ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACILLUS LATEROSPORUS, ПОДАВЛЯЮЩИЙ И ПРЕДОТВРАЩАЮЩИЙ РАЗВИТИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ТИПОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/13 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к применению биологических средств борьбы с микроскопическими водорослями.

Повышенная антропогенная нагрузка на водные источники в результате поступления промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов, выражающемся в "цветении" воды за счет развития различных типов микроскопических водорослей и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Массовое развитие микроводорослей приводит к образованию трехмерных структур, покрывающих водную поверхность или "матов". Бурный рост микроводорослей проявляется в так называемом "цветении" водоемов в результате развития и, в дальнейшем, сопровождается отмиранием их избыточной биомассы, выделением токсинов, нарушением кислородного режима, органолептическими проявлениями гниения. "Цветение воды" приводит к изменениям качества воды, нежелательным для бытового, рекреационного, рыбохозяйственного, энергетического использования. "Цветение" воды часто наблюдается в водоемах, которые снабжают водой население и промышленность и представляет значительную угрозу здоровью людей и животных. Способность микроводорослей к быстрому размножению связана, прежде всего, с их устойчивостью к экстремальным температурам и концентрациям солей, слабой освещенности, низкой прозрачности, малому количеству кислорода. Микроводоросли могут развиваться в морской и пресной воде и наносят вред любым водным источникам, как естественным, так технологическим и искусственным. Микроводоросли живут в водных каналах, трубах, плавательных бассейнах, аквариумах. "Цветение" воды может вызывать нарушение работы предприятий, использующих эту воду. Серьезный экономический ущерб вызывает "цветение" воды на электростанциях, в атомных реакторах и т.д. При отмирании и разложении микроводоросли образуют продукты распада и токсины, губительные для животных и человека [1-2]. Антидотов к токсинам микроводорослей не существует. Кроме того, микроводоросли вызывают ряд аллергических заболеваний. Поэтому при высоком уровне "цветения" воды становится нежелательным использование водоемов в рекреационных целях, т.е. нужно до минимума ограничить время нахождения человека и домашних животных в такой воде. Используя энергию света, атмосферный азот и минимальное содержание минеральных веществ, микроводоросли создают органическую массу для роста гетеротрофных организмов, что приводит к увеличению загрязнения воды и массовому размножению личинок насекомых. Водоемы с "цветущей" водой создают благоприятные условия для размножения личинок комаров - переносчиков возбудителей ряда тяжелых болезней человека, в том числе и малярии.

Таким образом, "цветение" водоемов вызывает ряд серьзных социальных и экономических последствий, что определяет необходимость борьбы с сине-зелеными бактериями и продуктами их метаболизма. Актуальность борьбы с водорослями и последние годы возрастает в связи с загрязнением окружающей среды и общим потеплением климата на Земле, приводящих в ряде случаев к резкому развитию водорослей в различных экологических нишах, в частности в водоемах. В настоящее время многие страны сталкиваются с необходимостью предотвращения развития (альгистатический эффект) и/или подавления уже размножившихся водорослей (альгицидный эффект). Используются химические и физические методы контроля за развитием водорослей. Несмотря на эффективность химических альгицидов в лабораторных условиях, массовое использование их в естественных условиях лимитируется по токсикологическим и гигиеническим требованиям. Кроме того, химические препараты не обладают избирательностью действия и оказывают ряд биологических эффектов (летательный, мутагенный, тератогенный и т.д.) на растительные и животные организмы. Использование химических альгицидов для обработки водоемов ограничено по санитарно-гигиеническим нормам в связи с опасностью для человека и животных и также неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности других обитателей водоемов (гидробионтов).

Используемые физико-химические методы "борьбы" с микроводорослями - спуск воды из водоемов с последующим механическим удалением биомассы, аэрирование огромных водных пространств, применение химических альгицидных препаратов и веществ-коагулянтов, использование ультрафиолетового облучения, ультразвука - малоэффективны и связаны с большими финансовыми затратами [3-4]. Физические методы контроля микроводорослей направлены на создание условий, либо препятствующих развитию водорослей, либо разрушающих уже образовавшиеся трехмерные структуры сообщества микроводорослей - так называемых «маты». Ультразвуковая обработка «цветущей» воды, хотя и является достаточно эффективной по альгицидному действию, приводит к нежелательным последствиям. Обработка «цветущей» воды ультразвуком снижает рН, количество общего азота и фосфора в воде, повышает температуру воды. Как альтернатива химическим и физическим средствам контроля развития водорослей могут рассматриваться биологические препараты, основанные на использовании бактерий, оказывающих антагонистический (альгицидный) эффект на водоросли. В настоящее время выделен ряд микроорганизмов, обладающих альгицидным эффектом. Можно ожидать, что бактерии-антагонисты будут являться хорошим источником для создания современных альгицидов.

