ВАКЦИНА ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K39/145 C12N7/00 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины против гриппа типа А.

Таксономически вирусы гриппа отнесены к семейству ортомиксовирусов (Ortho-myxoviridae, по классификации ICTV - 00.046). Оно включает серотипы А, В и С.

Первые два из них составляют один род (00.046.0.01), серотип С образует другой (00.046.02.001). Принадлежность к одному из них определяется антигенными характеристиками нуклеопротеина (НП) и матриксного белка (M1), расположенных внутри вириона.

Грипп А - контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей.

Вирус гриппа А широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного экологических комплексов. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), инфицирование происходит водно-фекальным путем.

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). Установлено, что антитела хозяина к ГА и НА обеспечивают основу гуморального иммунитета, при этом ведущую роль играют протективные антитела к ГА. Известно 16 антигенных подтипов ГА (H1-H16) и 9 подтипов НА (N1-N9). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом, состоящим из 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации.

Различные комбинации ГА и НА способны привести к появлению высоковирулентных штаммов вируса, вызывающих высокий процент смертности.

В настоящее время наблюдается распространение гриппа птиц (ГП), вызванного вирусом типа А, подтипа H5N1, на территории Евразии. Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных в плане возникновения пандемий (1).

Заболевание, вызванное высокопатогенными штаммами возбудителя ГП типа А (H5N1), наносит колоссальный экономический ущерб в промышленном птицеводстве, что подтверждается недавними эпизоотическими вспышками «куриного гриппа» в Сибирском, Центральном и Южном регионах Российской Федерации, а также на территории стран ближнего и дальнего зарубежья.

В странах, где отмечены вспышки этого заболевания, в качестве одного из методов борьбы с ним используют вакцинацию. Уменьшение экономических потерь в результате вакцинации связано с предотвращением вспышек заболевания, с ограничением распространения вируса и с возможной минимизацией вероятности его мутации вследствие уменьшения количества восприимчивых к нему птиц.

Известны три вида инактивированных противогриппозных вакцин:

1) вирионные (корпускулярные, или цельные), представляющие собой смесь антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса гриппа с адъювантом в эффективном соотношении;

2) расщепленные, или дезинтегрированные препараты («сплит-вакцины»), представляющие собой смесь структурных компонентов вириона (как поверхностных, так и внутренних), разъединенных с помощью различных детергентов, с адъювантами в эффективном соотношении;

3) субъединичные, содержащие смесь поверхностных структур вириона ГА и НА-носителей протективных антигенов вируса с адъювантами в эффективном соотношении. По способу приготовления почти все перечисленные виды вакцин являются смешанными, так как содержат и цельные вирионы, и их структурные компоненты, в том числе единицы суперкапсида (2).

Современные генно-инженерные методы позволяют создавать вакцины на основе плазмид, встроенных в вирусы оспы или инфекционного ларинготрахеита птиц, что унифицирует высокий выход вируса и, главное, обеспечивает маркирование их по НА. Примером могут служить вакцины, созданные в США и некоторых других странах на основе авирулентных вирусов оспы кур и оспы канареек.

Другой тип вакцин - живые вакцины на основе вирусов со встроенным геном ГА, способных репродуцироваться в организме птиц, не вызывая патологии. Рекомбинантная вакцина фирмы Merial, экспрессирующая ГА Н5, зарегистрирована во многих странах. Эти вакцины высокоэффективны и технологичны, просты в применении, обеспечивают достаточно надежную защиту против гомологичных вирусов, однако они не используются в настоящее время, поскольку являются биопрепаратами «стратегического запаса». Каждая из этих вакцин имеет свои достоинства и недостатки (3-7).

В борьбе с ГП наиболее часто используют инактивированные препараты, включающие полноценные вирионы в смеси с масляным адъювантом.

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма H7N1/Rostock (№ доступа последовательности в Genbank=×52226) вируса ГП, полученного в постоянной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью бета-пропиолактона в конечной концентрации 1:3000 с 2-часовой экспозицией при 37°С, и целевой добавки в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (8).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах кур с инфекционной активностью 8,9 lg ЭЛД₅₀/мл и инактивированного с помощью формалина 0,5%-ной концентрации в течение 72 часов при 4°С, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:9 (9-11).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Chicken/Pakistan/95 (H7N3) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (12).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Queretaro/14588-19/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью) 1:64, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Wisconsin 68 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,5 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:512, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Oregon/71 (H7N3) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:2048, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Mallard/Ohio/556/87 (H5N9) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:64, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Mexico/31381-7/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Mexico/26654-1374/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:128, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Minnesota/10734-5/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:96, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Jalisco/14589-660/94 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Veracruz/28159-398/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,9 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:256, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Puebla/28159-474/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:256, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Chicken/Chiapas/28159-488/95 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 7,3 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:48, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (13).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Turkey/Minnesota/3689-1551/81 (H5N2) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,7 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:1024, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью формалина, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из штамма A/Duck/Singapore/F119/97 (H5N3) вируса ГП, полученного в 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 8,1 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл и ГА-активностью 1:128, очищенного от балластных примесей и инактивированного с помощью 2-бромэтиламина гидробромида, взятого в количестве 3 mM, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении 1:4 (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/156/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/1402/86 (H5N2) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/2243/84 (H5N6) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/CK/Italy/473/99 (H7N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Duck/Potsdam/15/80 (H7N7) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Известна вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма А/СК/ИАЕ/415/99 вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (15).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма A/Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку виде масляного адъюванта в эффективном соотношении (14).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала вакцин против гриппа птиц инактивированных эмульсионных, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью, обеспечивающих эффективную защиту домашней птиц против вируса ГП типа А (H5N1) и предотвращающих выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Указанная задача решена созданием вакцины против ГП инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Новосибирский» (авторское наименование) ГП типа А, подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64, и целевую добавку в виде масляного адъюванта в соотношении, мас.%, 30:70-40:60.

