СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕОАДЪЮВАНТНОГО ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ КОЖИ Российский патент 2008 года по МПК A61B10/00 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения эффективности неоадъювантной паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией меланомы кожи.

Известно, что клиническая, а в ряде случаев и гистологическая диагностика бывает крайне трудной, т.к. симптоматика и морфологическое строение меланом кожи чрезвычайно вариабельны. Меланомы характеризуются выраженным клеточным и структурным полиморфизмом. Кроме того, многообразие форм и вариабельность клинического течения позволяют отнести ее к опухолям с прогностически неблагоприятным течением. Морфологическая диагностика меланом кожи и ее метастазов обусловлена нарастающей анаплазией опухолевых клеток и потерей специфических черт гистологической принадлежности. Изучение морфологических особенностей, наступающих под действием различных неоадъювантных методов введения химиопрепаратов на аутосредах, может послужить оценкой эффективности лечения таких воздействием

Во всех наблюдениях злокачественных меланом в фазе радиального роста с соединительной ткани под эпидермисом обнаруживалась лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация, более выраженная при наличии опухолевых клеток в дерме.

Известно, что превращение нормальной клетки в опухолевую происходит в результате накопления совокупности ряда мутаций в генетическом аппарате, ведущих к нарушению механизмов, контролирующих размножение и рост клетки. Ген bcl-2 предотвращает программированную гибель клеток.

Предположительно экспрессия bcl-2 допускает и другие мутации, после чего появляются протоонкогены и канцеросупрессорные гены. Полагают, что во многих случаях апоптоз происходит в результате летальных повреждений, вызванных реактивной активностью кислорода, а bcl-2 тормозит апоптоз с помощью регуляции антиоксидантной системы.

Считается, что уровень bcl-2 в клетке может регулироваться внутриклеточными протеазами, активность которых определяет количество bcl-2, и соответственно - выбор клеткой жизни и смерти. Сверхэкспрессия белка bcl-2 ингибирует проницаемость митохондрий, в то время как сверхэкспрессия белка Вах индуцирует ее.

Известно, что тип роста опухолевой массы представляет очень важную информацию для определения онкологической сущности опухоли и ее агрессивности. В таких случаях показатель пролиферативной активности ее является одним из решающих факторов, учитываемых при выборе тактики лечения (см. Шацева Т.А., Мухина М.С.Антиген Ki-67 в оценке опухолевой пролиферации. Его структура и функция. - Вопросы онкологии. - 2004, №2, С.157-164). Переход клетки в состояние покоя должен сопровождаться разрушением или такими структурными изменениями белка, в результате которых он теряет активность и его выявление становиться невозможным. Оптимальным маркером пролиферации в этом случае считают антиген Ki-67, который присутствует в клетке практически во всех фазах митотического цикла и исчезает при переходе в период покоя, отсутствует во время репарации ДНК. Антитела к Ki-67 применяют для оценки пролиферативной активности многих новообразований: злокачественных лимфом, опухолей молочной, предстательной, поджелудочной желез, легких, гипофиза, толстой кишки. По отношению числа опухолевых Ki-67-положительных клеток к общему их количеству рассчитывается индекс пролиферативной активности Ki-67. Обнаружена связь между значениями индекса Ki-67 и степенью гистологической дифференцировки опухоли и клиническим прогнозом при раке эндометрия, яичника, легкого, мочевого пузыря, опухолей нервной системы. Показано, что индекс Ki-67 является независимым показателем при прогнозировании рецидивов и длительности жизни у больных раком молочной и предстательной желез. Антиген Ki-67 может быть успешно использован как в оценке пролиферативной активности новообразований, так и в изучении механизмов канцерогенеза. Однако не известно применение антигена Ki-67 для оценки пролиферативной активности меланом кожи, прогнозирования эффективности лечения и прогнозирования длительности жизни больных меланомой кожи.

