СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КУЛЬТУРЫ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2008 года по МПК A61N2/04 A61N2/06 A61N5/67 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и предназначено для повышения чувствительности клеток культуры золотистого стафилококка (S.aureus) к химиотерапевтическим, в частности антибактериальным (АБ), препаратам при комплексном воздействии на культуру ряда физических факторов.

Известны способы угнетения роста метициллинустойчивого стафилококка (MRSA) в виде взвеси с применением дисульфированного фталоцианина алюминия и излучения диодного лазера с длиной волны 673 нм (Griffits М. // J. antimicrob. Chemother. - 1997. - Vol.40. - P.873-876), а также повышением эффективности проникновения АБ агентов внутрь клетки S.aureus, основанные на изменении электростатических свойств структуры ткани клеточной стенки (Тучин С.В., Панасенко В.И. Влияние электростатических свойств клеточной стенки стафилококка на поступление антибактериальных препаратов в клетку // Проблемы стафилококковой инфекции. Ч1. Научно-тематический сб., изд. Саратовского университета. 1979, С.19-21).

Согласно мембранной теории существует четкая корреляция между отрицательной пониженной (или повышенной) величиной суспензионного эффекта, в основе которого лежит потенциал Доннана, и поступлением положительно (или отрицательно) заряженного агента АБ препарата в фазу деления клеточной стенки S.aureus. Реализация оптимального суспензионного эффекта достигнута изменением количества АБ агента, попавшего в клетку, за счет управления величиной электростатического потенциала клеточной стенки S.aureus, являющейся "пограничной" структурой ее, непосредственно граничащей с внешней средой и первой встречающей АБ препараты. К недостаткам этого способа следует отнести сложность постоянной практической корректировки величины рН равновесных растворов среды, окружающих бактериальную клетку S.aureus, с целью изменения направления градиента потенциала Доннана для каждого конкретно примененного АБ препарата.

В качестве прототипа выбран форетический способ интенсификации трансмембранного ионного переноса агентов лекарственных АБ препаратов при помощи воздействия электромагнитной (ЭМ) энергии низкочастотных переменных магнитных полей, перемещающихся в пространстве в режиме реального времени (Райгородский Ю.М., Серянов Ю.В., Лепилин А.В. Форетические свойства физических полей и приборы для оптимальной физиотерапии в урологии, стоматологии и офтальмологии. Изд-во СТТУ, Саратов 2000, С.42-57). Такие поля более эффективно «обрабатывают» извилистые мембранные структуры клеток и дополнительно усиливают резонансные механоэлектрические эффекты ускорения трансмембранного ионного транспорта лекарственных веществ внутрь клетки. Перемещающееся в пространстве нестационарное переменное магнитное поле движется по круговой траектории скачкообразно путем последовательного переключения ЭМ излучателей (соленоидов), расположенных по окружности с частотой вращения поля, плавно изменяющейся в интервале 1,0-20 Гц. Каждый соленоид, кроме того, генерирует собственное переменное синусоидальное поле с частотой 50 Гц. Дополнительным параметром служит частота переключения соседних соленоидов - она равна произведению частоты поля (модуляции бегущего поля или пробега) на число соленоидов. Авторы теоретически и эмпирически показали, что при введении АБ препаратов в патологический очаг организма больного наиболее целесообразно использовать нестационарные переменные, перемещающиеся в пространстве поля с частотами пробега, определяемыми по индивидуальным показаниям реакции организма на физиотерапевтическую процедуру.

К недостаткам способа прототипа следует отнести незначительное повышение чувствительности бактериальных клеток культуры S.aureus к агентам лекарственных АБ препаратов под воздействием нестационарного переменного магнитного поля (НПеМП) (по результатам экспериментов повышение чувствительности клеток под воздействием НПеМП возрастает до 8% против 27% предложенного способа, см. Табл.1 на Фиг.1). По замечанию авторов не имеет особого смысла увеличивать значение параметра магнитной индукции из-за относительно слабой зависимости эффективности переноса АБ препаратов от увеличения индукции поля и ускоренного наступления фазы "магнитного угнетения" системных реакций организма. Насколько усиливаются биологические возможности клеток микроорганизмов воспринимать и преобразовывать энергию внешнего воздействия в виде теплового и светового излучения и, следовательно, расширяется возможность диссоциации лекарственных препаратов с образованием различных ионных форм, настолько возрастает способность последних к ускоренному трансмембранному переносу. Кроме того, несмотря на практическую "прозрачность" биологических объектов для нестационарного переменного магнитного поля, интенсивность последнего крайне быстро снижается по мере удаления источника от поверхности биообъекта (более 5 мм). Тем самым способ, сочетающий управление ионной проницаемостью естественных мембран клеточных микроорганизмов с повышением восприимчивости клетки к АБ препаратам, должен быть основан на оптимальном наборе воздействующих факторов.