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют 10-12-суточные эмбрионы SPF-кур. Экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) очищают от балластных примесей центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10-15 мин. После центрифугирования вирусный материал сливают в 10-20-литровые бутыли и подвергают инактивации. Перед инактивацией инфекционная активность вируса должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл, а ГА-активность не ниже 1:64.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), формальдегид или бета-пропиолактон (16).

АЭЭИ добавляют в вируссодержащую суспензию при перемешивании в виде 10%-ного раствора до конечной концентрации 0,05-0,1%, формальдегид - до конечной концентрации 1:1000, а бета-пропиолактон до конечной концентрации 1:2000-1:4000. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при температуре от 20 до 37°С. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением тиосульфата натрия в суспензию антигенного материала.

После контроля на стерильность и авирулентность антиген подвергают повторной очистке от балластных примесей, пропуская его через промежуточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи антигена 40-50 л/час и фильтровальную установку.

Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь ГА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении 30:70-40:60 по весу.

Из адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант на основе минерального масла «Marcol-52» и эмульгаторов-неиногенных поверхностно-активных веществ (алкилмодифицированный полиоксиалкилен-силоксановый сополимер - АПС и ланолин) или коммерческий масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Содержание антигенного материала и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины в соотношении, мас.%, 30:70-40:60 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета типа «вода в масле». Допускается в верхней части флакона наличие слоя масляного адъюванта. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ГП инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде очищенного и авирулентного антигенного материала из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 в эффективном количестве.

3. Целевая добавка.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ГП инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является то, что в качестве активного вещества она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64.

2. Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью не менее 1:64, в количестве 30,0-40,0 мас.%.

3. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант.

4. Вакцина содержит масляный адъювант в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы.

5. Вакцина содержит масляный адъювант в количестве 60,0-70,0 мас.%.

6. Вакцина содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал30,0-40,0Масляный адъювантДо 100,0

Результаты проведенных испытаний показали, что предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту домашней птицы против вируса ГП типа А, подтипа H5N1, а также предотвращает выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Достижение указанного результата от использования изобретения объясняется тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, обладающего высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющего антигенную и иммуногенную активностью после инактивации, обеспечивая тем самым получение вакцины против ГП типа А, подтипа H5N1, создающей эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса и предотвращающей выделение вакцинированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 депонирован 12 апреля 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ» №125-ДЕП «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1.

По сравнению с исходным изолятом штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 имеет генетические и фенотипические особенности. Он клонирован в культуре MDCK, при размножении в куриных эмбрионах обладает высокой вирулентностью и сохраняет антигенную силу после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированных вакцинных препаратов.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Новосибирский» вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, серотипу А, подтипу H5N1 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц 50-120 нм; филаментовидные частицы около 20 нм в диаметре, длиной 200-300 нм и более. На поверхности вириона, возвышаясь над липидной мембраной на 10-14 нм, находятся около 500 шипообразных выступов (спайков), образованных гомотримерами ГА.

В промежутках между кластерами спайков у вирусов типа А размещаются, как правило, около 100 молекул НА.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 нт; №2 - чуть менее 2350 нт; №3 - как правило, 2250 нт; №4 - 1780 нт; №5 - 1575 нт; №6 - 1420 нт; №7 - 1050 нт; №8 - 900 нт.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся повторяющиеся отрезки, причем повторы 5′-концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5′-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3′-конце. Кроме того, 3′-концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-Intemational Committee on Taxonomy of Viruses (2006). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/].

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Новосибирский» вируса гриппа птиц относится к типу А, подтипу H5N1.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами РТГА, РН и ИФА. Так, через 12 дней после однократной иммунизации цыплят предлагаемой вакциной титр антител к ГА, обеспечивающих реакцию торможения гемагглютинации, составил 5,0 log₂; титр антител, определяемых методом ИФА, равнялся 1:1243, преципитирующие антитела обнаруживались при разведении исследуемых сывороток от 1:2 до 1:4.

Определение и сравнительный анализ первичной структуры амплифицированных фрагментов кДНК показал, что исследованная проба содержала фрагменты генома полевых изолятов вируса гриппа птиц. Первичная структура сайта разрезания белка НА изолята имела вид PQGRERRRKKR*GLF, что свидетельствует о том, что он относится к группе высокопатогенных штаммов вируса ГП.

Проведено сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена ГА типа Н5 и гена НА типа N1 из банка данных «Flu. The Influenza Sequence Database» (http://www.flu.lanl.gov/). Показано, что ГА выделенного изолята принадлежит к подтипу Н5, а НА к подтипу N1 обширной линии высокопатогенных изолятов ГП A/Goose/Guandong/1/96 (H5N1), выделенных на территории Юго-Восточной Азии, включая Индонезию и Китай, в период с 1996 г. и по настоящее время.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Новосибирский» проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной вакцины против вируса ГП.

