СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА - T98G В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2020 года по МПК A61N5/00 

Описание патента на изобретение RU2719646C1

Способ относится к экспериментальной онкологии и может быть использован для подавления роста культуры клеток глиобластомы человека - T98G в эксперименте.

Изобретение основано на развитии открытия СССР, диплом №158 от 23.05.75 г. (см. Л.X. Гаркави, М.А. Уколова, Е.Б. Квакина. «Закономерность развития качественно отличающихся общих неспецифических адаптационных реакций организма» (режим доступа: http://ross-nauka.narod.ru/03/03-158.html), в котором, в зависимости от параметров воздействия магнитного поля, установлены различные изменения, происходящие на клеточном, органном и системном уровнях.

В мире за последнее десятилетие ежегодно отмечается рост заболеваемости злокачественными глиальными опухолями. За 2018 год в Российской Федерации впервые выявлено около 32100 больных с первичными опухолями центральной нервной системы, из них глиобластомы составили 15,6% (см. Первичные опухоли центральной нервной системы. Клинические рекомендации министерства здравоохранения Российской Федерации 2018. Режим доступа: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/853).

Расширение возможностей подавления роста клеток злокачественных глиом путем привлечения вспомогательных физических факторов волновой природы, к которым относятся электромагнитные воздействия, представляют актуальную проблему экспериментальной онкологии.

Сегодня в мире, благодаря новым техническим возможностям, активно изучается и применяется новая технология - импульсная магнитотерапия (ИМТ).

Эта технология положительно зарекомендовала себя в неврологической практике при лечении больных с рассеянным склерозом. По имеющимся литературным данным, опыт применения ее в онкологии не велик, а для лечения больных со злокачественными глиальными опухолями головного мозга - вообще отсутствует. В разных странах, в экспериментах активно изучаются режимы с разными значениями параметров индукции, частоты и времени импульсного магнитного поля для выявления противоопухолевого эффекта и перспективы последующей интеграции в состав комплексного лечения больных злокачественными глиальными опухолями головного мозга.

В США так же проводится работа по изучению ИМП. Примером служит работа 2018 года «Specifically Targeted Electromagnetic Fields Arrest Proliferation of GlioblastomaMultiforme U-87 Cells in Culture» (см. CARMEN J. NARVAEZ et al., Anticancer Res. 2018 Jun; 38(6):3255-3266.doi: 10.21873/anticanres. 12590).

Сущность исследования состояла в том, что авторы проводили воздействие ИМП на культуру клеток глиобластомы U-87 в течение 54 часов, для этого использовали систему, получившую название ResonanceGeneratingFields ™ (RGFIELDS ™), которая может быть адаптирована для отдельных опухолей. Цель исследования состояла в том, чтобы определить, оказывает ли новое неинвазивное неионизирующее излучение ингибирующий эффект на пролиферацию мультиформных клеток глиобластомы.

Авторам удалось добиться противоопухолевого эффекта ИМП, достоверного снижения числа клеток культуры на 40% по сравнению с неэкспонированными контрольными клетками. Это явилось убедительным подтверждением доступности ИМП к механизмам опухолевого роста.

Следует указать, что авторы проводили только монофакторное исследование без вариации параметров воздействий ИМП и без сочетания с ионизирующим излучением, которое является обязательным компонентом лечения злокачественных глиальных опухолей головного мозга.

При этом в рассматриваемой работе длительность непрерывного воздействия ИМП составила более 2-х суток, а именно 54 часа, в то время как, в предлагаемом нами изобретении длительность воздействия ИМП составляет 7 минут - времени, достаточного для проявления ингибирующего влияние на клетки, как в самостоятельном, так и сочетанном с ионизирующим излучением вариантах.

Из патентных источников известен способ «Неинвазивный способ подавления роста опухолевых тканей и их омертвления» (см. патент RU 2665621 С2, опубл. 03.09.2018 г., Бюл. 25), сущность которого состоит в воздействии на ДНК клеток опухоли нетепловым сверхвысокочастотным электромагнитным полем, частота которого совпадает с собственной частотой крутильных колебаний ДНК.

Авторами подробно изложена методика расчета параметров применяемого магнитного поля: 1) используется нетепловой уровень плотности потока мощности электромагнитного поля, равной 0,2 мВт/см2; 2) частоту выбирают равной собственной частоте крутильных колебаний спиралей ДНК клеток опухоли, которую вычисляют по формуле: ƒ=k⋅N-1/2, где k=2,175×1013 Гц, N - число пар нуклеотидов ДНК клетки опухоли, при этом облучение проводят в течение 6Vd-l, где Vd=(К-Ко)/(КоΔt), где Ко - начальное число клеток опухоли, К - конечное, Δt - отрезок времени между двумя измерениями.

