СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АУТОГЕМОХИМИОТЕРАПИИ РАКА РЕКТОСИГМОИДНОГО ОТДЕЛА ПРЯМОЙ КИШКИ И СИГМОВИДНОЙ КИШКИ, А ТАКЖЕ АУТОГЕМОХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С СВЧ-ГИПЕРТЕРМИЕЙ РАКА ПРЯМОЙ КИШКИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано при оценке эффективности лечения аутогемохимиотерапии (АГХТ) и аутогемохимиотерапии с СВЧ-гипертермией больных раком ректосигмоидного отдела, сигмовидной кишки и прямой кишки.

Известно, что превращение нормальной клетки в опухолевую происходит в результате накопления совокупности ряда мутаций в генетическом аппарате, ведущих к нарушению механизмов, контролирующих размножение и рост клетки (см. "Морфологическая диагностика болезней желудками и кишечника" Аруин Л.И. , Капуллер Л. Л. , Исаков В.А., изд-во "Триада - X", М., 1998). Различные мутации гена Wt p53 - наиболее частое генетическое нарушение, которое находят в раковых опухолях. При изучении рака толстой кишки человека в 75-80% опухолей была обнаружена мутация p53 (mt p53), также обнаружена корреляция между увеличением экспрессии mt p53 и нарастанием морфологической атипии и степенью злокачественности. В маленьких поверхностных раках толстой кишки (до 5 мм в диаметре) mt р53 выявляется только в части клеток, а в аденомах толстой кишки mt p53 не выявляется.

Скорость роста опухоли является важным показателем особенностей ее клинического течения и определяется балансом, пролиферативной активностью и апоптозом, соответствующими специфическими FaS (APO-1, CD₉₅) рецепторами. При исследовании рака толстой кишки человека физиологический уровень экспрессии FaS (АPO-1 с CD₉₅) обычный и специальный уровень и/или потеря его соответствовали меньшей продолжительности жизни после наступления рецидива в послеоперационном периоде и повышенному риску смерти от прогрессии опухоли. Гиперэкспрессия р53 в опухолях является диагностическим и прогностическим маркером и может быть связана с лекарственной резистентностью.

Значительная вариабельность темпов пролиферации в разных участках толстой кишки может объяснить различную частоту рака в разных ее отделах, хотя принципиальные различия в раковом потенциале между тонкой и толстой кишкой вызваны различным характером апоптоза. Более чем в 75% всех раков толстой кишки наблюдается мутация с полной утратой короткого плеча хромосомы 17, на котором располагается ген р53. Таким образом, апоптоз в толстой кишке имеет особенности, которые обусловливают весьма частое возникновение рака. В литературе обсуждают роль молекулярных механизмов в поддержании гомеостаза желудочно-кишечного барьера в разработке новых методов лечения опухолей.

В практическом плане уровень экспрессии mt p53 может быть прогностическим признаком. Известно, что диагноз злокачественной опухоли в настоящее время основывается на комплексном клинико-морфологическом анализе с привлечением дополнительных методов исследования, в том числе и иммуногистохимического (см. кн. "Общие принципы иммуногистохимической диагностики и классификации опухолей. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухоли человека. Изд. 2-е, дополн. и переработанное, под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. Казань, 2000г. , с.30-36, 64). Известно об антителах РЭА с очень высокой специфичностью для рака толстой кишки, которые реагируют только с раковыми опухолями толстой кишки и не связываются с клетками раков других локализаций. Колоректальный рак интенсивно исследуется с помощью опухолеспецифичных антител, отличных от РЭА. Наиболее хорошо охарактеризован так называемый антиген гастроинтестинального рака GTCA. Он выявляется в раках толстой кишки, поджелудочной железы и желудка. Нормальный эпителий всегда негативен, кроме участков, непосредственно прилегающих к опухоли.