Штамм «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1 репродуцируется в 10-12-суточных эмбрионах кур при температуре 37,0±0,5°С и влажности 50-70%. Заражающая доза в пределах от 1 до 4,0 lg ЭЛД₅₀ вызывает специфическую гибель КЭ, ограниченную временным промежутком от 24 до 48 часов инкубирования. В течение указанного промежутка времени вирус накапливается в титрах от 9,0 до 10,2 lg ЭЛД₅₀/мл. Такой урожай позволяет с использованием одного куриного эмбриона получить материал для 50-70 прививных доз вакцины. Штамм «Новосибирский» вируса гриппа птиц является стабильным, обладает высокой вирулентностью и адаптирован к размножению в эмбрионах кур.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Геном штамма «Новосибирский» вируса ГП состоит из восьми неодинаковых по размеру (900-2350 нуклеотидов) фрагментов односпиральной минус-РНК, суммарная длина которых составляет около 14 тыс. нуклеотидов с молекулярной массой 4,5 МД. Вирионная РНК не обладает инфекционностью. В вирионах обнаружено 10 белков. Белки делятся на поверхностные (ГА, НА, М2) и внутренние (РВ1, РВ2, PA, NP, M1, NS1, NS2).

ГА и НА имеют важнейшие антигенные сайты, на которые вырабатывается защитный иммунитет, в первую очередь в виде нейтрализующих антител.

Физические свойства

Молекулярная масса вирионов составляет 250МД, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см³, коэффициент седиментации вирионов 700-800 S 20w.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Новосибирский» вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Патогенность - высокая (внутривенный индекс 2,87, что соответствует высокопатогенным штаммам вируса ГП).

Вирулентность - 100% гибель внутримышечно зараженных цыплят в дозе 10^6,0 ЭЛД₅₀.

Онкогенность - отсутствует.

Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Стабильность штамма отмечена при проведении пяти последовательных пассажей на чувствительных цыплятах.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Для изготовления вакцины против ГП инактивированной эмульсионной используют вирусный материал штамма «Новосибирский», полученный культивированием в эмбрионах кур. Посевной вирус первого порядка (матровая расплодка вируса) хранится в лиофилизованном состоянии в герметически закрытых флаконах в темном месте при температуре не выше -40°С и не более 12 месяцев со дня изготовления.

Для получения посевного вируса второго порядка содержимое трех флаконов разводят стерильным фосфатно-буферным раствором (ФБР), содержащим 500 ЕД/пенициллина и 500 мкг/см³ стрептомицина, при значении рН 7,2-7,4 с таким расчетом, чтобы в дозе вируса объемом 0,2 мл, предназначенной для заражения одного эмбриона SPF-кур, содержалось не менее 2,0 lg ЭЛД₅₀ вируса. После заражения куриные эмбрионы инкубируют 24-48 часов при 37±0,5°С и относительной влажности 60-70%. Овоскопирование зараженных эмбрионов проводят до 24-часового срока инкубации однократно, а далее через каждые 5 часов. Эмбрионы погибают через 24-48 часов. Эмбрионы, погибшие раньше 24 часов, выбраковывают, а остальные используют в качестве посевного вируса. В стерильных условиях от каждых 5-7 эмбрионов отбирают ЭЭЖ в отдельную стерильную емкость, плотно закрывающуюся. Содержимое каждой емкости проверяют на предмет бактериального загрязнения и контаминации грибами. После проведения контроля стерильный вируссодержащий материал сливают в один сосуд и фасуют в стерильные пенициллиновые флаконы, закрывают стерильными резиновыми пробками, заливают парафином и хранят при температуре не выше минус 40°С.

Содержимое одного из флаконов используют для определения содержания антигена, идентичности вирусного сырья и биологической активности вируса.

Посевной вирус считается пригодным для заражения производственной партии эмбрионов, если вирус идентифицирован, ГА-активность не ниже 1:64, инфекционная активность не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл.

Посевной вирус хранят при температуре не выше минус 30°С в течение не более 4-6 месяцев, не допуская даже однократного его оттаивания.

Для получения производственной расплодки посевной вирус размораживают при температуре 18-24°С в стерильных условиях, вскрывают флакон и его содержимое центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирают, разводят стерильным физиологическим раствором рН 7,0-7,4 из расчета 1000-10000 ЭЛД₅₀/мл, добавляют 500 мкг стрептомицина и 500 ЕД пенициллина на 1 мл материала. Приготовленный таким образом вируссодержащий материал используют для заражения куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы в возрасте 10-12-суток заражают в аллантоисную полость вируссодержащим материалом в объеме 0,2 мл. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,0±0,5°С и относительной влажности воздуха 50-70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводят ежедневно 2 раза в сутки.

Эмбрионы погибают через 24-48 часов. По окончании инкубации эмбрионы помещают в холодильные камеры при температуре 2-6°С на 6-18 часов с тем, чтобы при вскрытии исключить попадание эритроцитов в аллантоисно-эмбриональную жидкость. Охлажденные эмбрионы вскрывают. ЭЭЖ от каждых 20-30 эмбрионов собирают в стерильные флаконы вместимостью 200-500 мл. В стерильные флаконы перед сбором ЭЭЖ добавляют бензилпенициллина натриевую соль 200 ЕД/мл и стрептомицина сульфат 200 мкг/мл. Контакт ЭЭЖ с антибиотиками проводят в течение 2 часов при температуре 24±6°С.