В качестве биологического метода контроля численности микроводорослей могут быть использованы микроорганизмы и их метаболиты, оказывающие антагонистический эффект на цианобактерии, вирусы, соединения растительного происхождения [5-6]. В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрен штамм Sphingomonas sp.M-17, вызывающий лизис цианобактерии и отличающийся замедленным альгицидным действием [7].

Задача заявляемого изобретения

получить штамм бактерий, обладающий альгицидным действием против широкого спектра микроскопических водорослей.

Задача решена путем получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus, подавляющего и предотвращающего развитие микроскопических водорослей, относящихся к различным таксономическим типам, а также разрушающего образованные микроскопическими водорослями трехмерные структуры, покрывающие водную поверхность («маты»).

Заявляемый штамм выделен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-9405. Он отличается от аналога Sphingomonas sp.M-17 широким спектром альгицидного действия, более быстрым цианолитическим эффектом (лизис цианобактерии наступает через 2 и 36 часов, соответственно).

Заявляемый штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405 имеет следующие характеристики.

1. Культурально-морфологические признаки

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×2,5-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует на жидких и твердых питательных средах. В качестве твердой питательной среды использовали агаризованную среду NBY, LB и ДПС.

Состав агаризованной среды NBY, мас.%:

Питательный бульон 0,8

Дрожжевой экстракт 0,3

Агар 2,0

Вода Остальное.

Состав агаризованной среды LB, мас.%:

Бакто-триптон 1,0

Дрожжевой экстракт 0,5

NaCl 1,0

Агар 2,0

Вода Остальное.

Состав агаризованной среды ДПС, мас.%:

Дрожжи эприновые 3,0

Кукурузная мука 1,5

Агар 2,0

Вода Остальное.

При культивировании на агаризованной среде NBY, LB и ДПС через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-4 мм бежевого цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры. В процессе споруляции образуется каноэвидная структура, примыкающая к споре. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,9-1,2×1,5-1,7 мкм.

2. Физиолого-биохимические свойства

Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетоина. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизоцима.

Диапазон возможного культивирования штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405: рН 6,9-7,2 и температура 28-31°С. Оптимальная температура 30°С и рН 7,0.

3. Поддержание штамма ВКПМ В-9405 проводят на косяках с агаризованной средой NBY, которые пересевают каждые две недели

4. Хранение штамма осуществляют после его лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивают на агаризованной среде NBY. Клетки смывают защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток выдерживают 15 мин при -70°С, а затем быстро переносят в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки составляло 4 часа. Лиофилизированные образцы хранят при температуре +4°С.

5. Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В- 9405

Заявляемый штамм культивируют в стандартных условиях в качалочных колбах Эрленмейера в жидкой питательной среде NBY [(в мас.%): питательный бульон (Nutrient broth "Difco")-8; дрожжевой экстракт (Yeast extract "Difco") 0,3] в течение 96 часов при 28-30°С со встряхиванием при 250 об/мин. Наблюдают равномерный рост культуры по всему объему. Методом световой микроскопии и высевом на питательный агар оценивают наличие бактериальных клеток и спор и отсутствие посторонней микрофлоры. К 96 часам культивирования наблюдают преимущественно 90-95% спор и 5-10% вегетативных клеток.

Микробиологическим методом оценивают титр колоний образующих единиц (КОЕ) штамма ВКПМ В-9405, который составляет -2,5-3,0 х 10⁹/мл.

6. Альгицидные и альгистатические свойства штамма охарактеризованы с использованием азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: штамм Anabaena sp.5781 получен с кафедры микробиологии ЛГУ; штамм Nostoc sp.ATCC29411 получен из коллекции IMET, Йена, ГДР; два штамма азот не фиксирующих цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Вухань); штаммы зеленых микроводорослей (Cosmarium) и морских микроводорослей (Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira) получены с кафедры биофизики МГУ.

Заявляемый штамм обладает широким спектром альгицидной активности. Подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).

Таблица 1.
Таксономическая принадлежность использованных микроводорослей.Вид микроводорослейТаксономический типAnabaenaCyanophytaNostocCyanophytaMicrocystis 562CyanophytaMicrocystis 905CyanophytaCosmariumChlorophytaAmphidiniumDinophytaProrocentrumDinoflagellataThalassiosiraDinoflagellata

7. Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных и альгистатических свойств штамма.