Иммуногистохимическое исследование с помощью маркеров пролиферации (PCNA, Ki-67) показало, что в раковых опухолях и некоторой части аденом толстой кишки индекс метки был значительно выше, чем в нормальном эпителии, но одинаков с гиперпластическим эпителием вблизи края опухоли. Последнее обстоятельство ограничивает диагностическое применение PCNA в оценке озлокачествления эпителия, эпителия толстой кишки.

Прогнозирование течения колоректального рака находится в начальной стадии разработки. Считается, что агрессивный фенотип опухоли связан с повреждением в 18-й и 22-й хромосомах, однако геновые мишени (соответственно) и их белковые продукты пока не идентифицированы.

Известно, что во многих тканях, развивающихся из энтодермы, а также в соответствующих раках, с высоким постоянством обнаруживается РЭА (см. кн. "Общие принципы иммуногистохимической диагностики и классификации опухолей. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухоли человека. Изд. 2-е, дополн. и переработанное, под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. Казань, 2000г., с.58-72).

Этот источник информации выбран нами в качестве прототипа. Сывороточный уровень РЭА коррелирует с интенсивностью иммуногистохимической окраски, что отражает степень выработки этого антигена опухолевыми клетками, а также количество неопластических клеток, секретирующих РЭА. РЭА обнаруживается в клетках колоректальногорака в 80-100% случаев. В раковой опухоли, а также в прилегающем к опухоли эпителии, окрашивание по РЭА было сходным: в части клеток метилась цитоплазма, а в части - апикальная поверхность.

Кишечные раки окрашиваются на ЦКР 8, 18, 19, но реакция на ЦКР 7 всегда негативна. Последнее обстоятельство служит надежным дифференциально-диагностическим критерием в диагностике анапластических кишечных аденокарцином и раков прилежащих органов, например эндометрия (опухолевые клетки всегда ЦКР 7 положительны). Иммуногистохимическое исследование с помощью маркеров пролиферации (PCNA, Ki-67) показало, что в раковых опухолях индекс метки был значительно выше, чем в нормальном эпителии.

Прогнозирование течения колоректального рака находится в начальной стадии разработки. Считается, что агрессивный фенотип опухоли связан с повреждением в 18-й и 22-й хромосомах, однако гены мишени (соответственно, и их белковые продукты) пока не идентифицированы.

Пролиферативная активность аденокарциномы (измеренная по Ki-67) не связана с гистоструктурной и дифференцировкой опухоли. Мутации гена р53 наблюдаются в колоректальном раке, коррелируют с глубиной инвазии, стадией и агрессивным течением. Раковые опухоли, имеющиеся в геноме, так называемый "дикий тип" р53 (Wild-type) более чувствительны к химиотерапии, чем неопластические клетки с поврежденным (мутированным) геном р53. Поэтому иммуногистохимический анализ р53 может помочь определить биохимическое поведение рака и его ответ на терапию.

Цель изобретения - выявление клинической эффективности и прогностических факторов результатов лечения аутогемохимиотерапией с СВЧ-гипертермией больных раком ректосигмоидного отдела, сигмовидной и прямой кишки.

Поставленная цель достигается тем, что проводят ультраструктурное исследование раковой опухоли ректосигмоидного отдела после неоадъювантной аутогемохимиотерапии; выявляют некроз, выраженный апоптоз, большое количество активных лимфоцитов, фибриллогенез, дистрофические изменения в сосудах, явления эктазии, что свидетельствует о необратимых некротических изменениях в раковых клетках и их гибели; замещение некротизированных опухолевых пластов, при исследовании рака прямой кишки после неоадъювантной аутогемохимиотерапии с СВЧ-гипертермией на уровне электронной микроскопии выявляют однотипные с вышеизложенными изменения, но с большей степенью выраженности; в сохранившихся раковых клетках ядерный хроматин был конденсирован, в цитоплазме процесс маргинации, лизис и порциальные некрозы различной величины, обнаруженные изменения в клетках свидетельствовали о снижении синтеза нуклеиновых кислот и белка в ядрах, нарушение проницаемости цитоплазматической мембраны и, как следствие, - изменение в цитоплазме; затем проводят на этом же материале после указанного лечения иммуногистохимическое исследование реакцией с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA, ЭМА, РЭА, наблюдают положительную реакцию в виде отчетливой экспрессии маркеров, связанных с факторами пролиферации, маркеров соединительной ткани, блокады маркеров эндотелия и базальных мембран, подавлении ангиогенеза, наличие сосудов капиллярного типа, гиперпластические изменения в эндотелии, что свидетельствует о пролиферативных процессах в сосудистом русле, вышеперечисленные ведущие морфологические признаки являются прогностическим фактором эффективности лечения.