Полученную ЭЭЖ центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10-15 мин для удаления эритроцитов. После центрифугирования вирусный материал сливают в 15-20-литровые бутыли и передают на инактивацию. Из каждой бутыли берут пробу в количестве 1 мл для определения титра ГА и инфекционной активности вируса ГП.

Инфекционная активность вируссодержащего материала, идущего на составление серии вакцины, должна быть не ниже 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл, а ГА-активность не ниже 1:64.

Инактивацию вируса ГП проводят рабочим раствором АЭЭИ, формальдегида или бета-пропиолактона.

Вирусную суспензию нагревают до комнатной температуры или до температуры 37°С в зависимости от используемого инактиванта. При перемешивании в суспензию добавляют 10%-ный раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,05-0,1% или формальдегида до конечной концентрации 1/1000, или бета-пропиолактона до конечной концентрации 1/2000-1/4000.

Дополнительно в суспензию вносят мертиолят из расчета 1/10000 и бензилпенициллина натриевую соль или какой-либо другой антибиотик, выбранный по подтитровке, в количестве 500 ЕД/мл.

После добавления инактиванта смесь перемешивают в течение 20-30 минут. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов и при температуре 37±0,5°С. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия в суспензию антигенного материала. После проведения контроля на стерильность и авирулентность антигенный материал подвергают повторной очистке от балластных примесей, пропуская его через проточную центрифугу ОТР-102К-01 при 15000-17000 об/мин со скоростью подачи жидкости 40-50 л/час и фильтровальную установку.

Очищенный и авирулентный антигенный материал должен иметь ГА-активность не менее 1:64 и рН в пределах 7,2-7,4.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования очищенного и авирулентного антигенного материала с масляным адъювантом в соотношении, мас.%, 30:70-40:60.

Из адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант на основе минерального масла «Marcol-52» и эмульгаторов неионогенных поверхностно-активных веществ (алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер - АПС и ланолин) или коммерческий масляный адъювант марки Montanide ISA-70 производства фирмы «Seppic» (Франция).

Изготовление вакцины проводят в две стадии: получения предэмульсии и получения эмульсии. На стадии получения предэмульсии в реактор со стерильным масляным адъювантом при включенной мешалке (250-300 об/мин) подают необходимый объем антигенного материала со скоростью 100-120 л/час. После подачи антигена в масляный адъювант смесь перемешивают с той же скоростью в течение 60-90 мин, поддерживая температуру смеси в пределах 12-16°С.

На стадии получения эмульсии включают гомогенизатор «Silverson-450 LS» и проводят эмульгирование смеси в течение 3 часов. Мешалка при этом отключена.

Учитывая термолабильность вирусного антигена, процесс эмульгирования проводят при температуре 12-16°С.

После окончания эмульгирования из реактора отбирают пробу вакцины, выдерживают ее в течение суток и проводят контроль физических параметров эмульсии: тип эмульсии, вязкость и стабильность. Вакцина с положительной характеристикой качества поступает на фасовку. Фасовку и укупорку вакцины во флаконы проводят автоматически на разливочном автомате и автомате закатки, находящихся под ламинарным потоком.

Полученную вакцину контролируют на соответствие показателям, установленным стандартом организации.

Пример 2.

Проведены испытания иммуногенной активности вакцины против ГП инактивированной эмульсионной (серия №1), изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 9,1 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью 1:102430,0Масляный адъювант70,0

Для этого полученной вакциной иммунизировали 5 цыплят в возрасте 50 суток внутримышечно в область грудной группы мышц в объеме 0,5 мл. Через 16 суток после иммунизации цыплят заражали гомологичным штаммом вируса ГП в дозе 6,0 lg ЭЛД₅₀ внутримышечно. Иммунизированных цыплят (гр. №1) содержали в одной клетке с контрольной группой цыплят (гр. №2), состоящей из незараженных и невакцинированных цыплят.

Через 60 часов в клетку подсадили цыплят второй контрольной группы (гр. №3), состоящую из зараженных цыплят (положительный контроль).

Результаты наблюдения с 12-часовым интервалом за цыплятами опытных групп с фиксацией видимых клинических признаков болезни представлены в таблице 1 (эту и все последующие таблицы см. в конце описания).

Данные таблицы 1 позволяют сделать ряд выводов:

1. Неиммунные и зараженные вирулентным штаммом «Новосибирский» вируса ГП цыплята (гр. №3) заболели и погибли с проявлением клинических и патологоанатомических признаков, характерных для ГП в тяжелой форме.

2. Цыплята группы №2 заразились от цыплят группы №3 алиментарным путем. Цыплята группы №2 также заболели и погибли с проявлением клинических и патолого-анатомических признаков, характерных для ГП в тяжелой форме.

3. Цыплята, иммунизированные вакциной против ГП эмульсионной инактивированной из штамма «Новосибирский», имели 100%-ную защиту от заболевания ГП в тяжелой форме.

В пробах сывороток крови, отобранных у цыплят опытных групп, определяли антигенную активность в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Представленные в таблице 2 результаты исследований свидетельствуют, что титр антител, равный 5,8 log₂ в РТГА, у иммунизированных цыплят (гр. №1) на момент заражения (16 сутки после иммунизации) был достаточным для обеспечения 100%-ного иммунитета от заболевания ГП в тяжелой форме. Контрольное заражение цыплят гомологичным штаммом не вызвало повышения уровня специфических антител в крови опытной группы цыплят (гр. №1).

Пример 3.