Известен «Способ определения эффективности и токсичности химиоиммунотерапии больных диссеминированной меланомой кожи» (см. Моисеенко В.М., Орлова Р.В., Семенова А.И., Проценко С.А., Ермакова Н.А., Михайличенко Т.Д., Сердюк О.П. Матер. III ежегодной Росс. конф. СПб, 199, С.191), выбранный нами в качестве прототипа. Комбинированной химиоиммунотерапии подвергались 13 больных с морфологически верифицированным диагнозом меланомы кожи в возрасте от 25 до 65 лет, имеющих диссеминированную форму заболевания с преимущественной локализацией метастазов в лимфатических узлах (92,3%), коже и подкожной клетчатке (84,6%), висцеральных органах/легких (84,6%) и печени (46,1%). 77% больных ранее подвергались лечению, 80% из них по поводу метастатической формы заболевания (в т.ч. 20% больным проведено не менее одной линии паллиативной химиотерапии). Схема лечения включает следующие препараты в традиционных дозах: дакарбазин по 200 мг/м² в/в, в Д2-6; блеомицин по 15 мг в/в в Д3; винкристин 1 мг/м² в/в в Д2, цисплатин по 20 мг/м² в/в в Д2-5; Ронколейкин^® по 18 млн ЕД в/в в Д1, 3, 5, 7, 9; Реаферон по 6 млн ЕД в Д2, 4, 6, 8 в/м; с интервалом между циклами 3-4 недели; 4-6 циклов.

Оценка эффекта и токсичности проводилась по стандартным критериям ВОЗ. Частичный регресс достигнут в 30,8% случаев, полных регрессов отмечено не было. Стабилизация метастатического процесса зарегистрирована у 7,6% больных. Средняя продолжительность частичного регресса составляла 32 недели, стабилизация - 15,5 недель. У 61,6% отмечено прогрессирование заболевания. Время до прогрессирования составило в среднем 8,6 недель. Наблюдались осложнения 1-2 степени, лихорадка 100%, астения 82,7%, тошнота и рвота (68,9%). В 17,2% случаев отмечена нейтропения 3 степени, у 6,9% больных лечение осложнилось алопецией 3 степени.

К недостаткам способа следует отнести стандартные критерии ВОЗ оценки эффекта и токсичности проводимого лечения. Индивидуальный подход к оценке результатов лечения на основе морфологических признаков иммуногистохимического исследовании позволил бы провести корреляцию по результатам лечения и в дальнейшем ориентацию на применение более эффективных методов лечения.

Целью изобретения является выявление факторов эффективности неоадъювантной паратуморальной аутоплазмохимиотерапии в сочетании с лучевой терапией.

Поставленная цель достигается тем, что при проведении паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией при иммуногистохимическом исследовании результатов лечения выявляют, что в меланомах сохраняется неравномерно или умеренно выраженная экспрессия маркера меланомы Melan PNL2 при сохранении цитоспецифического меланоцитарного антигена Melan PNL2, отмечают реакцию с антителами факторов апоптоза р53, реакции с антителами bcl-2 отсутствует, либо отмечается слабо положительное окрашивание антигена, реакция с антителами маркера фактора пролиферации Ki-67 выявляет низкую пролиферативную активность меланоцитов, блокаду пролиферации - повреждение локализации белка Ki-67 при реакции с антителами CD95 (АПО-1), активацию апоптоза CD95 (АПО-1), эти показатели свидетельствуют о терапевтическом патоморфозе опухоли, подтвержденном клиническим эффектом.

Изобретение «Способ оценки эффективности неоадъювантного лечения меланомы кожи» является новым, так как оно неизвестно из уровня морфологических исследований в онкологии при определении эффективности противоопухолевого лечения.

Новизна изобретения заключается в том, что впервые при морфологическом исследовании представлены иммуногистохимические показатели, доказывающие, что в меланомах кожи под действием неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии и лучевой терапии имеются явные признаки терапевтического патоморфоза опухоли. При этом обнаружены явления блокады пролиферации (повреждения локализации белка Ki-67, активация апоптоза CD95 (АПО-1) при сохранении цитоспецифического меланоцитарного антигена Melan PNL2, подавление факторов апоптоза опухоли (р53 и bcl-2).

