КОНЪЮГАТ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ С НОВОКАИНОМ С АМФОТЕРНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2013 года по МПК A61K31/728 C08B37/08 

Изобретение относится к новым химическим веществам, а именно к модифицированной гиалуроновой кислоте, которая может быть использована в косметической, пищевой индустрии, в фармакологии, ветеринарной практике и фармацевтической промышленности.

Гиалуроновая кислота (ГК) - гетерополисахарид линейного строения, относится к классу кислых гликозаминогликанов, находится в соединительных тканях животных и человека и состоит из звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина. Молекулярная масса ГК 10⁴-2×10⁶ Да.

На основе ГК выпускаются следующие фармакопейные препараты. Высокомолекулярная ГК (М=10⁶ Да) входит в состав гелей «Provisk» (Швеция) и «Healon» (Канада), применяющихся в офтальмохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках «Seprafilm» для предупреждения спаечной болезни брюшины. Низкомолекулярной ГК пропитывают салфетки «Гиаплюс», предназначенные для лечения ожоговой болезни. Для лечения трофических язв и угрей применяют цинковую соль ГК (лекарственное средство «Куриозин» (в виде раствора и геля), а препарат «Цистистат» предназначается для восстановления поврежденной слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите. ГК является составным компонентом косметических шампуней, кремов и тоников для стимуляции роста волос. Запатентовано также применение ГК в лечении герпеса, псориаза, а также для изготовления суппозиториев различного назначения [Понеделькина И.Ю., Лукина B.C., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. №1. С.5-28].

ГК является отрицательно заряженным полиэлектролитом. Введение в структуру ГК групп с противоположным зарядом придает молекулам ГК амфотерные свойства, при этом усиливаются внутри- и межмолекулярное взаимодействие макромолекул. ГК приобретает способность образовывать гидрогели, обладающие влагоудерживающими свойствами. Также полиамфолиты на основе ГК могут применяться как носители для других молекул, например, ДНК [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Mamyama A. Synthesis of novel polyampholyte comb-type copolymers consisting of a poly(L-lysine) backbone and hyaluronic acid side chains for a DNA carrier // Bioconjug Chem. 1998. V.9. №4. P.476-81].

Среди известных синтезированных ранее производных ГК амфотерными по структуре являются конъюгаты ГК с карбодиимидами различного строения [Vercruysse K.P., Prestwich G.D. Hyauronate derivatives in drug delivery // Therapeutic Drug Carrier Systems. 1998. V. 15. №5. P.513-555], с гидразидом изоникотиновой кислоты [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С.(www.anrb.ru/ink, диссер. совет)] и гексаметилендиамином [Yeom J., Bhang S., Kim B-S., Seo M.S., Hwang E.J., Cho I.H., Park J.K., Hahn S.K. Effect of cross-linking reagents for hyaluronic acid hydrogel dermal fillers on tissue augmentation and regeneration // Bioconjugate Chem. 2010. V.21, P. 240-247]. Амфотерные свойства этих конъюгатов не исследованы.

Одним из способов получения ГК с амфотерными свойствами является ковалентное связывание ГК с β-диэтиламиноэтиловым эфиром пара-аминобензойной кислоты (новокаином). Новокаин относится к классу местноанестезирующих препаратов. Кроме анестезирующего действия, новокаин при непосредственном введении в ток крови оказывает общее влияние на организм: уменьшает образование ацетилхолина и понижает чувствительность периферических холинорецепторов, проявляет блокирующее влияние на вегетативные ганглии, ослабляет спазмы гладкой мускулатуры, возбудимость мышцы сердца и моторных зон коры большого мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг. 1997. Т.2. С.590]. В организме новокаин относительно быстро гидролизуется, образуя п-аминобензойную кислоту (витамин Hi) и диэтиламиноэтанол (оказывает умеренное сосудорасширяющее действие), которые сами являются фармакологически-активными веществами.