Задача изобретения заключается в повышении чувствительности клеток культуры S.aureus к химиотерапевтическим препаратам, определенной унифицированными методами, (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Стандартизация и унификация метода определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам. Эпидемиологические методы изучения антибиотикорезистентности на популяционном уровне. С.-Пб., 1999) за счет комплексного воздействия на эти клетки ряда физических факторов.

Впервые предложен способ, в котором для усиления ионного трансмембранного переноса химиотерапевтических препаратов, использовано комплексное воздействие физических факторов: инфракрасного лазерного излучения (ИКЛИ) длиной волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050±10 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт; постоянного магнитного поля (ПМП) с величиной эффективной магнитной индукции 38+10% мТл и НПеМП с магнитной индукцией 32±5% мТл, частотой модуляции 10 Гц, частотой переменного поля 50 Гц, частотой коммутации 60 Гц, временем экспозиции 2 мин. Конструкция устройства, с помощью которого реализован вышеуказанный эффект, защищена патентом на полезную модель (Патент РФ №40593 U1, 2004).

Способ осуществлен следующим образом. Инфракрасное (ИК) лазерное излучение с длиной волны λ=0,89 нм оказывает на клетки культуры как тепловое, так и фотобиологическое действие (Рогаткин Д.А., Черный В.В. Низкоинтенсивная лазерная терапия. Взгляд физика на механизмы действия и опыт применения, www.Media-security.ru/bsff1/, 2001). Изменяя дискретную частоту повторения импульсов ИКЛИ (в пределах 80-3000 Гц), дифференцировали примененные АБ препараты на группы по степени угнетающего воздействия на клетки культуры S.aureus. Синергетическое влияние на них суперпозиции ЭМ полей и поля постоянного магнита осуществлено подбором оптимальной частоты модуляции нестационарных магнитных полей (НИМП, НПеМП) и величины эффективной напряженности ПМП, подобранной по значению максимального угнетающего эффекта АБ препарата путем изменения положения постоянного магнита по отношению к клеточной субстанции.

Под воздействием тепловой составляющей энергии спектра последовательности импульсов ИК излучения возникает температурный гистерезис диэлектрической проницаемости (ε) АБ препарата (определяющий величину трансмембранного электрического потенциала, играющего основополагающую роль в процессах дыхания и фосфорилирования), характеризующийся частотной зависимостью ω в диапазоне 1-10 кГц (Андреев B.C., Печорина Т.А., Попов В.Г. Термочувствительность микроорганизмов и температурная зависимость электрических свойств их оболочечных структур // Биофизика. Т.35. Вып.1, 1990, С.97-101). Эффект гистерезиса обусловлен фосфолипидными компонентами клеточных мембран, обладающих, в свою очередь, сегнетоэлектрическими свойствами (наличием спонтанно поляризованных кооперативных подсистем доменов и возникновением токов деполяризации при рассеянии тепловой энергии в клетках культуры). Под влиянием ПМП происходит упорядочивание доменной структуры за счет ориентационных эффектов этих магнитно-активных компонентов (Боголюбов В.М., Зубкова С.М. Пути оптимизации параметров физиотерапевтических воздействий // Вопросы курортологии и физиотерапии, 1998. №2. С.3-6; Зубкова С.М. с соавт. Комбинированное действие инфракрасного излучения, постоянного и переменного магнитных полей при экспериментальном атеросклерозе // Вопросы курортологии и физиотерапии. 1998. №4. С.31-36). При низких (80-3000 Гц) частотах повторения импульсов ИКЛИ деполяризация цитоплазматических мембран клеток сопровождается диффузным перемещением ионов АБ препаратов (Немцев И.З., Лапшин В.П. О механизме действия низкоинтенсивного лазерного излучения. // Вопросы курортологии и физиотерапии, 1997, №1, С.22-24), под действием которых происходят определенные морфологические изменения субмикроскопической структуры клеток S.aureus, а именно: истончение клеточных стенок; исчезновение из них внутреннего электронно-плотного слоя, граничащего с цитоплазматической мембраной; появление аномальных перегородок и перестройки внутрицитоплазматических мембранных структур (Кац Л.Н., Мороз А.Ф., Вайтрауб Э.А. Об изменении ультраструктуры стафилококка под действием антибиотиков пенициллиновой группы и 6-аминопенициллановой кислоты // Микробиология. Т.XXXVII, Вып.1. С.95-99. 1968). Кроме того, под воздействием определенных параметров физических факторов (раздражителей), в клетках S.aureus в такт с частотой вынуждающих колебаний этих раздражителей или кратных ей, начинают функционировать трубчатые мембранные структуры - своеобразные «насосы», выполняющие, с одной стороны, выделительные функции, с другой - становящиеся дополнительными проводящими АБ препараты внутрь клетки путями.