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при оценке эффективности противоопухолевого лечения и назначения более перспективных в клиническом и экономическом плане методов лечения в различных учреждениях, особенно онкологического профиля, в НИИ онкологии, онкодиспансерах.

«Способ оценки эффективности неоадъювантного лечения меланомы кожи» выполняется следующим образом.

Больному меланомой кожи проводят курс аутоплазмохимиотерапии: пунктируют локтевую вену с забором 40 мл крови, центрифугируют ее в течение 30 мин при 1500 об/мин, плазму крови инкубируют с цитостатиками: цисплатин - 10 мг, метатрексат - 25 мг, циклофосфан - 600 мг в термостате в течение 30 мин при температуре 37°C, затем вводят пациенту в подкожную жировую клетчатку непосредственно под очаг злокачественного роста через намеченные под контролем УЗИ точки вне сосудистого русла, отступая от края опухоли проколами под углом 45°. В этот же день проводят сеансы дистанционной гамматерапии в течение последующих 5 дней и далее второй курс аутоплазмохимиотерапии. Суммарная доза химиопрепаратов составила: цисплатина - 20 мг, метатрексата - 50 мг, циклофосфана - 1200 мг. Суммарная очаговая доза дистанционной гамматерапии - 36 Гр на первичный очаг и зону регионарного метастазирования изоэффективную 40 Гр.

При иммуногистохимическом исследовании были выявлены признаки патоморфоза опухоли.

В клетках опухоли отчетливо определялся кариопикноз, кариорексис и кариолизис. Цитоплазма была вакуолизирована, ядро смещалось к периферии. Наблюдался отек меланоцитов и межуточного вещества (фиг.1, 2).

Фиг.1. Морфологические изменения в меланомах кожи под действием паратуморальной аутоплазмохимиотрепаии:

а-г - в клетках опухоли: кариорексис, кариолизис; отек межуточного вещества. Вокруг меланоцитов - незначительная лимфоцитарная инфильтрация.

а-г - окраска гематоксилином и эозином.

а-г - x 400

Фиг.2. Десмопластическая реакция в меланоме кожи под действием паратуморальной АПХТ:

а-г - очаги фиброза в опухоли и на границе опухоли с подлежащей тканью.

а-г - окраска гематоксилинои и эозином, а-г - x 400.

В опухолях на границе с подлежащей тканью отчетливо выявлялась десмопластическая реакция, выражавшаяся в развитии плотной волокнистой соединительной ткани (фиг.3).

Фиг.3. Изменения в меланоцитах под действием паратуморальной аутоплазмохимиотерапии:

а, б - незначительная лимфоцитарная инфильтрация вокруг меланоцитов;

в, г - кариорексис, кариолизис, цитолизис, отек цитоплазмы и межклеточный отек.

а-г - окраска гематоксилином и эозином, а-г - x 400.

Под действием неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии определялись выраженные признаки патоморфоза опухоли, заключавшиеся в кариопикнозе, кариорексисе и кариолизисе в меланоцитах. Опухолевые очаги ограничивались пластами фиброзной ткани (фиг.4 а, б). В опухолях отмечались поля гибнущих меланоцитов с сохранением меланина, располагавшегося как внутри меланоцитов, так и внеклеточно в виде свободно лежащих глыбок. Имели место образования, напоминавшие гранулемоподобные структуры с наличием гигантских многоядерных клеток типа инородных тел. Эти клетки располагались вокруг меланоцитов ((фиг.4 в).

На границе опухоли и дермы отмечалась лимфоцитарная инфильтрация различной степени выраженности ((фиг.4 г).

Фиг.4. Меланома после паратуморальной неоадъювантной терапии.

а - дистрофические изменения в отграниченном узле меланомы, по периферии лимфоцитарная инфильтрация с ангиоматозом;

б - выраженный фиброз вокруг опухолевых клеток. В фиброзной строме располагаются глыбки меланина;

в - на месте гибнущих меланоцитов клетки типа инородных тел;

г - лимфоцитарная инфильтрация на границе опухоли и дермы.