Проведены испытания антигенной активности инактивированной вакцины против ГП (серия №1), полученной так, как описано в примерах 1 и 2.

Цель исследований - изучить формирование иммунитета к ГП у цыплят разного возраста, привитых вакциной в объеме 0,25 мл, а также формирование иммунитета к ГП у птиц разного вида: утят, гусят и индюшат.

Для изучения иммунитета у цыплят разного возраста были сформированы 4 опытные и 4 контрольные группы цыплят, свободных от антител к вирусу гриппа. Опытные и контрольные группы содержали по 5 цыплят одинакового возраста. Цыплят опытных групп иммунизировали инактивированной эмульсионной вакциной внутримышечно в область правой грудки в объеме 0,25 мл.

В пробах сыворотки крови, отобранной у цыплят в разные сроки, определяли активность антител к ГА в РТГА.

Представленные в таблице 3 результаты исследований свидетельствуют, что вакцина против ГП эмульсионная инактивированная из штамма «Новосибирский» обладает высокой антигенной активностью и способна вызывать формирование антигемагглютинирующих антител у вакцинированных цыплят в возрасте от 1 до 30 суток при введении им вакцины в объеме 0,25 мл.

Для изучения формирования иммунитета у птиц разного вида были сформированы 3 опытных и 3 контрольных группы из утят, гусят и индюшат, свободных от антител к вирусу гриппа. Птиц опытных групп иммунизировали предлагаемой вакциной в объеме 0,5 мл.

В пробах сыворотки крови, отобранной у птиц разного вида в разные сроки, определяли активность антител к ГА в РТГА.

Представленные в таблице 4 результаты исследований свидетельствуют, что предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной активностью и способна вызвать формирование антигемагглютинирующих антител у птиц разного вида при введении им вакцины в объеме 0,5 мл.

Пример 4.

Проведены испытания антигенной активности инактивированной вакцины против ГП (серия №1), полученной так, как описано в примерах 1 и 2.

Антигенную активность вакцины изучали на цыплятах 45-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ГП. Для этого были сформированы две группы цыплят по 5 голов в каждой, одна из которых была контрольной (непривитой). Цыплят опытной группы иммунизировали однократно внутримышечно в область правой грудки в объеме 0,5 мл вакциной эмульсионной инактивированной из штамма «Новосибирский». Цыплят содержали в изолированном боксе с созданием отрицательного атмосферного давления в клетке, автопоения и кормления.

В пробах сыворотки крови, отобранной у цыплят в разные сроки, определяли активность антител к ГА в РТГА.

Представленные в таблице 5 результаты исследований свидетельствуют, что предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной активностью и способна вызывать формирование напряженного иммунитета против ГП типа A (H5N1).

Пример 5.

Проведены испытания антигенной активности вакцины против ГП инактивированной эмульсионной (серия №1), полученной так, как описано в примерах 1 и 2.

В опытах использовали свободных от антител к вирусу ГП цыплят в возрасте 38 суток породы «Хайсекс коричневый», полученных на птицефабрике «Кинешемская» Ивановской обл.

Для проведения опыта были сформированы две опытных и одна контрольная группы птиц. Схема опыта представлена в таблице 6.

Для постановки РТГА в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови к вирусу ГП подтипа H5N9 («Институт зоопрофилактики», Венеция, Италия), в качестве отрицательного контроля - нормальную сыворотку крови кур (ФГУ «ВНИИЗЖ»), а в качестве антигена - инактивированный вирус ГП подтипа H5N1 штамма «Новосибирский». Количество испытуемых сывороток соответствует числу цыплят в опыте. Для постановки иммуноферментного анализа (ИФА) использовали коммерческий набор Avian Influenza Virus Antibody Test Kit (фирма «Synbiotics Co», Франция, cep. №OSUCAIV+45003, 16.11.2005 г.).

Постановку ИФА проводили согласно методике, приложенной к набору. Положительным считали титр выше 273.

Представленные в таблице 7 результаты исследования сывороток в РТГА свидетельствуют, что уровень антител к вирусу ГП подтипа H5N1 через 28 суток после иммунизации составил 8,5 log₂ для птиц, привитых в объеме 0,5 мл, и 8,4 log₂ для птиц, иммунизированных вакциной в объеме 0,25 мл.

Представленные в таблице 8 результаты исследований в ИФА сывороток крови птиц, иммунизированных предлагаемой вакциной, свидетельствуют, что предлагаемый препарат обладает высокой антигенной активностью.

Пример 6.

Проведены испытания антигенной активности вакцины против гриппа птиц инак-тивированной эмульсионной (серия №2 и №3), изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Серия №2

Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 9,1 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью 1:24130,0Масляный адъювант70,0

Серия №3

Очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса ГП типа А, подтипа H5N1, полученного в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и ГА-активностью 1:23440,0Масляный адъювант60,0

В опытах использовали свободных от антител к вирусу ГП цыплят в возрасте 40 суток.

Для проведения опыта были сформированы 4 опытных и одна контрольная группы цыплят. Схема опыта представлена в таблице 9.

Для постановки РТГА в качестве положительного контроля использовали сыворотку крови к вирусу ГП подтипа H5N9 («Институт зоопрофилактики», Венеция, Италия), в качестве отрицательного контроля - нормальную сыворотку крови кур (ФГУ «ВНИИЗЖ»), а в качестве антигена - инактивированный вирус ГП подтипа H5N1 штамма «Новосибирский». Количество испытуемых сывороток соответствует числу цыплят, взятых в опыт.

