НАНОКОМПОЗИТНЫЙ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ МЕТОДА ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ Российский патент 2008 года по МПК A61K41/00 A61P35/00 C01B31/02 C01B33/02 

Область техники

Изобретение относится к областям медицины и биологии и может быть использовано в методе фотодинамической терапии онкологических заболеваний.

Уровень техники

Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой метод локальной активации светом фотосенсибилизатора, находящегося в непосредственной близости от объекта воздействия - клеток раковой опухоли. В присутствии молекулярного кислорода в тканях происходит развитие фотохимической реакции, поражающей опухолевые клетки. Метод ФДТ выгодно отличается от традиционной лучевой и лекарственной терапии рака высокой избирательностью поражения опухолевой ткани, отсутствием тяжелых местных и системных осложнений и возможностью повторения лечебной процедуры. Дополнительное достоинство метода - принципиальная возможность сочетания в одной процедуре лечения и диагностики опухолевого процесса по флуоресценции фотосенсибилизатора или продуктов фотохимической реакции.

Сущность механизма ФДТ в ее классической реализации состоит в следующем. Молекула фотосенсибилизатора, поглотив квант света, переходит в триплетное (возбужденное) состояние и может вступить в химические реакции двух типов. При первом типе реакций происходит взаимодействие возбужденной молекулы непосредственно с молекулами биологического субстрата, что в конечном итоге приводит к образованию свободных радикалов. Во втором случае происходит взаимодействие возбужденного фотосенсибилизатора с молекулой триплетного (обычного) кислорода, присутствующего в клетках тканей, с образованием синглетного кислорода. В обоих случаях образующиеся продукты фотохимической реакции оказывают угнетающее действие на клетки, вызывая их последующую гибель.

Главным компонентом в ФДТ является вещество-фотосенсибилизатор, запасающее поглощенную световую энергию в своем возбужденном состоянии и затем передающее эту энергию другим молекулам (в том числе, кислорода). К этому веществу предъявляются следующие требования:

1. Высокая эффективность фотосенсибилизации. Эта способность может быть охарактеризована квантовым выходом генерации синглетного кислорода, то есть вероятностью генерации молекулы синглетного кислорода при поглощении молекулой сенсибилизатора кванта света. Для достижения терапевтического эффекта требуются достаточно высокие концентрации сенсибилизатора в живой ткани, поэтому сенсибилизатор должен обладать малой степенью концентрационного тушения заселенности своего триплетного (возбужденного) состояния.

2. Совместимость с тканями и биологическими жидкостями организма (то есть безвредность для организма в своем неактивированном состоянии). Вещество также должно естественным образом выводиться из организма, причем продукты разложения данного вещества также не должны являться токсичными.

3. Селективность сенсибилизатора. Важно обеспечить избирательное накопление фотосенсибилизатора в опухолевой ткани, тем самым, предотвращая их рассеяние в здоровых клетках организма и уменьшая нежелательные побочные эффекты.

4. Устойчивость агента воздействия к разрушению продуктами реакции (минимизация процесса «отбеливания» фотосенсибилизатора).

5. Простота приготовления материала, следовательно, дешевая и эффективная технология производства при его массовом получении.

В настоящее время в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ широко применяются молекулы красителей природного и синтетического происхождения. Использование красителей первого и второго поколений (производные порфиринов, фталоцианины, хлорины и др.) имеет ряд хорошо известных недостатков, главными из которых являются малый квантовый выход и сложность очистки организма от использованного красителя из-за медленного выведения препарата, токсическое действие на организм самих красителей и продуктов их распада.

Вследствие отмеченных недостатков были предложены иные однокомпонентные фотосенсибилизаторы, в основном удовлетворяющие требованию безвредности для организма.

В патенте US 5866316, 02.02.1999 в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ предложено использовать молекулы фуллерена С₆₀. Фуллерены характеризуются предельно высокой эффективностью генерации синглетного кислорода при световом облучении (близкой к 100%: J.W.Arbogast, A.P.Darmanyan, C.S.Foote et al. // J. Phys. Chem. 95, 11 (1991)), не токсичны и не распадаются на токсичные составляющие. Недостатком предложенного решения является то, что фуллерены С₆₀ не растворимы в воде, и суспензии фуллеренов в воде и водных растворах неустойчивы: фуллерены имеют тенденцию к агрегации, причем скорость этого процесса резко увеличивается при повышении концентрации фуллеренов. Агрегация молекул фуллерена ставит предел получению достаточных для терапевтического эффекта концентраций ввиду эффекта концентрационного тушения.

