АЛЬГИЦИДНОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ КУЛЬТУРЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ DUNALIELLA SALINA Российский патент 2023 года по МПК A01N59/20 A01N43/16 A01N35/04 A01P13/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам борьбы с микроскопическими водорослями, а именно к применению комплексных соединений меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов в качестве альгицидного средства, в частности, в отношении культуры микроводорослей Dunaliella salina Teod. (депонирован в IPPAS D-294), которое может найти применение в качестве средства против обрастания дна и цветения воды в искусственных водоемах без нанесения вреда другим живым организмам.

Известно альгицидное средство против сине-зеленых и зеленых микроводорослей (см. патент РФ №2733140 по кл. МПК A01N63/20, опуб. 29.09.2020), содержащее смесь культуральной жидкости кристаллообразующего штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 и целевых добавок, иммобилизованную на гранулах диатомита.

Однако, несмотря на то, что в состав добавок Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 входит бензойная кислота в качестве стабилизатора и консерванта, препятствующая деструкции биологических компонентов и способствующая сохранению всех антагонистических свойств культуральной жидкости, она может приводить к изменению кислородного режима и рН воды, т.е. к резкому изменению экологии водоема, ухудшению условий обитания рыб и других гидробионтов.

Известно также средство для уничтожения водорослей и микроорганизмов в водной среде, в частности, в плавательных бассейнах (см. патент РФ №2400982 по кл. МПК A01N 59/20, опуб. 10.10.2010), содержащее катионы двухвалентной меди в форме соли, растворимой в воде, и неорганическую сульфаминовую кислоту и/или ее соль.

Однако, сульфаниловая кислота обладает рядом недостатков, а именно обладает коррозионной активностью, может вызывать ожоги кожных покровов.

Альгицидная активность обнаружена у вторичных метаболитов пиран-2-она - соланопиронов E, F, G, которые проявили значительную активность в отношении морских одноклеточных водорослей Dunaliella sa., в концентрациях до 100 мкг/мл (см. Goel A. at al. Natural and synthetic 2H-pyran-2-ones and their versatility in organic synthesis // Tetrahedron. - 2009. - V.65. - N.38. - P. 7865-7913).

где R¹=OH, R²=H; (E)

R¹=H, R²=OH; (F)

R¹=H, R²=H (G)

Изобретение направлено на решение проблемы расширения арсенала альгицидных средств, которое может быть использовано в качестве средства против сине-зелёных и зелёных микроводорослей без нанесения вреда другим живым организмам.

Поставленная проблема решается применением комплексов меди(II) на основе арилметиленбиспирн-2-онов формулы

где при n = 4 R=H (1) или R=3-NO₂ (2)

в качестве альгицидного средства против культуры микроводорослей Dunaliella salina Teod.

Комплексные соединения меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов были получены с использованием термической активации (см., например, Pozharov M.V. at al. Synthesis and characterization of copper (II) complexes with arylmethylenebis-4-hydroxy-6-methyl-2-N-pyran-2-ones: A case of interesting keto-enol tautomerism // Inorganica Chimica Acta. - 2021. - V. 517. - P. 120207-120216; и патент РФ № 2753853 по кл. МПК C07F 1/08, опуб. 24.08.2021).

При этом, соединение № 1 - комплекс меди(II) 3,3'-(фенилметилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) синтезирован одностадийным методом в результате двухкомпонентной реакции 3,3'-(фенилметилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) и моногидрата ацетата меди(II) в этаноле при термической активации.

Соединение № 2 - комплекс меди(II) 3,3'-((3-нитрофенил)метилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) синтезирован одностадийным методом в результате двухкомпонентной реакции 3,3'-((3-нитрофенил)метилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) и моногидрата ацетата меди(II) в этаноле при термической активации.

Изобретение иллюстрируется чертежом, на котором представлен график определения концентрации комплексных соединений № 1, 2, вызывающих 50% ингибирования роста культуры микроводорослей Dunaliella salina.

Пример 1.

Тест-объект D. salina условия культивирования.

Для биотестирования использовали культуру микроводорослей Dunaliella salina Teod. (депонирован в IPPAS D-294), полученную из Коллекции микроводорослей и цианобактерий Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Микроводоросли выращивали на среде RAMARAJ Medium D (RMD) (рН 7,5; содержание хлорида натрия 87,7 г/л) (Sathasivam and Juntawong, 2013). Культивирование проводили при 25-30°С под вертикальным, непрерывным освещением дневным белым светом интенсивностью 9000 Лк, и периодическом помешивании для улучшения газообмена. Для поддержания экспоненциальной фазы роста водоросли пересевали 1 раз в 3-4 суток.

Приготовление инокулята водорослей.