Изобретение "Способ определения эффективности противоопухолевого лечения" является новым, так как оно неизвестно из уровня морфологических исследований в онкологии при оценке эффективности противоопухолевого лечения.

Новизна изобретения заключается в том, что авторы проводят ультраструктурное исследование и определяют некоторые иммуногистохимические показатели опухолей ректосигмоидного отдела под воздействием аутогемохимиотерапии и опухолей прямой кишки под воздействием аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией и оценивают результаты и прогноз противоопухолевого лечения. При обоих методах лечения отмечали активный фибриллогенез, приводящий к замещению некротизированных опухолевых пластов, наличие сосудов капиллярного типа, выявляемых на уровне световой микроскопии, а также гиперпластические изменения в эндотелии, обнаруживаемые при электронно-микроскопическом исследовании, свидетельствуют в пользу пролиферативных процессов, происходящих в сосудистом русле. На основании данных морфологических исследований по результатам высокоэффективной аутогемохимиотерапии и аутогемохимиотерапии с СВЧ-гипертермией были выявлены морфологические показатели, ранее не выявляемые при противоопухолевой терапии, которые констатируют не только эффективность лечения, но и являются благоприятным прогнозом для дальнейшей судьбы больных. Это подтверждается хорошим качеством жизни и выживаемостью больных раком этой локализации.

Изобретение имеет изобретательский уровень, так как для специалиста врача-морфолога явным образом не следует из уровня медицины в области оценки эффективности противоопухолевого лечения больных ректосигмоидного отдела и опухолей прямой кишки ультраструктурным исследованием и определением иммуногистохимических показателей.

Предлагаемый "Способ определения эффективности противоопухолевого лечения" не очевиден, явным образом не следует из уровня медицины в этой области онкологии - оценки противоопухолевой эффективности и прогноза при морфологическом исследовании ни в СНГ, ни в России, ни за рубежом.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при прогнозировании эффективности противоопухолевого лечения в различных медицинских учреждениях, особенно онкологического профиля, в НИИ онкологии, онкодиспансерах.

Для доказательства полученных результатов морфологического исследования приводим материалы ультраструктурного исследования и некоторые иммуногистохимические показатели опухолей ректосигмоидного отдела и прямой кишки после аутогемохимиотерапии и аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией и примеры конкретного выполнения способа на больных.

Следует отметить, что в начале проводилось исследование гистологических препаратов на светооптическом уровне.

Проведенное нами ультраструктурное исследование раковых опухолей ректосигмоидного отдела выявило явления некроза и апоптоза. Под действием неодъювантной аутогемохимиотерапии по сравнению с нелеченными опухолями морфологические признаки апоптоза были более выражены. Макрофагов в опухолях было немного, несмотря на большое количество активных лимфоцитов. Имели место явления фибриллогенеза. Капилляров в опухоли было немного. Изменения в сосудах носили дистрофический характер и сопровождались явлениями эктазии.

Под действием аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией на уровне электронной микроскопии были выявлены однотипные изменения, однако степень выраженности их была больше, то есть под действием обоих методов неоадъювантной химиотерапии на уровне электронной микроскопии нами были выявлены признаки терапевтического патоморфоза.

Повреждающее действие на раковую опухоль сводилось к некрозу различной степени выраженности и апоптозу. Более выраженные процессы наблюдались при аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией.