В заявке на патент RU 2002132213, 27.07.2004 предложено в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ использовать полиэдральную многослойную углеродную наноструктуру «астрален», описанную в заявке на патент RU 2000124887, 20.10.2002. Повышенная, по сравнению с фуллеренами, устойчивость данного материала при световом воздействии рассматривается как его основное положительное качество. Отмечается также повышенная по сравнению с фуллеренами устойчивость водных суспензий астралена. Однако квантовая эффективность генерации синглетного кислорода для данного материала существенно меньше, чем у фуллерена (в два раза). Не исключаются и другие недостатки, присущие фуллеренам, например концентрация астралена в суспензии находится в пределах 0,5-0,002% по весу, что ограничивает дозировку фтосенсибилизатора в препарате.

В патенте JP 20020176515, 18.06.2002 описывается фотосенсибилизатор для генерации синглетного кислорода на основе кремниевых нанокристаллов, в частности, объединенных в матрицу пористого кремния. Поглощение возбуждающего излучения происходит в нанокристалле, приводя к образованию в нем связанной электрон-дырочной пары (экситона). Энергия экситона может быть передана безызлучательным способом молекуле кислорода в триплетном состоянии, находящейся вблизи поверхности нанокристалла, переводя ее в возбужденное синглетное состояние. Авторы патента не оценивают квантовую эффективность генерации синглетного кислорода. Если предложенный авторами механизм процесса генерации синглетного кислорода справедлив, то следует ожидать максимальную квантовую эффективность для указанного материала 10%, что существенно ниже, чем у молекулы фуллерена. О возможности использования нанокристаллов кремния в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ упоминается в работе (В.Ю.Тимошенко, А.А.Кудрявцев, Л.А.Осминкина и др. // Письма в ЖЭТФ 83, вып.9, с.492-495 (2006)).

В связи с возможным использованием кремниевых нанокристаллов, находящихся в матрице пористого кремния, в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ, следует отметить безвредность пористого кремния и продуктов его переработки для организма. Последнее утверждение базируется на данных патента US 6666214, 28.09.2001, где содержится описание фармацевтических изделий из пористого и поликристаллического кремния и методов производства таких изделий. В патенте заявляется возможность их использования для доставки лекарственных препаратов внутрь организма с дозированным во времени выделением препарата, подчеркивается отсутствие вреда для организма. Другим положительным качеством пористого кремния является низкая стоимость его производства.

Для решения проблем, связанных с недостаточно высокой квантовой эффективностью фотосенсибилизаторов на красителях, был предложен ряд решений, основанных на использовании композитных материалов.

Пример композитного фотосенсибилизатора на основе красителей описан в патенте US 4579837, 22.10.84. Описываемый фотосенсибилизатор содержит один или несколько слоев органического поликристаллического твердофазного красителя, который поглощает энергию внешнего излучения для генерации триплетных экситонов. В случае применения нескольких слоев энергии триплетных состояний в слоях уменьшаются в сторону внешней границы, покрытой субмолекулярным (не сплошным способом) слоем органических молекул. Указанный субмолекулярный слой имеет энергию триплетного состояния меньшую, чем у смежного слоя твердого красителя, но большую чем у молекулярного синглетного кислорода в низшем энергетическом состоянии. Таким образом, субмолекулярный слой аккумулирует энергию экситонов на поверхности сенсибилизатора для реакции с молекулярным кислородом, находящимся в основном состоянии над поверхностью. Следует отметить использование различных агентов для обеспечения эффективного поглощения энергии возбуждающего излучения и аккумуляции и передачи энергии триплетному молекулярному кислороду, что по теоретической оценке заявителей должно приводить к существенному выигрышу в эффективности сенсибилизатора по сравнению с однокомпонентным аналогом (по оценке авторов патента около 100 раз). Однако авторы патента не приводят ни одного описания технологии для практического осуществления изобретения. Указанный композит предназначен для генерации синглетного кислорода в газовой фазе, и патент не предусматривает возможности изготовления частиц или иных подходящих для ФДТ форм препарата.