Авторы полагают, что приемлемое время экспозиции должно составлять не менее 4-5 часов поскольку «клетки опухоли, в отличие от других клеток, делятся крайне быстро (высокий коэффициент пролиферации), в то время как в предлагаемом нами способе эффективное разовое воздействие длится не более 7 минут. При всей оригинальности подхода авторы утверждают, что сверхвысокочастотное электромагнитное поле по методике с такой экспозицией будет губительным для опухоли, но, при этом, абсолютно безвредным для окружающих органов и тканей, однако доказательства этого отсутствуют, т.к. эксперименты In VIVO не проводились.

Таким образом, проведенный анализ работ в доступной отечественной и зарубежной литературе показал верность выбора ИМП, как фактора, подавляющего жизнеспособность культуральной формы злокачественной глиомы человека, при этом поиск эффективного воздействия ведется только с использованием режимов высоких частот и большой экспозиции. Это позволяет прийти к заключению об отсутствии достоверных данных о подавлении роста культуры клеток глиобластомы человека с помощью кратковременного низкоинтенсивного низкочастотного импульсного магнитного поля. Кроме того, в настоящее время остаются не разработанными способы подавления роста культуры клеток глиобластомы человека при помощи сочетания ионизирующего излучения и ИМП, что может соответствовать потребностям и перспективам трансляционной медицины.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение летальности и снижение митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте путем сочетанного воздействия ионизирующего излучения и ИМП.

Технический результат достигается тем, что культуру клеток глиобластомы человека T98G подвергают последовательному воздействию сначала ионизирующего излучения в дозе 10 Гр с использованием аппарата TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, затем воздействию импульсного магнитного поля с использованием последовательности режимов частот, близких к эндогенным частотам головного мозга, при этом воздействие импульсного магнитного поля проводят при помощи аппарата «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при В=15 мТл, сразу после этих воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% СО2, 37°С и 95% влажности, анализ результатов проводят через двадцать четыре часа после воздействия.

Изобретение «Способ подавления роста культуры клеток глиобластомы человека T98G в эксперименте» является новым, так как сочетание применения импульсного магнитного поля в режимах частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при параметре индукции - 15 мТл с ионизирующим излучением 10 Гр позволяет достичь повышения летальности и снижение митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в экспериментальной онкологии, в научно-исследовательских онкологических институтах, в экспериментальных и клинических исследованиях возможностей сочетанного применения ИМП в определенных режимах и ионизирующего излучения для повышения летальности и снижения митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.

Способ подавления роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте осуществляется следующим образом.

Культуру клеток глиобластомы T98G из коллекции КККП ИНЦ РАН засевают в шесть планшетов фирмы Biofil так, чтобы в каждой лунке планшета число клеток составляло не менее 800000 клеток на 3 мл питательной среды, затем инкубируют (в мультигазовом инкубаторе СВ 150 («Binder», Германия) в условиях контролируемых 5% CO2, 37°С и 95% влажности) в течение 24 часов до достижения конфлюэнтности выше 70%. После этого проводится ионизирующее излучение на аппарате TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, где в качестве источника излучения использовался кобальт-60, при этом доза излучения для каждой лунки составляет 10 Гр. Затем проводится воздействие ИМП с учетом принципов активационной электромагнитотерапии в режимах частот, близких к эндогенным ритмам мозга (см. Атмачиди Д.П. Адъювантная химиолучевая терапия с применением магнитного поля в комплексном лечении злокачественных глиальных опухолей головного мозга. Автореф. дис... кандид. мед.наук. Ростов-на-Дону, 2009.; см. Жукова Г.В., Шихлярова А.И., Солдатов А.В., Бартенева Т.А., Петросян В.И., Гудцкова Т.Н., Брагина М.И., Положенцев О.Е., Шейко Е.А., Мащенко Н.М., Ширнина Е.А., Златник Е.Ю., Куркина Т.А. Некоторые подходы к активизации механизмов противоопухолевой резистентности и функциональные аналоги категорий синергетики. Биофизика. 2016;61(2):303-315.). Процедура выполняется на аппарате «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при параметре индукции - 15 мТл. Всего в эксперименте используется шесть планшетов. Один планшет подвергается монофакторному воздействию ионизирующего излучения, два планшета - ИМП в двух режимах и два планшета - последовательному сочетанию этих воздействий. Контрольным служит планшет, который не подвергается воздействию вышеуказанных физических факторов (см. 1 табл.).

После воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% CO2, 37°С и 95% влажности. Анализ результатов проводится в двух контрольных временных точках: через три и через двадцать четыре часа. Для снятия клеток с подложки используется раствор DPBS и раствор Трипсин Версена в соотношении 1:1. Подсчет общего количества клеток, а так же количества живых и мертвых клеток проводится в клеточном анализаторе JuLiFLNanoEntek с использованием 0,4% раствора красителя трипанового синего в соотношении 1:1. Летальность определяется по процентному соотношению числа мертвых клеток к общему количеству клеток. Митотический индекс определяется в десяти полях зрения по процентному соотношению числа делящихся клеток к общему количеству клеток при помощи микроскопа Leica DMIL LED Fluo. Полученные данные обрабатываются на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ «Statistica 10.0» с вычислением критерия достоверности Стьюдента (t). Статистически значимым считается различие с вероятностью безошибочного прогноза не менее 95%, т.е. р<0,05.

При сравнении показателей летальности между исследуемыми группами было установлено, что через 3 часа минимальный процент гибели культуры клеток глиобластомы отмечался в контрольной группе. Напротив, максимальный уровень мертвых клеток был зафиксирован в образцах культуры T98G после воздействия ионизирующего излучения (18,7% против 5,2% в контроле, р≤0,05). После сочетания ионизирующего излучения с ИМП с индукцией в 15 мТл результаты были сопоставимы с лучевым воздействием, а при индукции 300 мТл - на 20% ниже. При этом разница с контрольными данными была существенной, и наблюдаемое увеличение летальности клеток культуры T98G в 2,9 раза свидетельствовало о выраженном ингибирующем влиянии используемых факторов.

Применение ИМП в монорежиме (без лучевого воздействия) в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее=7 мин с разной индукцией в 15 или 300 мТл характеризовалось самостоятельным противоопухолевым действием, а именно, увеличением показателей летальности клеток глиобластомы соответственно в 2,5-2,8 раза выше по сравнению с контролем (Табл. 2).

Через 24 часа наблюдения показатели в контрольной группе оставались на низком уровне летальности при наивысших значениях митотического индекса клеток культуры T98G. Высокую эффективность проявило сочетание ионизирующего излучения в дозе 10 Грей и ИМП с индукцией 15 мТл. Наиболее глубокое подавление митотической активности глиальных клеток T98G наблюдалось при воздействии в монорежиме ИМП с индукцией 15 мТл: митотический индекс клеток глиобластомы по сравнению с контролем, снизился в 4,7 раза, а летальность увеличилась в 2,3 раза (Табл. 3).

Таким образом, полученные экспериментальные данные по достоверному повышению летальности и снижению митотического индекса в культуре клеток злокачественной глиомы человека T98G, свидетельствуют о высокой значимости сочетанного воздействия факторов специфической и неспецифической природы: ионизирующего излучения и ИМП, оказывающими ингибирующее влияние на клетки опухоли мозга. Кроме того, при использовании ИМП в монофакторном режиме были установлены достоверные различия с контролем: влияние ИМП убедительно демонстрировало эффекты повышения летальности и снижения митотического индекса злокачественных клеток культуры T98G. Вместе с тем, было обнаружено различие в эффективности разных режимов интенсивности при одинаковом поличастотном алгоритме ИМП, свидетельствующее о предпочтительном использовании «малых доз» воздействия в соответствии с принципом нелинейности в реакциях живых клеточных систем.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет достичь подавления жизнеспособности клеток глиобластомы человека за счет повышения летальности и снижения митотического индекса роста культуры клеток глиобластомы человека в эксперименте.