а - x 32; 6 - x 200; в-г - х 400. Окраска гематоксилином и эозином.

В меланомах ответная реакция организма на опухолевый процесс представлена преимущественно лимфоцитами. Опухоли с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией имеют лучший прогноз. Clark W.H. и соавт. (1989) ввели термин TILS (лимфоциты, инфильтрирующие опухоль), чтобы учесть наличие лимфоцитов, фактически проникающих между клетками опухоли, что особенно важно при вертикальной стадии роста опухоли. TILS является наиболее важным прогностическим фактором. Меланомы с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией имеют более благоприятный прогноз. Отсутствие иммунного ответа в опухолях толщиной 3,65 мм и более служит отрицательным прогностическим фактором в отношении выживания больных и положительным в отношении развития гематогенных метастазов (Day C.L. et al. 1982).

В этой группе были изучены иммуногистохимические изменения. Было обнаружено, что в меланомах сохраняется неравномерно или умеренно выраженная экспрессия маркера меланомы Melan PNL2, реакция с антителами факторов апоптоза р53, реакция с антителами bcl-2 отсутствовала либо отмечалось слабо положительное окрашивание антигена. При реакции с антителами маркера фактора пролиферации Ki-67 выявлялась очень низкая пролиферативная активность меланоцитов. Реакция с антителами CD95 (АПО-1) в меланоцитах была слабо положительной (фиг.5 а-г).

Таким образом, данные иммуногистохимического исследования показали, что в меланомах кожи под действием неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии и лучевой терапии имеются явные признаки терапевтического патоморфоза опухоли. При этом были обнаружены явления блокады пролиферации (повреждения локализации белка Ki-67), активация апоптоза CD95 (АПО-1) при сохранении цитоспецифического меланоцитарного антигена Melan PNL2.

Фиг.5. Иммуногистохимические изменения в меланомах кожи под действием неоадъювантной паратуморальной аутоплазмохимиотерапии и лучевой терапии:

а - CD95 (АПО-1) неяркая позитивная реакция в опухоли;

б - Ki-67 невысокая неравномерная пролиферация;

в - melan PNL2 неяркая реакция;

г - melan PNL2 умеренно яркая реакция;

а-г - окраска стрептовидин-биотиновым методом с докраской пероксидазой,

а-г - x 200.

Примеры конкретного применения «Способа оценки эффективности неоадъювантного лечения меланомы кожи».

Пример 1.

Больной П., 1974 г.р., история болезни №3389/к поступил в отд. радиологии РНИОИ 16.08.2004 г., 2 месяца назад травмировал врожденный пигментный невус кожи передней грудной стенки.

St.localis: на коже передней грудной стенки определяется образование темно-коричневого цвета, 2,5 см в диаметре, мультицикличной формы, гладкое, экзофит высотой около 0,8 см на одном из участков образования, мягко-эластической консистенции, с неравномерной пигментацией. Слева в подкрыльцовой области пальпируется 2 увеличенных лимфатических узла размерами 3 и 1,5 см в диаметре, безболезненные, не спаянные с окружающими тканями. Цитологический анализ соскоба (№32576-77) - смешанноклеточная пигментная меланома, в пунктате увеличенных лимфатических узлов №32893-94 - метастаз меланомы. Диагноз: меланома кожи передней грудной стенки с метастазами в подкрыльцовые лимфатические узлы, ст. III, клиническая группа 2.