Представленные в таблице 10 результаты исследования сывороток в РТГА свидетельствуют, что уровень титров антител зависел от срока, прошедшего после иммунизации: через 23 суток средние титры антител составляли от 7,9 до 8,2 log₂, через 12 суток от 4,9 до 7,0 log₂ в зависимости от прививного объема вакцины.

Уровень титров антител у цыплят выше 4,0 log₂ через 12 суток после иммунизации свидетельствует о высокой антигенной активности предлагаемой вакцины.

Пример 7.

Проведены испытания протективной активности инактивированной вакцины против гриппа птиц (серия №1), полученной, как описано в примерах 1 и 2.

Изучение протективной активности вакцины по отношению к гомологичному штамму «Новосибирский» вируса ГП проводили двумя методами: путем помещения в одну клетку с вакцинированными зараженными цыплятами цыплят-«контактников» и по выделению вируса в эмбрионах SPF-кур из клоакальных мазков опытных цыплят (как группы вакцинированных цыплят, так и группы цыплят-«контактников»). Для контроля выделения вируса от всех групп цыплят с временным интервалом в 12 часов проводили отбор клоакальных мазков. Для выделения вируса из каждой пробы использовали по 3 эмбриона кур.

Присутствие или отсутствие вируса в эмбрионах подтверждали исследованием аллантоисной жидкости в РГА. В таблице 11 представлены результаты выделения вируса из клоакальных мазков опытных цыплят, отобранных во временном интервале от 0 до 60 часов после контрольного заражения, и результаты РГА. Представленные в таблице 11 данные свидетельствуют, что:

1) в течение 60 часов после заражения вирулентным штаммом «Новосибирский» вируса ГП подопытные цыплята (вакцинированные (гр. №1) и невакцинированные (гр. №2) вирус с фекалиями не выделяли;

2) вакцинированные цыплята были защищены от заражения гомологичным штаммом вируса ГП.

В таблице 12 представлены результаты продолжения опыта по изучению протективной активности инактивированной вакцины против ГП. Через 60 часов после контрольного заражения вакцинированных цыплят (гр. №1) в этот же бокс поместили контрольную группу неиммунных цыплят (гр. №3), которую заразили штаммом «Новосибирский» вируса ГП. Для контроля выделения вируса от всех групп цыплят с временным интервалом в 12 часов проводили обор клоакальных мазков. Для выделения вируса из каждой пробы использовали по 3 эмбриона кур.

Как видно из результатов, представленных в таблице 12, от двух неиммунных зараженных цыплят, начиная с 24 часов после заражения, происходило выделение вируса, что подтверждается специфической гибелью эмбрионов кур и положительным титром в РГА. Вирус от всех цыплят этой группы выделяли через 60 часов после заражения. При этом заболевание в этот промежуток времени проявилось ярко: два цыпленка болели с острым течением, а один погиб. Через 72 часа после заражения погибли оставшиеся два цыпленка. От цыплят-«контактников» (гр. №2) вирус выделяли от одного цыпленка через 36 и 48 часов после контрольного заражения. Через 84 часа у одного цыпленка обнаружили клинические признаки заболевания, через 120 часов все три цыпленка из этой группы погибли. Вакцинированные цыплята (гр. №1) не болели и не выделяли вирус.

Таким образом, результаты данного эксперимента показали высокую вирулентность штамма «Новосибирский», способность передаваться алиментарным путем и вызывать гибель неиммунных цыплят. В то же время вакцинированные цыплята были полностью защищены от заражения вирулентным вирусом, что доказано отсутствием клинических признаков заболевания и отсутствием его репликации.

Таким образом, приведенная информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемой вакцины следующей совокупности условий:

- вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- вакцина против ГП инактивированная эмульсионная, изготовленная на основе штамма «Новосибирский» в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивой птицы от эпизоотического вируса подтипа H5N1, а также предотвратить выделение иммунизированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду.

Источники информации

1. Гребенникова Т.В., Забережный А.Д. и Алипер Т.И. «Диагностика гриппа А с использованием молекулярных методов». Ветеринарная жизнь, 2006, №2 (50), 4.

2. Перадзе Т.В., Фридман Э.А., Шилд Дж. Противогриппозные профилактические препараты. - М.: Медицина, 1986, 100-139.

3. Ямникова С.С., Смоленский В.И., Власов Н.А. и др. Стратегия профилактики и борьбы с гриппом птиц. - Матер. II Междунар. вет. конгресса по птицеводству. - М.: 21-23 марта 2006 г. - C.38-41.

4. Пат. Франции №2751225; А61К 48/00, 39/225, 39/17, 39/215; C12N 15/85; 23.01.1998 г.

5. Пат. США №5916879, 514/44, 29.06.1999 г.

6. WO 03/086453; А61К 39/295, 39/145; 23.10.2003 г.

7. FAO Recommendations on the Prevention, Control and Eradication of Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) in Asia. - September 2004, 1-59.

8. Ronda E., Garcia-Gancedo A., Alonso M.L. et al. Вакцина против классической чумы птиц, изготовленная из клеток куриного эмбриона, инактивированная бета-пропиолактоном. Матер. IX Междунар. конгресса по микробиологии. Тез. докл., М., 1966, 465.

9. Narayan G., Rouse B.T., Lang G. A virus infection in turkeys. VI Artificial immunization against the Malignant virus strain Turkey/Ontario/7732/66/ - Gen. J. Comp. Med., 1970, 34, 1, 72-79.