Микроводоросли Anabaena, Nostoc, Microcystis и Cosmarium культивировали при комнатной температуре и освещении в режиме день-ночь с использованием люминесцентных ламп дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, обеспечивающих освещенность 1500-2000 lx, без аэрации, в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл, содержащих 50-100 мл модифицированной среды BG-11 (8), состоящей из смесей А и В следующего состава (мас.%):

Состав А (мас.%)NaNO₃1,5К₂HPO₄0,04MgSO₄×7H₂O0,075CaCl₂×2H₂O0,036Лимонная кислота0,006Аммонийный цитрат железа0,006ЭДТА0,001Na₂СО₃0,02Состав В (мас.%)Состав В1 мл/лН₃ВО₃ 2.86MnCl₂×4H₂O 1,81ZnSO₄×7H₂O 0,222Na₂MoO₄×2H₂O 0,39CuSO₂×5H₂O 0,079Со(NO₃)₂×6H₂O 0,494

После автоклавирования и охлаждения рН среды составляет 7,1.

Морские водоросли Amphidinium, Thalassiosira, Prorocentrum выращивали в морской воде в тех же условиях освещенности и температуры.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1.

Оценка альгицидной активности штамма ВКПМ В-9405.

Альгицидную активность заявляемого штамма оценивали по его литическому действию на микроводоросли, регистрируемому по падению оптической плотности при смешанном культивировании заявляемого штамма с клетками одной из микроводорослей через 96 часов совместной инкубации.

Для количественной оценки альгицидного эффекта к жидкой культуре цианобактерий (Nostoc, Anabaena, Microcystis) и зеленых водорослей (Cosmarium) добавляли 96-часовую культуру бацилл в соотношении 5:1 и определяли остаточную оптическую плотность (ОП_О), как (ОП_T/ОП_H)×100, где ОП_H - начальная ОП, ОП_T - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.

Измеряли оптическую плотность (при длине волны 590 нм) смеси в нулевой момент времени и после инкубации.

Внесение культуральной жидкости штамма ВКПМ В-9405 вызывало падение оптической плотности смесей его с клетками микроводорослей как Nostoc, так и Anabaena в 10 раз, а с клетками микроводорослей как Microcystis, так и Cosmarium только в два раза (таблица 2). Лизис клеток микроводорослей подтвержден также методом оптической микроскопии.

Таблица 2.
Альгицидная активность штамма ВКПМ В-9405. Остаточная оптическая плотность через 96 часа инкубации, %NostocAnabaenaMicrocystisCosmariumБез обработки100,0100,0100,0100,0Обработка штаммом ВКПМ В-940510,112,165,165,5

Следует отметить значительную мутность смесей штамма ВКПМ В-9405 с клетками микроводорослей Microcystis и Cosmarium. К завершению процесса их совместного культивирования с заявляемым штаммом наблюдают обесцвечивание этих смесей, первоначально имеющих выраженную окраску.

Цианобактерии Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию заявляемого штамма и обесцвечивание их клеток наступает уже через 2 часа совместного со штаммом ВКПМ В-9405 культивирования. В обоих случаях лизис клеток микроводорослей подтвержден путем микроскопирования.

Пример 2.

Определение спектра действия альгицидного фактора штамма ВКПМ В-9405.

В связи с тем, что измерение оптической плотности смеси морских водорослей Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira со штаммом ВКПМ В-9405 не представлялось возможным из-за высокой мутности полученных суспензий, оценку спектра его антагонистического (альгицидного) действия осуществляют путем регистрации изменения интенсивности окраски смесей микроводорослей и штамма ВКПМ В-9405, происходящей вследствие лизиса клеток микроводорослей.

Следует отметить, что водоросли имеют различный цвет. Однако во всех опытах наблюдалось обесцвечивание смеси водорослей со штаммом ВКПМ В-9405.

Таблица 3.
Спектр альгицидного действия культуральной жидкости штамма ВКПМ В-9405.Таксономический тип водорослейПредпочтительная среда обитания водорослейПервоначальная окраска смесиУровень изменения интенсивности окраски через 96 часов*Anabaenaпресная водасине-зеленый+++Nostocпресная водасине-зеленый+++Microcystis 562пресная водажелто-зеленый+++Microcystis 905пресная водасине-зеленый+++Cosmariumпресная водазеленый++Amphidimumморская водакоричневый++Prorocentrumморская водасветло-зеленый++Thalassiosiraморская водажелто-коричневый+++++ - обесцвечивание смеси; ++ - осветление смеси

Из таблицы 3 следует, что все штаммы водорослей чувствительны к альгицидной активности штамма В-9405, но уровень их чувствительности различен.

Пример 3.

Физико-химическая характеристика альгицидных свойств заявляемого штамма

Альгицидную активность надосадочной жидкости выращенного по стандартной методике штамма ВКПМ В-9405 оценивали по отношению к клеткам микроводоросли Nostoc. Регистрируемая по изменению оптической плотности альгицидная активность сохранялась при прогревания при 80°С в течение 10 минут, а также автоклавировании при 0,8 атмосферах - 5 минут и действии протеолитических ферментов (Таблица 4).