26.08.2004 г. проведен первый курс аутоплазмохимиотерапии: пунктировали локтевую вену с забором 40 мл крови, центрифугировали ее в течение 30 мин при 1500 об/мин. Плазму крови инкубировали с цитостатиками: цисплатин - 10 мг, метотрексат - 25 мг, циклофосфана - 600 мг в термостате в течение 30 мин при температуре 37°C, затем ввели пациенту в подкожную жировую клетчатку непосредственно под очаг злокачественного роста через намеченные под контролем УЗИ точки вне сосудистого русла, отступая 1,5 см от края опухоли проколами под углом 45°. В этот же день проводили сеансы дистанционной гамматерапии в течение последующих 5 дней. 02.09.2004 г. - второй курс аутоплазмохимиотерапии. Суммарная доза химиопрепаратов составила: цисплатина - 20 мг, метотрексата - 50 мг, циклофосфана - 1200 мг. Суммарная очаговая доза дистанционной гамма-терапии - 36 Гр на первичный очаг и зону регионарного метастазирования изоэффективную 40 Гр.

После окончания неоадъювантного химиолучевого этапа лечения визуально уменьшился экзофитный компонент образования, появились очаги депигментации, уменьшились в размере лимфоузлы в левой аксиллярной области.

04.09.04.г. больной был переведен в отд. реконструктивно-пластической хирургии, где ему была выполнена операция - широкое иссечение меланомы кожи передней грудной стенки с пластикой серповидным кожным лоскутом, подкрыльцово-подлопаточная лимфаденэктомия слева. Послеоперационный период протекал гладко. Заживление первичным натяжением. Швы сняты на 13-е сутки. Гистологический анализ (№733322-324) - меланома из эпителиоподобных и невусоподобных клеток с умеренным содержанием меланина, очагами изъязвления, фиброза. Инвазия III-IV уровня по Кларку. Толщина опухоли по Бреслоу - 4,5 мм; №773325-326 - выраженная лимфоцитарная инфильтрация с наличием большого количества гигантских многоядерных клеток типа инородных тел, №773326 а, б, в - в лимфатических узлах ангиоматоз, очаговый фиброз.

Пример 2.

Больная Г., 1974 г.р., история болезни 14531/x поступила в отд. радиологии РНИОИ 02.09.2005 г. с пигментным образованием кожи спины, которое травмировала в мае 2005 г. На коже спины определяется опухоль темно-коричневого цвета, 2,0 см в диаметре с ровными контурами, экзофит высотой около 0,8 см на одном его участке, мягко-эластической консистенции, с неравномерной пигментацией, кровоточит. Цитологический анализ соскоба №18004 - 005 пигментная меланома, эпителиоподобный вариант - смешанноклеточная пигментная меланома. Диагноз: меланома кожи спины, ст.II, клиническая группа 2.

Комплексное лечение: 03.09.2005 г. начали первый курс аутоплазмохимиотерапии: пунктировали локтевую вену, забрали 40 мл крови, центрифугировали ее в течение 30 мин при 1500 об/мин. Затем плазму крови инкубировали с цитостатиками: цисплатин - 10 мг, метотрексат - 25 мг, циклофосфана - 600 мг в термостате в течение 30 мин при температуре 37°C, а затем ввели пациентке в подкожную жировую клетчатку непосредственно под очаг злокачественного роста через намеченные под контролем УЗИ точки вне сосудистого русла, отступая 2 см от края опухоли проколами под углом 45°. На следующий день начали сеансы дистанционной гамма-терапии в очаговой дозе 2,4 Гр в течение 5 дней. 09.09.2005 г. провели аналогично второй курс аутоплазмохимиотерапии с последующим облучением в течение 5 дней. Суммарная доза химиопрепаратов составила: цисплатина - 20 мг, метотрексата - 50 мг, циклофосфана - 1200 мг. Суммарная очаговая доза дистанционной гамматерапии - 36 Гр на первичный очаг и зону регионарного метастазирования изоэффективную 40 Гр.

После окончания неоадъювантного химиолучевого этапа лечения визуально уменьшился экзофитный компонент образования, появились очаги депигментации.

15.09.2005 г. больная была переведена в отд. реконструктивно-пластической хирургии, где была выполнена операция - широкое иссечение меланомы кожи спины с пластикой серповидным кожным лоскутом. Послеоперационный период протекал гладко и без особенностей. Швы сняты на 13-е сутки. Гистологический анализ (№822098-99) - меланома, преимущественно из невусоподобных клеток, наличием меланина, изъязвлением на ограниченном участке, инвазия I-II уровень по Кларку.