Для проведения тестов на фитотоксичность в качестве инокулята использовали клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Инокулят готовили непосредственно перед тестированием, из сток-культуры возрастом 4 дня, содержащей 4-6×10⁶ кл/мл. Для инокулята 400 мкл культуры вносили в 19,6 мл среды RMD, получая концентрацию клеток 14×10⁴ кл/мл (ОП₆₉₀=0,12-0,15). По 150 мкл инокулята вносили многоканальной пипеткой в каждую лунку планшета, содержащую 150 мкл раствора исследуемого комплексного соединения.

Альгицидную активность комплексов меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов определяли в микропланшетах.

Пример 2. Испытание альгицидной активности комплексного соединения 1.

Тест готовили в 96 луночных планшетах с плоскодонными лунками. Общий объем раствора в лунке составлял 300 мкл, из которых 150 мкл приходилось на инокулят, а оставшиеся 150 мкл на раствор комплекса меди(II) 3,3'-(фенилметилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) в ДМСО в концентрации 10 мг/мл (раствор готовили путем растворения 4,3 мг комплекса меди(II) 3,3'-(фенилметилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она в 0,43 мл ДМСО). Каждую концентрацию готовили минимум в трех повторностях. Затем сделан ряд двукратных разведений в диапазоне концентраций от 0,004 мг/мл до 0,15 мг/мл. Планшеты инкубировали в течение 3-х суток при 25-30°С с вертикальным непрерывным освещением дневным белым светом интенсивностью 9000 Лк. Каждые 24 часа оценивали рост водорослей в каждой лунке планшета, по изменению оптической плотности на микропланшетном ридере Multiskan Ascent (Thermo, Финляндия) при λ=690 нм.

Пример 3. Испытание альгицидной активности комплексного соединения 2.

Тест готовили в 96 луночных планшетах с плоскодонными лунками. Общий объем раствора в лунке составлял 300 мкл, из которых 150 мкл приходилось на инокулят, а оставшиеся 150 мкл на раствор комплекса меди(II) 3,3'-((3-нитрофенил)метилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) в ДМСО в концентрации 10 мг/мл (раствор готовили путем растворения 5,7 мг комплекса меди(II) 3,3'-((3-нитрофенил)метилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) в 0,57 мл ДМСО). Каждую концентрацию готовили минимум в трех повторностях. Затем сделан ряд двукратных разведений в диапазоне концентраций от 0,004 мг/мл до 0,15 мг/мл. Планшеты инкубировали в течение 3-х суток при 25-30°С с вертикальным непрерывным освещением дневным белым светом интенсивностью 9000 Лк. Каждые 24 часа оценивали рост водорослей в каждой лунке планшета, по изменению оптической плотности на микропланшетном ридере Multiskan Ascent (Thermo, Финляндия) при λ=690 нм.

В Таблице 1 представлены результаты определения альгицидной активности соединений №1 и №2, для которых графически определены значения EC₅₀ (концентрация соединения, вызывающая 50% ингибирование роста бактериальной культуры).

На чертеже кривая 1 соответствует лункам, содержащим растворы инокулянта водорослей и соединения №1, кривая 2 - лункам, содержащим растворы инокулянта водорослей и соединения №2, кривая 3 - лункам с инокулянтом водорослей без внесения в них растворов соединений №1, №2 (контроль). По линии «контроль 1/2" определены значения EC₅₀ для комплекса меди(II) 3,3'-(фенилметилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она) и комплекса 3,3'-((3-нитрофенил)метилен)бис(4-гидрокси-6-метил-2Н-пиран-2-она).

Таблица 1. Альгицидная активность соединений №1 и №2. №соединения EC₅₀ в отношении Dunaliella salina, мг/мл 1 0,044 2 0,069

Таким образом, комплексы меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов обладают высокой альгицидной активностью по отношению к культуре микроводорослей Dunaliella salina, которая сопоставима с данными альгицидной активности ионов Cu²⁺, представленных в литературе (EC₅₀ составляет в среднем 0,050 мг/мл).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к средствам борьбы с микроскопическими водорослями, а именно к применению комплексных соединений меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов. Комплекс меди(II) на основе арилметиленбиспирн-2-онов формулы

,

где n=4, R=H (1) или R=3-NO₂, применяют в качестве альгицидного средства против культуры микроводорослей Dunaliella salina Teod (депонирован в IPPAS D-294). Применение комплекса меди(II) на основе арилметиленбиспирн-2-онов, предложенной формулы, расширяет арсенал альгицидных средств против обрастания дна сине-зелёными и зелёными микроводорослями и цветения воды в искусственных водоёмах без нанесения вреда другим живым организмам. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Применение комплексных соединений меди(II) на основе арилметиленбиспиран-2-онов формулы

,

где при n = 4 R=H (1) или R=3-NO₂ (2)

в качестве альгицидного средства против культуры микроводорослей Dunaliella salina Teod IPPAS D-294.