Для оценки эффективности влияния физических факторов (НИМП, НПеМП, ПМП, ИКЛИ) на угнетение роста клеток культуры S.aureus, ввели коэффициент чувствительности «η» (в %). В таблице 1 представлено влияние физических факторов на клетки культуры S.aureus, в которой приведены результаты зависимости коэффициента «η» от параметров физических факторов (НИМП, НПеМП, ПМП, ИКЛИ) при раздельном, комбинационном и комплексном их воздействии на клетки культуры S.aureus, причем в графах «НИМП» и «НПеМП» приведены данные воздействия физического фактора на клетки культуры S.aureus по способу прототипа.

Результаты исследования показали (Табл.1), что НИМП вместо угнетающего действия оказало эффект активизации роста клеток культуры S.aureus («η» имеет отрицательный знак), поэтому в дальнейших экспериментах по исследованию раздельного и комплексного влияния физических факторов на культуру S.aureus оно не использовалось и во внимание принимались только результаты, полученные при воздействии НПеМП, ПМП и ИКЛИ.

Подбор величин параметров НПеМП (по способу прототипа) провели по результатам воздействия его на клетки S.aureus, оцененного при помощи метода подсчета выросших колоний:

Максимальная величина мгновенного амплитудного значения магнитной индукции на поверхности источника в зоне генерирующего излучателя (соленоида)33±10% мТлЧастота модуляции10 ГцЧастота изменения поля каждого излучателя источника50 ГцЧастота коммутации излучателей60 ГцВремя экспозиции2 минРасстояние источника НПеМП от раневой поверхности5 мм

Максимальная импульсная мощность ИКЛИ - 4 Вт, величина эффективной магнитной индукции ПМП, расположенного на расстоянии 60 мм от поверхности дна чашки Петри с культурой S.aureus на плотной питательной среде (АГВ) и стандартными дисками с АБ препаратами, - 38±10% мТл (принимался во внимание максимальный диаметр зоны угнетения роста для каждого АБ препарата и соответствующая этому диаметру максимальная величина индукции МП, измеренная в зоне диска датчиками Холла), причем источник ПМП ориентирован северным магнитным полюсом в направлении распространения лазерного излучения.

Чувствительность клеток культуры S.aureus определили дискодиффузионным методом с АБ препаратами, применяемыми при лечении гнойных осложнений ран стафилококковой этиологии. Соотношение размеров контрольной (полученной при воздействии на штамм S.aureus только соответствующего АБ препарата) и экспериментальной (того же штамма и АБ препарата, подвергнутых комплексному воздействию физических факторов - ИКЛИ с определенной частотой следования импульсов, НПеМП и ПМП) зон угнетения роста, позволило сделать вывод о количественном повышении чувствительности культуры к АБ препаратам.

Для большей убедительности комплексному магнитолазерному воздействию была подвергнута группа штаммов «умеренно чувствительной» категории, поскольку получить увеличение степени угнетения роста за счет комплексного воздействия физических факторов на уровнях влияния АБ препаратов категории «чувствительных» к ним штаммов, как и в группе, содержащей заведомо «полирезистентные» штаммы не представляло, по нашему мнению, практической ценности.