Технико-экономическая эффективность способа оценки эффективности неоадъювантного лечения меланомы кожи заключается в том, что на основании определения ведущих морфологических признаков, иммуногистохимических показателей выявлена высокая клиническая эффективность неоадъювантной паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией, ранее не выявлявшаяся при морфологическом исследовании. Определены морфологические признаки: выраженная лимфоцитарная инфильтрация с наличием большого количества гигантских многоядерных клеток типа инородных тел; в лимфатических узлах ангиоматоз, очаговый фиброз - выраженные признаки патоморфоза, свидетельствуют об эффективности лечения. Результаты иммуногистохимического исследования коррелируют с клиническими данными, подтверждены клиническим эффектом: визуальным уменьшением экзофитного компонента образования, появления очагов депигментации, уменьшения размеров лимфоузлов в аксиллярной области, возможностью выполнения операции широкого иссечения меланомы кожи.

Изобретение относится к области медицины, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения эффективности неоадъювантной паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией меланомы кожи. Проводят иммуногистохимическое исследование при проведении неоадъювантного лечения, а именно при паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией, при иммуногистохимическом исследовании результатов лечения выявляют экспрессию маркера меланомы Melan PNL2 и при сохранении неравномерно или умеренно выраженной экспрессии маркера меланомы Melan PNL2 при сохранении цитоспецифического меланоцитарного антигена Melan PNL2 отмечают реакцию с антителами фактора апоптоза р53, реакцию с антителами bcl-2, реакцию с антителами маркера фактора пролиферации Ki-67 и реакцию с антителами CD95 (АПО-1) и в случае отсутствия реакции с антителами фактора апоптоза р53, реакции с антителами bcl-2 либо наличии слабо положительного окрашивания антигена, наличии низкой пролиферативной активности меланоцитов, блокады пролиферации - повреждение локализации белка Ki-67, и активации апоптоза при реакции с антителами CD95 (АПО-1), лечение оценивают как эффективное, свидетельствующее о терапевтическом патоморфозе опухоли. Способ обеспечивает выявление на основании иммуногистохимических показателей: выраженной лимфоцитарной инфильтрации с наличием большого количества гигантских многоядерных клеток типа инородных тел; в лимфатических узлах ангиоматоза, очагового фиброза - выраженных признаков патоморфоза, свидетельствующих об эффективности лечения. Результаты иммуногистохимического исследования коррелируют с клиническими данными, подтверждены положительным клиническим эффектом: визуальным уменьшением экзофитного компонента образования, появлением очагов депигментации, уменьшением размеров лимфоузлов в аксиллярной области, возможностью выполнения операции широкого иссечения меланомы кожи. 5 ил.

Способ оценки эффективности неоадъювантного лечения меланом кожи, включающий иммуногистохимическое исследование при проведении неоадъювантного лечения, отличающийся тем, что при паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией, при иммуногистохимическом исследовании результатов лечения выявляют экспрессию маркера меланомы Melan PNL2 и при сохранении неравномерно или умеренно выраженной экспрессии маркера меланомы Melan PNL2, при сохранении цитоспецифического меланоцитарного антигена Melan PNL2 отмечают реакцию с антителами фактора апоптоза р53, реакцию с антителами bcl-2, реакцию с антителами маркера фактора пролиферации Ki-67 и реакцию с антителами CD95 (АПО-1) и в случае отсутствия реакции с антителами фактора апоптоза р53, реакции с антителами bcl-2 либо наличии слабоположительного окрашивания антигена, наличии низкой пролиферативной активности меланоцитов, блокады пролиферации - повреждение локализации белка Ki-67, и активации апоптоза при реакции с антителами CD95 (АПО-1) лечение оценивают как эффективное, свидетельствующее о терапевтическом патоморфозе опухоли.