10. Rouse B.T., Lang G. and Narayan G. A new Influenza A virus Infection in Turkeys. VII. Comparative Immunology. - Canad. J. Comp. Med., 1971, 35, 44-51.

11. Kiyoko Iwatsuki-Horimoto et. al. The index influenza A virus subtype H5N1 isolated from a human in 1997 differs in its receptor-binding properties from a virulent avian influenza virus. - J. of Gen. ViroL, 2004, 85, 1001-1005.

12. WO 03/086453; А61К 39/295, A61K 39/145; 23.10.2003 г.

13. Swayne D.E., Beck J.R., Garcia М. et. al. Influents of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines. - Avian Pathol., 1999, 28, 245-255.

14. Swayne D.E., Beck J.R., Perdue M.L. et. al. Efficacy of vaccines in Chickens against Highly Pathogenic Hong Kong H5N1 Avian Influenza. - Avian Dis., 2001, 45, N2, 355-365.

15. Website: www.intervet.com.

16. Пат. РФ №594771, А61К 39/12, 07.07.1993 г.

Таблица 1Клиническое состояние цыплят после проведения контрольного заражения штаммом ГП H5N1 «Новосибирский» Часы наблюдения1224364860728496108120132144156168180192Гр. №1З*ЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗГр. №2ЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗБ**Б1-Е3-М3-М^{^}2-МГр. №3----ЗЗБББ2-Б3-М3-М3-М3-М3-М3-М1-МПримечание: З* - здоровые; Б** - больные; М^ - мертвые.

Таблица 2Титры специфических антител у цыплят, определенных с помощью РТГА, после проведения контрольного заражения штаммом «Новосибирский» вируса ГП№ группыПосле заражения, сут.162328№1*№2**№3***№1№2№3№1№2№3Гр.№111:641:641:1281:1281:128Н/и1:1281:1281:12821:81:161:641:321:256Н/и1:641:321:25631:161:321:321:321:64Н/И1:321:321:6441:321:641:641:641:128Н/и1:641:641:12851:641:2561:1281:1281:256Н/и1:1281:1281:256Ср.титр4,85,86,26,07,2 6,26,07,2Гр.№21--Н/иН/иН/иН/иН/иН/иН/и2--Н/иН/иН/иН/иН/иН/иН/и3--Н/иН/иН/иН/иН/иН/иН/и*№1 - антиген вируса ГП подтипа H5N2 производства института зоопрофилактики (Венеция, Италия);
**№2 - антиген вируса ГП подтипа H5N3 производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (г.Покров, Россия);
***№3 - антиген вируса ГП подтипа H5N1 производства ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ», г.Владимир, Россия);
Н/и - не исследовали.

Таблица 3Изучение формирования иммунитета у цыплят разного возраста к ГП, привитых инактивированной вакциной из штамма «Новосибирский» в объеме 0,25 млГруппы разновозрастных цыплят, сут.Среднегрупповые титры антигемагглютинирующих антител (log₂) по срокам, сут.1421281Контрольная0,30,20,1Опытная3,54,54,810Контрольная0,20,60,7Опытная3,94,65,120Контрольная0,40,80,5Опытная4,15,05,730Контрольная0,70,21,0Опытная4,35,25,8Таблица 4Изучение формирования иммунитета у птиц разного вида к ГП, иммунизированных инактивированной вакциной из штамма «Новосибирский» в объеме 5 млГруппы разновозрастных цыплят, сут.Среднегрупповые титры антигемагглютинирующих антител (log₂) по срокам, сут.142128УткиКонтрольная0,30,20,1Опытная4,55,86,9ГусиКонтрольная0,20,60,7Опытная4,66,27,0ИндюкиКонтрольная0,40,80,5Опытная4,35,87,0

Таблица 5Антигенная активность инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский»Группы цыплятСреднегрупповые титры антигемагглютинирующих антител (log₂) по срокам, сут.0142128Опытная1,24,55,15,3Контрольная0,50,40,7Таблица 6Схема постановки опыта по проверке антигенной активности инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский»№№ группыСрок исследования крови после иммунизации, сут.Объем прививной вакцины, млКоличество привитых голов№1280,510№2280,2510Контроль28-5

Таблица 7Результаты определения антигенной активности инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский»№ группыТитры анти-ГА антител (кратность разведения, log₂ кратности разведения) в трех повторностях123Контрольная группаОтр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.Отр.№111:1024(10)1:512(9)1:512(9)21:256(8)1:128(7)1:256(8)31:256(8)1:128(7)1:256(8)41:512(9)1:512(9)1:256(8)51:256(8)1:128(7)1:256(8)61:512(9)1:128(7)1:256(8)71:512(9)1:256(8)1:256(8)81:1024(10)1:512(9)1:512(9)91:512(9)1:128(7)1:256(8)101:512(9)1:256(8)1:256(8)Средний геометрический титр8,97,88,28,3 лог₂№211:1024(10)1:512(9)1:512(9)21:512(9)1:512(9)1:512(9)31:128(7)1:64(6)1:64(6)41:1024(10)1:512(9)1:1024(10)51:512(9)1:256(8)1:256(8)61:1024(10)1:512(9)1:512(9)71:512(9)1:512(9)1:512(9)81:128(7)1:64(6)1:64(6)91:1024(10)1:512(9)1:1024(10)101:256(8)1:256(8)1:128(7) 1:1024(10)1:512(9)1:512(9) 1:128(7)1:128(7)1:128(7) 1:256(8)1:128(7)1:128(7)Средний геометрический титр8,88,18,28,4 лог₂Таблица 8Результаты определения антигенной активности инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский» методом ИФА№ группыСредний титр1357821018Контрольная47