Доказательством правильности выбора параметров комплексного воздействия физических факторов и АБ препаратов на культуру S.aureus служат данные, приведенные в Табл. 2. Комплексное влияние физических факторов и АБ препаратов на клетки культуры S.aureus). В нее внесены: номера 14 штаммов «умеренно чувствительной» категории (по отношению к примененным АБ препаратам) с величиной резистентности «R» в %, коды АБ препаратов, значения оптимальных частот (f_опт) следования импульсов ИКЛИ, на которых получен максимальный эффект угнетения роста штаммов культуры бактерий S.aureus, значения степени угнетения для каждого штамма по каждому АБ препарату (в %).

Примеры конкретного применения.

Пример 1: Штамм S.aureus, (№2) выделенный из изолята гнойного содержимого инфильтрата в правой щечной и поднижнечелюстной областях больного Б., 28 лет. АБ - азлоциллин, диаметр зоны угнетения роста на контроле - 21 мм. Эксперимент: ИКЛИ - длина волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1040 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт; магнитная индукция НПеМП - 32±5% мТл; частота модуляции - 10 Гц; частота переменного поля - 50 Гц; частота коммутации - 60 Гц; время экспозиции - 2 мин; магнитная индукция ПМП - 42±5% мТл. Диаметр зоны угнетения роста штаммов культуры - 24,6 мм.

Результат: повышение чувствительности культуры S.aureus к азлоциллину под воздействием комплекса физических факторов (ИКЛИ, НПеМП, ПМП) возросло на 27,78%. Численные значения всех результатов получены как среднее из 5-кратно повторенного эксперимента.

Пример 2. Штамм S.aureus (№6), выделенный из изолята гнойного содержания флегмоны щечной области и подчелюстного пространства слева больной Д., 45 лет. АБ - цефамандол, диаметр зоны угнетения роста на контроле - 19 мм. Эксперимент: ИКЛИ - длина волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт; магнитная индукция НПеМП - 32±5% мТл; частота модуляции - 10 Гц; частота переменного поля - 50 Гц; частота коммутации - 60 Гц; время экспозиции - 2 мин; магнитная индукция ПМП - 42±5% мТл.

Диаметр зоны угнетения роста штаммов культуры - 24 мм.

Результат: повышение чувствительности культуры S.aureus к цефамандолу под воздействием комплекса физических факторов (ИКЛИ, НПеМП, ПМП) возросло на 24,2%.

Пример 3. Штамм S.aureus (№9), выделенный из изолята гнойного содержания воспалительного инфильтрата, локализованного в околоушно-жевательной области справа больного К., 56 лет. АБ - доксициклин, диаметр зоны угнетения роста на контроле - 17 мм. Эксперимент: ИКЛИ - длина волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт; магнитная индукция НПеМП - 32±5% мТл; частота модуляции - 10 Гц; частота переменного поля - 50 Гц; частота коммутации - 60 Гц; время экспозиции - 2 мин; магнитная индукция ПМП - 42±5% мТл.

Диаметр зоны угнетения роста штаммов культуры - 23, 6 мм.

Результат: повышение чувствительности культуры S.aureus к доксициклину под воздействием комплекса физических факторов (ИКЛИ, НПеМП, ПМП) возросло на 24,4%.

Как видно из вышеприведенных примеров, оптимальные параметры физических факторов, при которых получены максимальные значения диаметра зон угнетения роста штаммов S.aureus следующие: длина волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050±10 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт; магнитная индукция НПеМП - 32±5% мТл, частота модуляции - 10 Гц, частота переменного поля - 50 Гц, частота коммутации - 60 Гц, время экспозиции - 2 мин; магнитная индукция ПМП - 42±5% мТл.

Применение комплексного ЭМ воздействия оптимальной суперпозиции лазерного излучения ИК диапазона длин волн, стационарных и нестационарных магнитных полей с определенными параметрами, позволил увеличить активность транспорта ионов АБ препаратов как через клеточную стенку, так и через мембранные структуры клетки S.aureus, а сам способ повышения восприимчивости культуры к АБ препаратам может быть использован в клинической практике рациональной химиотерапии в качестве способа, снижающего длительность введения больному АБ препаратов и уменьшения общетерапевтической лечебной дозы, подобранной индивидуально.