Таблица 4.
Уровень остаточной оптической плотности (ОП) при прогревании и обработке протеазами надосадочной жидкости штамма ВКПМ В-9405.Обработка NostocОстаточная оптическая плотность через 24 часа инкубации, %Без обработки21,7Прогрев 80°С29,5Прогрев 100°С40,7Протеиназа К, 1 мг/мл28,1Проназа Е, 1 мг/мл26,3Трипсин, 1 мг/мл25,5

Пример 4.

Предотвращение развития цианобактерий Nostoc и Anabaena в присутствии штамма ВКПМ В-9405

Показана возможность предотвращения развития микроводорослей, а именно цианобактерий Nostoc и Anabaena в присутствии культуральной жидкости штамма ВКПМ В-9405 (альгистатический эффект).

В конические колбы объемом 20 мл вносили культуры цианобактерий Nostoc или Anabaena и культуральную жидкость штамма ВКПМ В-9405, выращенного как описано ранее (в соотношении 9:1). В контрольные образцы добавляли модифицированную среду BG-11. Общий объем смеси составлял 10 мл.

При наблюдении в течение 14-30 дней роста и развития цианобактерий, контактирующих со штаммом ВКПМ В-9405, не происходило. В контрольных колбах при визуальном наблюдении и путем определения оптической плотности культур наблюдали бурный рост цианобактерий (Таблица 5).

Таблица 5.
Предотвращение развития микроводорослей (альгистатический эффект) Оптическая плотность при 590 нм в исходный моментчерез 1 суткичерез 14 сутокAnabaena + среда0,8000,9301,850Anabaena + B-94050,9600,9200,900Nostoc + среда0,8100,9401,950Nosloc + В-94050,9500,9100,870

Таким образом, показано предотвращающее действие штамма ВКПМ В-9405 на развитие цианобактерий Nostoc и Anabaena.

Пример 5.

Разрушение трехмерных структур цианобактерий ("матов")

Оказана возможность образования "матов" в лабораторных условиях, а также воздействие заявляемого штамма ВКПМ В-9405 на трехмерные структуры цианобактерий Nostoc и Anabaena в высокой концентрации. В процессе дальнейшего культивирования на чашках Петри 1,5-2-месячных культур штаммов цианобактерий, выращенных в описанном режиме, через 3-4 недели наблюдают образование "матов".

В опытные чашки Петри с образовавшимися "матами" цианобактерий вносят по 3 мл культуральной жидкости заявляемого штамма ВКПМ В-9405 путем равномерного распыления по всей поверхности. В контрольные чашки вносят равный объем (3 мл) модифицированной среды BG-11. В опытных чашках через 24 часа наблюдают изменение до светло-желтого цвета трехмерных структур ("матов") цианобактерий, контактирующих со штаммом ВКПМ В-9405. В контрольных чашках при визуальном наблюдении не происходит изменение окраски цианобактерий и "маты" оставались сине-зеленого цвета.

Эти данные подтверждают, что штамм ВКПМ В-9405 оказывает разрушающее воздействие на трехмерные структуры ("маты"), образованные цианобактериями Nostoc и Anabaena в процессе своего развития.

Список литературы

1. Carmical, W.W. J. App. Bacteriol., 1992, т.72. 445-459.

2. Lahti, К., Ahtiainen, J., Rapalla, J., Sivonen, K., Niemela, S.I. Lett. App. Microbiol.,1995, T.21, 109-114.

3. Alam M.Z., Otaki M., Furumai H., Ohgaki S. Water Res., 2001, т.35, 1008-1014.

4. Ahn C.Y., Park M.H., Joung S.H., Kim H.S., Jang K.Y., Oh H.M.Environ Sci Technol., 2003, т.37 (13), 3031-3037.

5. Ahn C.Y., Joung S.H., Jeon J.W., Kim H.S., Yoon B.D., Oh H.M.Biotechnol Lett., 2003 т.14, 1137-1142.

6. Yoshida Т., Takashima Y, Tomaru Y, Shirai Y, Takao Y, Hiroishi S, Nagasaki K. Appl. Environ. Microbiol., 2006, т.72 (2), 1239-1247.

7. Hibayashi R, Imamura N.J Antibiot (Tokyo), 2003, т.56 (2), 154-159.

8. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, т.35 (2), 171-205.

Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405 выделен путем многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287. Штамм обладает альгицидной и альгистатической активностями в отношении микроскопических водорослей. Оценивают альгицидную активность по литическому действию штамма на микроводросли путем определения остаточной оптической плотности (ОПо). ОПо составляет 10,1%. Альгистатическую активность штамма оценивают путем определения оптической плотности. Оптическая плотность составляет 1,950. 5 табл.

Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405, подавляющий и предотвращающий развитие микроскопических водорослей различных таксономических типов.