В сохранившихся раковых клетках ядерный хроматин был конденсирован. В цитоплазме наблюдали процессы маргинации, лизис и порциальные некрозы различной величины. Обнаруженные изменения в клетках свидетельствовали о снижении синтеза нуклеиновых кислот и белка в ядрах, нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны и, как следствие, - изменения в цитоплазме.

Совокупность этих явлений приводила к необратимым изменениям в раковых клетках и их гибели. При обоих методах лечения отмечали активный фибриллогенез, приводящий к замещению некротизированных опухолевых пластов. Отчетливо были выражены изменения в сосудах и цитоплазматической мембране.

Нами были изучены некоторые иммуногистохимические показатели рака толстой и пряной кишки под действием аутогемохимиотерапии и аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией. Нами было показано, что при проведении реакций с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA, ЭМА, РЭА наблюдается положительна реакция в виде отчетливого окрашивания. Маркер р53 отчетливо был выявлен в ядрах в виде положительного свечения на (+++). Раковый эмбриональный антиген давал неяркую неравномерную реакцию в гнездах раковых клеток. ЭМА был положителен в раковом эпителии. Реакция с цитокератином-7 была отрицательна, что подтверждает сохраненный фенотип кишечного типа. Такие маркеры как ЭМА, тетранектин, МРМ-2 были слабо позитивны. Коллаген IV был позитивен в базальных мембранах и позитивен в стенках сосудов и структурах стромы. Виментин был такие позитивен в строме и стенках сосудов. Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование выявило ряд особенностей. Отчетливо была выявлена экспрессия маркеров, связанных с факторами пролиферации. Выявлены маркеры соединительной ткани. Выявленные изменения свидетельствуют о блокаде маркеров эндотелия и базальных мембран. Аналогичные изменения происходили с коллагеном IV типа. Наличие сосудов капиллярного типа, выявляемых на уровне световой микроскопии, а также гиперпластические изменения в эндотелии, обнаруживаемые при электронно-микроскопическом исследовании, свидетельствуют в пользу пролиферативных процессов, происходящих в сосудистом русле.

Аутогемохимиотерапию осуществляли при раковых опухолях сигмовидной кишки и ректосигмоидного отдела прямой кишки. Аутогемохимиотерапию в сочетании с СВЧ-гипертермией применяли в предоперационном периоде при раковых опухолях прямой кишки в связи с тем, что эта локализация доступна для данного метода воздействия.

Приводим примеры историй болезней.

Пример 1.

Больной Н. , 68 лет, ист. б-ни 4875/ж. Поступил: 03.06.98. Диагноз: рак сигмовидной кишки. Гистологический анализ 507896-899 - аденокарцинома. УЗИ 05.06.98 - в проекции слепой кишки лоцируется гипоэхогенное объемное образование 5,0х5,7 см с неровными контурами, неоднородной структуры. С 05.06 по 15.06.98 - 4 инфузии неоадъвантной аутогемохимиотерапии. Суммарно: 5-фторурацил - 3000 мг, метотрексат - 80 мг, винбластин - 40 мг. После второго введения уменьшение болей, исчезновение поносов и вздутия живота. После третьего введения - полностью исчезли боли, слабость, улучшилось состояние. На протяжении всего курса химиотерапии не отмечалось какого-либо токсического проявления химиопрепаратов, оставались стабильными показатели гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов. УЗИ 18.06.98. Образование размерами 4,8х5,9 см. 24.06.98 - операция. Правосторонняя гемиколонэктомия. Макроскопически: опухоль почти циркулярная, инфильтративного типа, размерами 4,0х4,3 см. Гистологический анализ 508019-024. Умереннодифференцированная аденокарцинома с инвазией всех слоев стенки кишки. Метастазов не обнаружено. Послеоперационный период без осложнений. Выписан на 12-е сутки. Жив без признаков прогрессирования процесса. Осмотры: 13.10.98, 15.06.99, 21.12.99 и 18.04.2001.