Похожие патенты RU2719646C1

название год авторы номер документа
Способ лечения злокачественных глиом головного мозга 2020
  • Кит Олег Иванович
  • Попов Иван Александрович
  • Шихлярова Алла Ивановна
  • Росторгуев Эдуард Евгеньевич
  • Атмачиди Дмитрий Панаетович
  • Франциянц Елена Михайловна
  • Иозефи Дмитрий Ярославич
  • Арапова Юлия Юрьевна
  • Протасова Татьяна Пантелеевна
  • Жукова Галина Витальевна
RU2746903C1
Способ импульсного электромагнитного воздействия на клеточные культуры в медицинских или биологических целях 2017
  • Глущенков Владимир Александрович
  • Беляева Ирина Александровна
RU2676846C2
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ КОМБИНАЦИЙ КАННАБИНОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ 2009
  • Веласко Диес Гильермо
  • Гусман Пастор Мануэль
  • Лоренте Мар
  • Торрес София
  • Родригес Фатима
RU2546284C2
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЛЕГКИХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 2009
  • Сидоренко Юрий Сергеевич
  • Шихлярова Алла Ивановна
  • Комарова Екатерина Федоровна
  • Барсукова Людмила Петровна
  • Марьяновская Галина Яковлевна
  • Леонтьева Дарья Викторовна
  • Шейко Елена Александровна
  • Куркина Татьяна Анатольевна
  • Коробейникова Елена Петровна
  • Протасова Татьяна Пантелеевна
RU2405595C2
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК 2006
  • Литвяков Николай Васильевич
  • Ростов Владислав Владимирович
  • Булдаков Михаил Александрович
  • Чердынцева Надежда Викторовна
  • Большаков Михаил Алексеевич
  • Афанасьев Константин Вадимович
  • Кутенков Олег Петрович
RU2326707C1
Способ подавления роста опухолей глиального происхождения 2019
  • Троицкий Сергей Юрьевич
  • Завьялов Евгений Леонидович
  • Разумов Иван Алексеевич
RU2709215C1
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ФУНКЦИЙ И РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ 2008
  • Донник Ирина Михайловна
  • Волобуев Андрей Петрович
  • Усков Евгений Дмитриевич
RU2376043C1
Производные имидазолидин-2,4-диона и имидазолидин-2,4,5-триона на основе смоляных кислот, проявляющие антиинвазивную активность в отношении клеток глиобластомы линий T98G и SNB-19 2023
  • Чересиз Сергей Владимирович
  • Ковалева Ксения Сергеевна
  • Яровая Ольга Ивановна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Покровский Андрей Георгиевич
RU2821104C1
НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ И ИХ ОМЕРТВЛЕНИЯ 2016
  • Ихлов Борис Лазаревич
RU2665621C2
Способ получения ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов 2021
  • Кит Олег Иванович
  • Максимов Алексей Юрьевич
  • Росторгуев Эдуард Евгеньевич
  • Гончарова Анна Сергеевна
  • Непомнящая Евгения Марковна
  • Заикина Екатерина Владиславовна
  • Лукбанова Екатерина Алексеевна
  • Волкова Анастасия Владимировна
  • Миндарь Мария Вадимовна
  • Ходакова Дарья Владиславовна
  • Курбанова Луиза Зулкаидовна
RU2761892C1

Реферат патента 2020 года СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА - T98G В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к нейроонкологии, и может быть использовано в дальнейшем для повышения неспецифической противоопухолевой резистентности и достижения выраженного противоопухолевого эффекта на этапах комплексного лечения больных со злокачественными новообразованиями головного мозга. Для этого культуру клеток глиобластомы человека T98G подвергают последовательному воздействию сначала ионизирующего излучения в дозе 10 Гр с использованием аппарата TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, затем воздействию импульсного магнитного поля с использованием последовательности режимов частот, близких к эндогенным частотам головного мозга. При этом воздействие импульсного магнитного поля проводят при помощи аппарата «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при В=15 мТл. Сразу после этих воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% СО2, 37°С и 95% влажности. Анализ результатов проводят через двадцать четыре часа после воздействия. Способ обеспечивает снижение митотической активности клеток и, одновременно, увеличение летальности в культуре глиобластомы T98G, относительно контроля, как за счет локального воздействия импульсного магнитного поля, так и при сочетании с ионизирующем излучением. 3 табл.

Формула изобретения RU 2 719 646 C1

Способ подавления роста культуры клеток глиобластомы человека - T98G в эксперименте, включающий воздействие импульсного магнитного поля на культуру клеток глиобластомы, отличающийся тем, что культуру клеток глиобластомы человека T98G подвергают последовательному воздействию сначала ионизирующего излучения в дозе 10 Гр с использованием аппарата TheratronEquinox фирмы BestTheratronics, затем воздействию импульсного магнитного поля с использованием последовательности режимов частот, близких к эндогенным частотам головного мозга, при этом воздействие импульсного магнитного поля проводят при помощи аппарата «Нейро-МС/Д терапевтический расширенный» компании «Нейрософт» в режиме частот F=0,3 Гц (t=5 мин), F=3 Гц (t=1 мин), F=9 Гц (t=1 мин), t общее = 7 мин при В=15 мТл, сразу после этих воздействий культуру помещают в мультигазовый инкубатор СВ 150 с контролируемыми условиями - 5% СО2, 37°С и 95% влажности, анализ результатов проводят через двадцать четыре часа после воздействия.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2719646C1

Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
РЫБАКОВА Ю.С
и др
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Биомедицинская химия
Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса 1924
  • Шапошников Н.П.
SU2015A1
YE F et al
Anticancer activity of Scutellaria

RU 2 719 646 C1

Авторы

Кит Олег Иванович

Росторгуев Эдуард Евгеньевич

Шихлярова Алла Ивановна

Попов Иван Александрович

Тимошкина Наталья Николаевна

Потемкин Дмитрий Сергеевич

Гончарова Анна Сергеевна

Жукова Галина Витальевна

Гусарева Марина Александровна

Стасов Виталий Викторович

Даты

2020-04-21Публикация

2019-05-06Подача