Таблица 9Схема постановки опыта по проверке антигенной активности инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский»№№ п/пСрок исследования крови после иммунизации, сут.Серия используемой вакциныПрививной объем вакцины, млКоличество привитых голов123№20,510212№30,510312№30,2510412№31,05Контроль12--5

Таблица 10Результаты определения антигенной активности инактивированной вакцины против ГП из штамма «Новосибирский»Сыворотки№ пробы1 повторность2 повторностьСерия - 2, доза 0,5 мл11:256(8)1:256(8)21:512(9)1:512(9)31:64(6)1:64(6)41:256(8)1:256(8)51:512(9)1:512(9)61:512(9)1:512(9)71:256(8)1:128(7)81:256(8)1:128(7)91:128(7)1:128(7)101:1024(10)1:512(9)Ср.титр8,27,9Серия - 3, доза 0,5 мл11:16(4)1:32(5)21:32(5)1:32(5)31:8(3)1:16(4)41:32(5)1:32(5)51:64(6)1:64(6)61:128(7)1:128(7)71:16(4)1:32(5)81:16(4)1:32(5)91:64(6)1:64(6)101:64(6)1:64(6)Ср.титр5,25,5Серия - 3, доза 0,25 мл11:16(4)1:16(4)21:16(4)1:16(4)31:16(4)1:16(4)41:64(6)1:64(6)51:32(5)1:32(5)61:16(4)1:16(4)71:32(5)1:32(5)81:64(6)1:64(6)91:64(6)1:64(6)101:32(5)1:32(5)Ср.титр4,94,9Контрольная группа1--2--3--4--5--Безвредность, доза 1 мл11:64(6)1:64(6)21:128(7)1:128(7)31:128(7)1:128(7)41:128(7)1:128(7)51:256(8)1:128(7)Ср.титр7,06,8

Таблица 11Результаты исследования выделения вируса из клоакальных мазков цыплят после проведения контрольного заражения штаммом «Новосибирский» вируса ГП (во временном промежутке от момента заражения до 60 часов после заражения)№ группы№ цыпленкаЧасы/сутки после зараженияЧасы инкубации (ч.)/гибель кол-во, шт./РГА2448729612011121/от1/от---2-¹1/от---31/от----41/от----5-1/от---21-----21/от-1/от--3-----1124-----21/от----3-1/от---4-----51/от----21-----2-1/от---31/от----1136-----21/от1/от---3-----41/от----5-----211/от-1/от--2-----3-1/от---1148-1/от---21/от----3-1/от---4-----51/от----211/от----2-----31/от1/от---11601/от----2-1/от---31/от----4-----5-----21-1/от---21/от----3-----Примечание: -¹ - Гибель куриных эмбрионов не регистрировалась; от. - Отрицательный результат в РГА.

Таблица 12Результаты исследования выделения вируса из клоакальных мазков цыплят после проведения контрольного заражения штаммом «Новосибирский» вируса ГП (во временном промежутке от 72 до 120 часов после заражения)№ группы№ цыпленкаЧасы/сутки после заражения группЧасы инкубации (ч.)/гибель кол-во, шт./РГА244872961201172     2     3     4     5     2172     2     3     3112     2     3     1184     2     3     4     5     2184     2     3     3124-¹1/1:5121/1:1024--21/от1/1:40961/1:4096--3 1/от---1196     2     3     4     5     2196--1/1:128--2-----31/от1/1:4096---3136-----2-1/1:256-1/1:4096-3-1/от---11108     2     3     4     5     1108-1/от1/1:2048  2-----31/от----3148-1/1:40961/от--2--1/от--3 1/от---

11120     2     3     4     5-    21120-----2-----3-----3160--3/1:256-1024--2-1/от2/1:256-1024--3 1/1:10242/1:128-1024--Примечание: -¹ - Гибель куриных эмбрионов не регистрировалась; от. - Отрицательный результат в РГА.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевую добавку. В качестве активного вещества вакцина содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц Influenzae virus avicum, ceM.Orthomyxoviridae, серотипа А, подтипа H5N1, коллекция ФГУ «ВГНКИ» ВНИИЗЖ №125-ДЕП «Новосибирский», в эффективном количестве. Вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту птицы от эпизоотического вируса подтипа H5N1, а также предотвратить выделение иммунизированной птицей возбудителя инфекции в окружающую среду. 5 з.п. ф-лы, 12 табл.

1. Вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц Influenzae virus avicum, ceM.Orthomyxoviridae, серотипа А, подтипа H5N1, коллекция ФГУ «ВГНКИ» ВНИИЗЖ №125-ДЕП «Новосибирский», в эффективном количестве.2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц, полученный в 10-12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не менее 9,0 lg ЭЛД₅₀/мл и гемагглютинирующей активностью не менее 1:64.3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц в количестве 30,0-40,0 мас.%.4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит масляный адъювант.5. Вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит масляный адъювант в количестве 60,0-70,0 мас.%.6. Вакцина по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она содержит очищенный и авирулентный антигенный материал из штамма «Новосибирский» вируса гриппа птиц и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал30,0-40,0Масляный адъювантдо 100,0