалоспориновой кислоты), а также остатки сульфаниламидных препаратов, содержащих свободную аминогруппу, таких как C₆H₄SO₂NH₂ (остаток n-аминобензолсульфамида), C₆H₄SO₂N(Na)COCH₃ (остаток n-аминобензолсульфацетамид-натрия) при мольном соотношении реагентов ДС:RNH₂:EDC=1:1:(0,75-1,50), с последующей очисткой от низкомолекулярных реагентов.