Пример 2.

В качестве примера эффективности аутогемохимиотерапии с локальной СВЧ-гипертермией приводим следующие наблюдения. Больной М., 1931 года рождения, история болезни 4573/ж, поступил в отделение общей онкологии Ростовского НИИ онкологии 29.05.98г. по поводу рака прямой кишки III стадии. Жалобы на постоянные боли внизу живота и в прямой кишке, периодическое вздутие живота, частые псевдодефекации (до 12 раз в сутки), учащенное мочеиспускание (до 10 раз в сутки), наличие крови и слизи в кале. Из анамнеза выяснено, что считает себя больным около полугода, когда впервые отметил появление вышеописанных симптомов. После обращения к врачу и ректороманоскопии в ЦРБ выявлен рак прямой кишки. Фиброколоноскопия 1 от 01.06.98г.: от 11 и до 17 см от ануса определяется кровоточащая циркулярная блюдцеобразная опухоль с бугристыми краями, ограниченно подвижная, стенозирующая просвет кишки. Произведена биопсия опухоли. Гистологический анализ 504965-066 от 22.05.98г. - аденокарцинома. Больному 02.06.98г., 05.06.98г., 08.06.98г., и 11.06.98г. проведена аутогемохимиотерапия общей дозой: 5-фторурацил - 4000 мг, метотрексат - 80 мг. После окончания инфузии цитостатиков 05.06.98г., 08.06.98г. и 11.06.98г. проведены сеансы внутриполостной локальной СВЧ-гипертермии.

Внутриполостная локальная СВЧ-гипертермия осуществлялась с помощью аппарата "Яхта-3" на частоте 915 МГц. Для создания в первичном очаге требуемой температуры использовались дипольные антенны сечением 10-16 мм при длине рабочей зоны 8 см. Излучатели имели резиновую оболочку с полостями для принудительного водяного охлаждения. При расположении излучающей антенны в прямой кишке обязательным условием являлось обеспечение охвата всего пораженного опухолью участка по длине рабочей зоны антенны и жесткая фиксация излучателя в просвете органа. Выход на уровень температурного плато осуществляли в предельно короткое время (1-2 мин) с целью предупреждения развития эффекта термотолерантности опухоли. Гипертермия проводалась при температуре 42-44^oС. Обязательный контроль температуры в нагреваемом очаге проводили с помощью термометрического катетера при кратковременном отключении генератора излучения. Проведение гипертермии начинали через 1 час после введения цитостатиков на аутокрови. Длительность процедуры термовоздействия составляла 60 мин.

После второй инфузии цитостатиков у больного уменьшились боли внизу живота, снизилась частота псевдодефекаций и мочеиспусканий. После окончания курса аутогемохимиотерапии с локальной СВЧ-гипертермией, накануне операции, боли внизу живота и кровь в кале исчезли, стул дважды в сутки, акт мочеиспускания нормализовался. Фиброколоноскопия 2 от 16.06.98г.: от 12 и до 16 см от ануса определяется опухоль, занимающая заднюю полуокружность прямой кишки (от 4 до 9 часов условного циферблата), подвижная, просвет кишки увеличился. Регрессия опухоли составила более 50%. 17.06.98г. выполнена передняя резекция прямой кишки. Макропрепарат: блюдцеобразная опухоль верхнеампулярного отдела прямой кишки с прорастанием всех слоев ее стенки. Гистологический анализ удаленной опухоли 507295-098 - умереннодифференцированная аденокарцинома с инвазией всех слоев стенки кишки. Метастазов опухоли в лимфатических узлах нет. Послеоперационный период протекал без осложнений.

На 14-е сутки после операции пациент выписан из клиники в удовлетворительном состоянии. В течение 36 месяцев признаков местного рецидива или генерализации рака прямой кишки не выявлено.