В заявке на патент US 20020127224, 12.09.2002 описываются композиты и методы их создания для использования в ФДТ, имеющие в составе светоизлучающие наночастицы, которыми могут быть квантовые точки, нанокристаллы, квантовые нити или же смесь указанных наночастиц. Наночастицы поглощают свет внешнего источника с определенной длиной волны (например, лазера), который в силу различных причин неэффективен для возбуждения активного компонента (фотосенсибилизатора), и переизлучают свет с другой длиной волны (или в полосе длин волн), расположенной в полосе поглощения фотосенсибилизатора. При этом предполагается, что энергии переизлучаемых фотонов могут быть как меньше, так и превосходить энергии фотонов первичного источника света, то есть допускается многофотонное поглощение. Наночастицы могут быть химически соединены или не соединены с активным компонентом для ФДТ, но должны быть локализованы в месте воздействия. Таким образом, рассматриваемый здесь способ возбуждения фотосенсибилизатора предусматривает передачу энергии от первичного источника возбуждения фотосенсибилизатору посредством переизлучения. Однако такой способ доставки энергии к фотосенсибилизатору следует признать неэффективным по причинам: а) потери при переизлучении в отдельной наночастице (квантовый выход фотолюминесценции меньше единицы); б) потери, связанные с высокой вероятностью ухода испущенного наночастицей фотона из-за низкой концентрации молекул фотосенсибилизатора. Кроме того, многофотонное поглощение эффективно только при высокой плотности фотовозбуждения, что в процедуре ФДТ приводит к нежелательной световой нагрузке на живые ткани. С другой стороны, известно, что глубина проникновения света в ткани организма уменьшается для коротких длин волн. Тогда, учитывая неизбежные потери энергии, связанные с переизлучением света, становится очевидной малая эффективность предлагаемого решения.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является нанокомпозитный фотосенсибилизатор, предложенный в заявке на патент US 20050058713, 17.03.2005. Указанная заявка описывает фотосенсибилизированные металлические наночастицы (термин «металлический» в данном случае относится к металлам, оксидам металлов и другим содержащим металлы композициям) и методы создания таких наночастиц. Эти наночастицы предлагаются для использования в фотодинамической терапии. Изобретение предусматривает, например, нанесение самоорганизованных монослоев молекул фталоцианина, когда монослой формируется на поверхности металлической наночастицы. Функционально сенсибилизированная наночастица содержит: металлическое ядро; монослой фотосенсибилизатора, химически связанный с указанным ядром, указанный монослой содержит молекулы, способные при фотовозбуждении продуцировать активные кислородные соединения, такие как синглетный кислород из молекул триплетного кислорода; промежуточный реагент для связывания сенсибилизатора с ядром. Такие наночастицы позволяют достичь, по утверждению авторов, более высокой квантовой эффективности генерации синглетного кислорода по сравнению с одиночной молекулой фотосенсибилизатора. Следует отметить, что наноразмерное «металлическое» ядро несет вспомогательную функцию и прямо не участвует в процессах поглощения света и передачи энергии фотосенсибилизатору. Вещества, из которых может состоять ядро, либо обладают высокой проводимостью (металлы и металлические композиции), либо являются широкозонными (оксиды металлов): в первом случае световая энергия оптического возбуждения полностью поглощается в ядре и не передается фотосенсибилизатору, во втором случае существенного поглощения света не происходит. Эффект самоорганизации молекул красителей не способен привести к существенному выигрышу в квантовой эффективности по сравнению с одиночными молекулами, если не обеспечивает достаточную удаленность этих молекул друг от друга для уменьшения концентрационного тушения. Ввиду того, что молекулы красителя находятся на внешней поверхности частиц, которые не предполагаются пористыми, следует ожидать, что данный композит будет близок по токсичности к используемым в настоящее время препаратам на основе красителей.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание нанокомпозитного фотосенсибилизатора для генерации синглетного кислорода для ФДТ, имеющего более высокую эффективность генерации синглетного кислорода по сравнению с кремниевыми нанокристаллами, более высокую устойчивость к агрегации в водных растворах по сравнению с фуллеренами, нетоксичного для организма человека и имеющего простую технологию изготовления.

Задача изобретения решается путем применения в качестве фотосенсибилизатора нанокомпозита, представляющего собой порошок из частиц пористого кремния, содержащих кремниевые кристаллы с размерами от 2 до 4 нм с адсорбированными на поверхности кристаллов молекулами фуллерена (например, С₆₀ или С₇₀), при относительном содержании фуллеренов в нанокомпозите от 0,3 до 4% по весу. Далее порошок может быть использован в ФДТ, например, в виде суспензии в воде или физиологической жидкости.