Конъюгаты гликозаминогликанов (ГАГ) (хондроитин-сульфатов, гепарина и окисленной по первичной гидроксигруппе гиалуроновой кислоты) с новокаином являются известными [1-8, см. ниже ссылки]. Они были получены реакцией ГАГ с новокаином в присутствии конденсирующего реагента водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) и содержали (в зависимости от соотношения реагентов), по данным ЯМР-спектроскопического анализа, 33-38% остатков новокаина (в расчете на 100 дисахаридных звеньев) в модифицированном хондроитинсульфате, 66-90% - в модифицированном гепарине, 60% - в окисленной ГК (схема 1). Ссылки 1-8:

1. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина B.C., Тюмкина Т.В., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Химическая модификация гепарина // Биоорг. химия. 2006. Т.32. №5. С.524-529;

2. Понеделькина И.Ю., Лукина Е.С., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. №1. С.5-28;

3. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М. Конъюгация хондроитинсульфатов с аминами // Биоорг. химия. 2008. Т.34. №5. С.704-710;

4. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С., Суфиярова Р.Ш. Парфенова Т.И., Башкатов С.А., Сибагатуллин Н.Г., Джемилев У.М. // Пат. РФ №2283320. Опубл. 10.09.2006. БИ №25;

5. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С.Сибагатуллин Н.Г., Суфияров И.Ф., Серик Е.М., Джемилев У.М. // Пат. РФ №2298406. Опубл. 10.05.2007. БИ №13;

6. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М., Иванова О.В, Саитгалина Э.А. // Пат. РФ №2318830. Опубл. 10.03.2008. БИ №7;

7. Понеделькина И.Ю., Саитгалина Э.А., Лукина Е.С., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Патент РФ №2350625. Опубл. 27.03.2009. БИ №9;

8. Понеделькина И.Ю., Суфияров И.Ф., Лукина Е.С., Саитгалина Э.А., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Пат. РФ №2343932. Опубл. 20.01.2009. БИ №2.

Схема 1

Кроме остатков новокаина, конъюгаты хондроитинсульфатов из пупочных канатиков новорожденных содержали 3% O-ацилизомочевин (продуктов присоединения КДИ по карбокси-группам), конъюгаты гепарина -3-10%, конъюгаты дерматансульфата из кожи свиньи - 32%.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является конъюгат ГК, содержащий, в зависимости от соотношения реагентов, 10-53% остатков новокаина и 18-36% уреидных остатков (O-ацилизомочевин) [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С. (www.anrb.ru/ink. диссер. совет)] (рис.1). Он был получен согласно схеме 1 и при большом содержании O-ацилизомочевин практически не растворялся в воде.

Главным недостатком упоминаемого конъюгата является наличие в его составе побочных продуктов присоединения карбодиимида (рис.1), вследствие чего растворимость соединения практически сводилась к минимуму.

Рис.1.

Задачей предлагаемого изобретения является получение обладающего амфотерными свойствами водорастворимого конъюгата ГК с новокаином, не содержащего побочных продуктов. Это достигается следующим образом. Реакцию ГК с новокаином проводят в присутствии КДИ и N-гидроксибензотриазола (HOBt) как добавки, препятствующей образованию побочных O-ацилизомочевин. Синтез осуществляют в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 30-60 мин при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1-2:0.5-2:0.75-2 и получают водорастворимые продукты с 20-50% остатков новокаина, не содержащие O-ацилизомочевин (схема 2). Следует отметить, что HOBt применяется в пептидном синтезе и иногда используется в карбодиимидном синтезе некоторых производных ГК (в 1-5-кратном избытке по отношению к СООН-группе субстрата) [Kurisawa М., Chung J.E., Yang Y.Y., Gaoa Sh.J., Uyama H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering // Chem. Commun. 2005. P. 4312-4314; Bulpitt P., Aeschlimann D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V.47. P.152-169; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A., Capitani D., Mannina L. Synthesis and partial characterization of hydrogels obtained via glutaraldehyde crosslinked of acetylated chitosan and of hyaluronan derivatives // Biomacromolecules. 2003. V.4. P.1045-1054; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A. New gelatin-based hydrogels via enzymatic net working // Biomacromolecules. 2002. V.3. P.1384-1391].