Технико-экономическая эффективность "Способа определения эффективности противоопухолевого лечения" заключается в том, что на основании морфологического исследования - ультраструктурного и иммуногистохимических показателей - выявлена высокая клиническая эффективность новых способов лечения рака ректосигмоидного отдела сигковидной кишки, сигмовидной кишки аутогемохимиотерапией и рака прямой кишки аутогемохимио-терапией в сочетании с СВД-гипертермией, ранее не выявлявшиеся морфологическим исследованием.

На основании установленных ведущих морфологических признаков стало возможным установить положительные прогностические факторы результатов лечения.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения эффективности аутогемохимиотерапии рака ректосигмоидного отдела прямой кишки и сигмовидной кишки, а также аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией рака прямой кишки. Проводят ультраструктурное исследование раковой опухоли ректосигмоидного отдела прямой кишки и сигмовидной кишки и, если выявляют некроз, выраженный апоптоз, активные лимфоциты, фибриллогенез, дистрофические изменения в сосудах; явления эктазии, делают вывод о необратимых некротических изменениях в раковых клетках, их гибели, замещении некротизированных опухолевых пластов; при исследовании рака прямой кишки на уровне электронной микроскопии выявляют однотипные с вышеперечисленными факторы некроза, но с большей степенью выраженности; в сохранившихся раковых клетках конденсированный ядерный хроматин, в цитоплазме процесс маргинации, лизис и пропорциональные некрозы различной величины и делают вывод о снижении синтеза нуклеиновых кислот и белка в ядрах, нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны и, как следствие, - изменений в цитоплазме; при выполнении затем на этом же материале после указанного лечения иммуногистохимического исследования проводят реакции с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA, РЭА и ЭМА, наблюдают положительную реакцию в виде отчетливого окрашивания, выявляют их экспрессию и маркеры соединительной ткани и делают вывод о блокаде маркеров эндотелия, базальных мембран, коллагена IV типа, подавлении ангиогенеза, наличии сосудов капиллярного типа, гиперпластических изменениях в эндотелии, а также о пролиферативных процессах в сосудистом русле, то вышеперечисленные морфологические признаки считают прогностическими факторами эффективности лечения. Способ позволяет повысить эффективность выявления результатов аутогемохимиотерапии рака ректосигмоидного отдела и сигмовидной кишки, а также аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией рака прямой кишки.

Способ определения эффективности аутогемохимиотерапии рака ректосигмоидного отдела прямой кишки и сигмовидной кишки, а также аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией рака прямой кишки, включающий иммуногистохимическое определение опухолевого маркера РЭА, отличающийся тем, что, если при ультраструктурном исследовании раковой опухоли ректосигмоидного отдела прямой кишки и сигмовидной кишки выявляют некроз, выраженный апоптоз, активные лимфоциты, фибриллогенез, дистрофические изменения в сосудах, явления эктазии и делают вывод о необратимых некротических изменениях в раковых клетках, их гибели, замещении некротизированных опухолевых пластов; при исследовании рака прямой кишки на уровне электронной микроскопии выявляют однотипные с вышеперечисленными факторы некроза, но с большей степенью выраженности; в сохранившихся раковых клетках - конденсированный ядерный хроматин, в цитоплазме - процесс маргинации, лизис и пропорциональные некрозы различной величины и делают вывод о снижении синтеза нуклеиновых кислот и белка в ядрах, нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны и, как следствие - изменений в цитоплазме; при выполнении затем на этом же материале после указанного лечения иммуногистохимического исследования: проводят реакции с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA и ЭМА, наблюдают положительную реакцию в виде отчетливого окрашивания, выявляют их экспрессию и маркеры соединительной ткани и делают вывод о блокаде маркеров эндотелия, базальных мембран, коллагена IV типа, подавлении ангиогенеза, наличии сосудов капиллярного типа, гиперпластических изменениях в эндотелии, а также о пролиферативных процессах в сосудистом русле, то вышеперечисленные морфологические признаки считают прогностическими факторами эффективности лечения.