Технический эффект изобретения по сравнению с ближайшим аналогом US 20050058713, 17.03.2005 и патентом US 4579837, 22.10.84 заключается в безвредности препарата фотосенсибилизатора для организма, что достигается использованием нетоксичных компонентов: нанокристаллов кремния в составе частиц пористого кремния и молекул фуллерена.

Технический эффект изобретения по сравнению с JP 20020176515, 18.06.2002 заключается в более высокой эффективности генерации синглетного кислорода, что возможно благодаря использованию молекул фуллерена в качестве эффективного генератора синглетного кислорода, причем энергия, необходимая для генерации, поставляется из нанокристалла, на котором адсорбирована молекула фуллерена. Общее между данным патентом и настоящим изобретением состоит в использовании нанокристаллов кремния для поглощения энергии возбуждающего излучения.

Технический эффект изобретения по сравнению с US 5566316, 02.02.1999 и RU 2002132213, 27.07.2004 заключается в большей устойчивости фотосенсибилизатора, в т.ч. к облучению светом, связанной с пространственным разделением адсорбированных нанокристаллами молекул фуллерена, что препятствует их агрегации.

Технический эффект изобретения по сравнению с US 20020127224, 12.09.2002 заключается в более высокой квантовой эффективности благодаря более эффективному электронному механизму передачи энергии светового возбуждения, поглощенного в кремниевых нанокристаллах, молекуле фуллерена, непосредственно генерирующей синглетный кислород.

Физический принцип функционирования предложенного нанокомпозита как фотосенсибилизатора заключается в следующем. Возбуждающее излучение генерирует в кремниевых нанокристаллах связанные электрон-дырочные пары (экситоны). В присутствии адсорбированной на поверхности нанокристалла молекулы фуллерена в основном состоянии энергия аннигиляции экситона может быть передана молекуле фуллерена безызлучательным способом, переводя ее в возбужденное синглетное состояние. Далее благодаря спин-орбитальному взаимодействию в молекуле фуллерена весьма вероятно заселение нижележащего долгоживущего триплетного уровня. Обратный переход молекулы фуллерена в основное состояние путем излучательного процесса имеет очень низкую вероятность. Запасенная таким образом молекулой фуллерена энергия в триплетном состоянии может быть с высокой эффективностью передана триплетной молекуле кислорода, находящейся вблизи молекулы фуллерена, переводя ее в синглетное состояние (так называемый синглетный кислород).

Возможность эффективного накопления энергии возбуждающего излучения в кремниевых нанокристаллах, находящихся в составе пористого кремния, в форме долгоживущих экситонных состояний, связана с квантово-размерным эффектом. Данный эффект проявляется также в яркой видимой фотолюминесценции пористого кремния, наблюдаемой в том числе и при комнатных температурах. Согласно литературным данным размеры нанокристаллов, в которых имеет место указанный эффект, составляют от 2 до 4 нм, а их наличие в пористом кремнии может контролироваться люминесцентными методами.

Для применения в ФДТ на живом организме, например при внутривенном введении суспензии порошка предложенного кремний-фуллеренового нанокомпозита, частицы пористого кремния с адсорбированными молекулами фуллерена должны иметь размер не более 100 нм для обеспечения их транспорта и проникновения в ткани.

Осуществление изобретения

Получение пористого кремния с контролируемым распределением размеров нанокристаллов осуществляется с помощью технически простого и недорогого метода анодного электрохимического травления кремниевой монокристаллической пластины в 25% растворе HF:C₂H₅OH при постоянной плотности тока. Последняя выбирается с учетом уровня легирования, ориентации и типа проводимости монокристаллической подложки для получения нанокристаллов необходимого размера, и составляет в среднем 25 мА/см². Кратковременным (на несколько секунд) повышением плотности тока на порядок пленка пористого кремния отделяется от подложки. Контроль размеров нанокристаллов осуществляется с помощью люминесцентной методики по результатам высвечивания квантоворазмерных осцилляторов при ультрафиолетовом возбуждении. В дальнейшем пористая пленка подвергается механическому измельчению в среде неокисляющего органического растворителя (например, четыреххлористого углерода) и фильтрации суспензии для выделения частиц пористого кремния размером менее 100 нм. Далее порошок высушивается и подвергается обработке в растворе фуллеренов в неполярном органическом растворителе (например, в четыреххлористом углероде), в процессе чего происходит адсорбция молекул фуллерена на поверхности нанокристаллов.