Схема 2

Все образцы конъюгатов ГК с 20-50% остатков новокаина проявляли свойства полиамфолитов [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. №4. P.476-481.], т.е. измеренная при 500 нм мутность их водных растворов (при концентрации 4 мг/мл) изменялась при варьировании рН от 2 до 11. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5 (табл.1).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 0.1 г (0.25 ммоль) ГК, 0.07 г (0.25 ммоль) новокаина, 0.016 г (0.125 ммоль) HOBt помещают в стеклянную емкость объемом 100 см³, оборудованную магнитной мешалкой. Затем добавляют 25 мл дистиллированной воды. Все компоненты перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Доводят раствор до рН 4.75 с помощью 0.1 М NaOH, прибавляют 0.036 г (0.19 ммоль) водорастворимого КДИ и интенсивно перемешивают реакционную массу в течение 0.5 ч, поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 М НСl. Далее к охлажденной до 0-5°С реакционной массе добавляют 0.1 М NaOH (до рН 7), 3-5 мл насыщенного раствора NaCl и 75 мл этилового спирта. Образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин. Полученный осадок растворяют в 15 мл 6% NaCl и добавляют 45 мл этилового спирта. Вновь образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин, промывают этиловым спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. Таким образом получают модифицированную ГК с новокаином со степенью замещения карбоксильных групп полимера 20% мол. (схема 2).

Для получения конъюгатов с новокаином использовали ГК с молекулярной массой от 40 кДа [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева B.C., Голикова М.Т., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорган. химия. 2005 г. Т. 31. №1. С.90-95]) и выше.

Конверсию карбоксильных групп ГК в амидные определяли по данным ¹Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков новокаина (сигнал с δ 1.4 м.д. (т, J=14.1 и 7.0 H₂, NCF₂CH₃)) по отношению к интенсивности сигнала метильных протонов ацетамидной группы ГК в области 5 2 м.д. в качестве внутреннего стандарта. Спектры ¹H-ЯМР и ¹³С-ЯМР регистрировали для растворов в D₂O на спектрометре Bruker АМХ-400 (рабочая частота для ¹Н-ЯМР - 400 МГц), в качестве стандарта использовали ацетон. Спектры в видимой области (500 нм) получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Амфотерные свойства конъюгата ГК с 20% остатков новокаина в зависимости от рН (от 2 до 11) исследовали по методике, приведенной в работе Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. №4. P.476-481. Готовили несколько растворов образца с концентрацией 4 мг/мл, рН каждого раствора доводили до нужного значения и измеряли поглощение (мутность) при 500 нм. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5.

Таблица 1. pН А (λ_{500 нм}) pН А (λ_{500 нм}) 2 0.1702 7 0.1170 3 0.1623 7.5 0.1168 4 0.1592 8 0.1171 5 0.1411 9 0.1150 5.5 0.1317 10 0.1121 6 0.1193 11 0.1102

Пример 2. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 35% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1.5:1.5:1.5.

Таблица 2. рН А (λ_{500 нм}) РН А (λ_{500 нм}) 2 0.2110 7 0.1523 3.5 0.2003 7.5 0.1512 4.5 0.1932 8 0.1509 5 0.1734 9.5 0.1493 5.5 0.1738 10 0.1496 6 0.1702 11 0.1498

Пример 3. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 50% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1:2:2.

Таблица 3. рH А (λ_{500 нм}) pН А (λ_{500 нм}) 2 0.2601 7 0.2421 3.5 0.2545 7.5 0.2437 4 0.2567 8.5 0.2408 5 0.2543 9 0.2396 5.5 0.2510 10 0.2398 6 0.2432 11 0.2379

Как видно из результатов (табл.1-3), при увеличении степени замещения карбоксильных групп полисахарида на остатки новокаина с 20% до 50% мол. оптическая плотность (мутность) растворов образцов пропорционально увеличивается и максимальное значение имеет при рН 2-5.5. При рН 6-11 значение оптической плотности практически не изменялось.

Водорастворимые конъюгаты ГК с новокаином, обладающие амфотерными свойствами, могут применяться в качестве биоматериала с репаративно-регенеративными свойствами в медицине, носителя для других молекул (как кислот, так и оснований по природе), а также в косметической продукции.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином структуры, как определено в формуле изобретения, с содержанием 20-50% остатков новокаина. Конъюгат растворим в воде, обладает амфотерными свойствами и не содержит побочных O-ацилизомочевин. 3 табл., 3 пр.

Конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином формулы

где n=20-50%, m=50-80%,
обладающий амфотерными свойствами.