Таблица 1.
Влияние физических факторов на клетки культуры S.aureus.Физ. факторыη в %НИМП0,5 Гц-12,01,0 Гц-11,410 Гц-5,020 Гц-3,0НПеМП 0,5 Гц-1,0 Гц8,610 Гц9,820 Гц4,8НПеМП, ПМП (35 мТл) 0,5 Гц4,31,0 Гц9,010 Гц15,8620 Гц6,9НПеМП, ПМП (65 мТл) 0,5 Гц6,41,0 Гц12,010 Гц17,820 Гц8,4ИКЛИ 80 Гц5,0150 Гц4,7300 Гц15,0600 Гц17,41050 Гц33,21500 Гц15,33000 Гц14,7ИКЛИ, НПеМП, ПМП (65 мТ) 80 Гц9,0150 Гц6,6300 Гц22,3600 Гц34,61050 Гц55,21500 Гц27,43000 Гц20,0

Табл. 2.
Комплексное влияние физических факторов и АБ препаратов на клетки культуры S. aureus.№ п/пR (%)Код АБf_опт Гц% угн. S.aureus№ п/пR (%)Код АБf_опт Гц% угн. S.aureus113,1AMP95617,02826,1CAN103518,10  CAR105520,26  LIN95613,75       RYS92616,53       CML92616,04       ERY102016,23226,1AZL104027,7898,7AMP107214,92  CHL84017,27  DOC105024,40  NEO84026,46  CHL133518,08  RYS89725,14  CML133516,76  FTH95619,29  FIX133523,20321,8DOX81014,401030,4AZL110217,67  KAN92616,44  CAR122018,08  KEF104524,41  FTX95614,94  FTH81021,32  CAZ102019,60430,4OLE103023,20118,7AZL104522,13  KEF89715,21  CAR122016,04  CML92616,76  FIX110216,61  FIX89716,13  ERY107215,13530,4DOX104019,901217,4AMP103518,11  LIN89715,46  RYS89717,65  TET81017,36  TET107016,04  CML92616,22       CAZ89716,73     630,4GEN106023,921321,7FIX107017,19  DOX95614,40  CAZ103517,89  OLE160023,75  ERY107013,64  TET128017,02       CFZ140020,54       FIX95615,96       CAZ105024,20     717,4CAR102018,981430,4GEN95617,89  CAZ133517,59  CAN95618,38       NEO106018,91       RYS95617,07       STR110217,19       FTX95614,87

Изобретение относится к экспериментальной медицине и предназначено для повышения чувствительности клеток культуры золотистого стафилококка к химиотерапевтическим препаратам. Воздействуют на культуру нестационарным переменным магнитным полем с помощью излучателей переменного магнитного поля с параметрами - магнитной индукцией 32±5% мТл, частотой модуляции 10 Гц, частотой переменного поля 50 Гц, частотой коммутации излучателей 60 Гц, временем экспозиции 2 мин. Также воздействуют инфракрасным лазерным излучением длиной волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050±10 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт и постоянным магнитным полем с величиной индукции 42±5% мТл. Предлагаемый способ позволяет увеличить активность транспорта ионов антибактериальных препаратов, как через клеточную стенку, так и через мембранные структуры клетки S.aureus. 2 табл.

Способ повышения чувствительности клеток культуры золотистого стафилококка к химиотерапевтическим препаратам путем воздействия на культуру нестационарным переменным магнитным полем с помощью излучателей переменного магнитного поля, инфракрасным лазерным излучением и постоянным магнитным полем, отличающийся тем, что воздействуют: нестационарным переменным магнитным полем с параметрами - магнитной индукцией 32±5% мТл, частотой модуляции 10 Гц, частотой переменного поля 50 Гц, частотой коммутации излучателей 60 Гц, временем экспозиции 2 мин, инфракрасным лазерным излучением длиной волны 890 нм с частотой последовательности импульсов 1050±10 Гц, максимальной импульсной мощностью 4 Вт и постоянным магнитным полем с величиной индукции 42±5% мТл.