Получение фуллеренов С₆₀ или C₇₀ является в настоящее время технологически хорошо отработанной операцией, осуществляемой в широких масштабах, в связи с чем себестоимость данного материала имеет уверенную тенденцию к снижению.

Импрегнирование частиц пористого кремния фуллеренами осуществляется в растворе фуллеренов в CCl₄ с концентрацией 3 мкг фуллеренов на 1 мг частиц пористого кремния с последующим выпариванием растворителя. Полученное указанным способом вещество может быть использовано далее в виде суспензии в воде или физиологическом растворе в качестве фотосенсибилизатора в ФДТ.

На чертеже показано изменение численности популяции раковых клеток в количестве 15 мкг (культура НТ-1080 - фибросаркома человека) в зависимости от времени после светового облучения при проведении курса ФДТ in vitro. Кривые 1,2,3 соответствуют изменениям численности трех идентичных популяций раковых клеток, подвергшихся световому облучению в течение 1 часа. Кривая 1 получена для популяции клеток в физиологическом растворе без добавления фотосенсибилизатора, кривая 2 - для популяции с добавлением в качестве фотосенсибилизатора 1 мг порошка пористого кремния, кривая 3 - для популяции с добавлением кремний-фуллеренового нанокомпозита (масса пористого кремния 1 мг, фуллеренов 3 мкг). Из чертежа видно, что в случае отсутствия фотосенсибилизатора численность популяции убывает незначительно за время наблюдения, и это изменение может быть объяснено естественной убылью клеток. В случае присутствия фотосенсибилизатора за время наблюдения уменьшение численности популяции по сравнению с контрольной популяцией (кривая 1) составило ˜70% для пористо-кремниевого фотосенсибилизатора и ˜80% для кремний-фуллеренового фотосенсибилизатора. Следует отметить, что начальная стадия гибели раковых клеток (˜36 часов) ярче выражена для кремний-фуллеренового нанокомпозита в отличие от однокомпонентного пористо-кремниевого фотосенсибилизатора, для которого наблюдается задержка действия на указанном промежутке. Немедленный терапевтический эффект свидетельствует о существенно более высоком темпе генерации синглетного кислорода, обеспечиваемого кремний-фуллереновым нанокомпозитом.

Проведенные эксперименты с вариацией относительного содержания фуллеренов в нанокомпозите от 0,3 до 4% по весу (на 100% массы частиц пористого кремния) показали существенный рост эффективности воздействия при увеличении концентрации фуллеренов.

Изобретение относится к областям медицины и биологии и может быть использовано в методе фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний. В качестве нанокомпозитного фотосенсибилизатора предлагается порошок, состоящий из частиц пористого кремния, включающих кремниевые кристаллы с размерами от 2 до 4 нм с адсорбированными на поверхности кристаллов молекулами фуллерена (например, С₆₀ или С₇₀), при относительном содержании фуллеренов в нанокомпозите от 0,3 до 4% по весу. Порошок может быть использован в ФДТ, например, в виде суспензии в воде или физиологической жидкости. Фотосенсибилизатор обладает высокой эффективностью генерации синглетного кислорода, имеет высокую устойчивость к агрегации в водных растворах, нетоксичен для организма. 4 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Нанокомпозитный фотосенсибилизатор для метода фотодинамического воздействия на клетки, отличающийся тем, что в качестве нанокомпозита используется порошок, состоящий из частиц пористого кремния, включающих кремниевые кристаллы с размерами от 2 до 4 нм с адсорбированными на поверхности кристаллов молекулами фуллерена, например, С₆₀ или С₇₀, при относительном содержании фуллеренов в нанокомпозите от 0,3 до 4% по весу.2. Фотосенсибилизатор по п.1, отличающийся тем, что получение указанного порошка осуществляется методом анодного электрохимического травления кремниевой монокристаллической пластины в растворе плавиковой кислоты, с последующим отделением пленки пористого кремния, ее высушиванием и измельчением на частицы пористого кремния.3. Фотосенсибилизатор по п.1, отличающийся тем, что частицы пористого кремния имеют размеры не более 100 нм.4. Фотосенсибилизатор по п.1, отличающийся тем, что импрегнирование молекул фуллерена в частицы пористого кремния происходит в растворе фуллеренов в неполярном органическом растворителе, например, четыреххлористом углероде, с последующим выпариванием последнего.5. Фотосенсибилизатор по п.1, отличающийся тем, что указанный порошок применяется в виде суспензии в воде или физиологическом растворе.