Фотосенсибилизатор на основе полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6 Российский патент 2017 года по МПК A61K33/00 

Изобретение относится к области противоопухолевых средств, в частности к лекарственным препаратам, совмещающим неорганические и органические активные ингредиенты, которые могут быть использованы для диагностики и терапии онкологических заболеваний.

Известен широкий круг лекарственных препаратов на основе органических фотосенсибилизаторов для лечения и диагностики онкозаболеваний: «Фотосенсибилизатор и способ его получения» (Патент РФ №2183956 С1, МПК А61K 31/409, А61Р 35/00, заявка 2001108397/14, дата публикации 27.06.2002, дата подачи заявки 30.03.2001, «Препарат для фотодинамической терапии злокачественных новообразований» (Патент РФ №2145221, МПК А61K 31/40, А61K 47/42, заявка 96115788/14, дата публикации 10.02.2000, дата подачи заявки 30.07.1996), «Препарат для фотодинамической терапии» (Патент РФ №2146144, МПК А61K 31/675, А61K 31/40, заявка 97102060/14, дата публикации 10.03.2000, дата подачи заявки 11.02.1997), «Средство для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний» (Патент РФ №2152790, МПК G01N 33/52, А61K 31/79, заявка 99110071/14, дата публикации 20.07.2000, дата подачи заявки 12.05.1999). Основным компонентом данных препаратов являются органические фотосенсибилизаторы, принцип действия которых основан на их способности накапливаться в трансформированных клетках, эффективно поглощать свет определенной длины волны и передавать энергию фотовозбуждения к окружающим их молекулам кислорода. В результате этого молекулы кислорода оказываются в возбужденном синглетном состоянии и способны эффективно окислять окружающие их ткани, что приводит к деструкции трансформированных клеток. Следует отметить, что органические фотосенсибилизаторы обладают целым рядом недостатков:

1. Сложность синтеза и очистки соединений;

2. Невысокая селективность накопления фотосенсибилизатора в трансформированных клетках (т.н. онкотропность);

3. Темновая и световая цитотоксичность;

4. Быстрое проникновение и выведение из клеток;

5. Медленное выведение из организма.

В связи с этим актуальной задачей является поиск новых подходов к созданию лекарственных препаратов для фотодинамической терапии (ФДТ), которые бы позволили повысить ее эффективность и уменьшить действие побочных эффектов.

Одним из современных подходов в области разработки новых лекарственных препаратов для ФДТ является создание комплексов с участием органических фотосенсибилизаторов и наночастиц. Данный подход использует принцип увеличения концентрации фотосенсибилизатора в опухоли за счет использования наночастиц в качестве доставщика. Известен патент «Противораковые наночастицы с усиленной целевой специфичностью и способ их получения» (Патент США № US 20150290332 А1, МПК А61K 31/555, А61K 47/36, А61Р 35/00, А61K 9/16, заявка US 14/436,276, дата публикации 15.10.2015, дата приоритета 02.05.2013), в котором в качестве основы для наночастиц используется сывороточный альбумин, к поверхности которого нековалентно присоединены молекулы порфирина. Таким образом, в изобретении увеличение концентрации фотосенсибилизатора в клетках достигается за счет использования сывороточного альбумина как доставщика к раковым клеткам одновременно нескольких молекул порфирина. Недостатками данного подхода являются: 1) селективность накопления молекул порфирина в трансформированных клетках определяется свойствами самого порфирина, т.е. не имеет преимуществ перед использованием свободных молекул порфирина; 2) велика вероятность десорбции молекул порфирина с поверхности сывороточного альбумина в процессе транспортировке данных наночастиц к трансформированным клеткам; 3) условия фотовозбуждения строго определяются свойствами только молекул порфирина. Известен патент «Композиция и способ ее изготовления для доставки фотосенсибилизатора» (Патент США № US 20040047913 А1, МПК А61K 41/00, заявка US 10/440,505, дата публикации 11.03.2004, дата приоритета 16.05.2002). Согласно изобретению, для доставки гидрофобных фотосенсибилизаторов порфиринового ряда к трансформированным клеткам используются полимерные наночастицы размером порядка 200 нм. В присутствии сывороточного альбумина происходит высвобождение молекул фотосенсибилизатора из полимерных наночастиц, дальнейшая доставка молекул фотосенсибилизатора к трансформированным клеткам осуществляется с участием сывороточного альбумина. В данном изобретении решена задача применения гидрофобных фотосенсибилизаторов для ФДТ, однако ему присущи все недостатки изобретения, изложенного в патенте «Противораковые наночастицы с усиленной целевой специфичностью и способ их получения».

Другим широко распространенным подходом в изготовлении новых лекарственных препаратов для ФДТ на основе органических фотосенсибилизаторов является использование их комплексов с наночастицами, которые помимо доставки фотосенсибилизатора в опухоль могут выполнять роль эффективного донора энергии фотовозбуждения. Коллоидные полупроводниковые квантовые точки (КТ) являются сегодня наиболее распространенным типом таких наночастиц (Jun Yao et al. Chem. Rev. 2014, 114 6130). Особенностью КТ является зависимость длины волны их люминесценции от размера нанокристалла, способность поглощать свет в широком спектральном диапазоне, высокая фотостабильность и высокий квантовый выход люминесценции, что делает их эффективными донорами энергии фотовозбуждения (Efros, A.L., D.J. Lockwood, et al. Semiconductor Nanocrystals: From Basic Principles to Applications, Springer, 2003). Ряд работ показывает, что комплексы квантовых точек с фотосенсибилизаторами способны заметно увеличить фотодинамический эффект, приводящий к гибели раковых клеток, как за счет эффективной передачи энергии, так и за счет увеличения внутриклеточной концентрации фотосенсибилизатора. Известен способ использования КТ для повышения эффективности фотосенсибилизаторов «Использование фотолюминесцентных наночастиц для фотодинамической терапии» (Патент США № US 20020127224 A1, МПК А61K 39/44, А61K 41/00, заявка US 10/091144, дата публикации 12.09.2002, дата приоритета 2.03.2001), в котором квантовые точки возбуждаются внешним источником света, который хорошо проникает в ткани, а затем КТ излучают свет, который активирует фотосенсибилизатор. При этом авторами было предложено использование КТ нескольких размеров, что позволяет возбуждать различные фотосенсибилизаторы и позволяет комбинировать их при лечении. Однако при таком подходе эффективность возбуждения фотосенсибилизатора квантовыми точками может быть достаточно низка, т.к., во-первых, при введении КТ в организм человека может существенно снижаться квантовый выход люминесценции КТ, во-вторых, для эффективного фотовозбуждения фотосенсибилизатора, необходимо чтобы КТ и фотосенсибилизатор оказались максимально близко друг к другу, что влечет использование высоких терапевтических доз КТ и фотосенсибилизаторов.

Наиболее близок к предлагаемому изобретению и принят в качестве прототипа «Фотосенсибилизатор, содержащий ковалентно связанные комплексы квантовых точек и производных хлорина для лечения и диагностики рака и фотодинамической терапии» (Патент № WO 2010151074 А2, А61K 33/24, А61K 31/409, А61K 49/06, А61Р 35/00, заявка PCT/KR 2010/004134, дата публикации 19.05.2011, дата приоритета 26.06.2010). Согласно описанию к патенту фотосенсибилизатор представляет собой квантовые точки, ковалентно связанные в комплекс с производными хлорина е6. В данном комплексе реализуется безызлучательный резонансный перенос энергии (FRET) от КТ к молекулам, производным хлорина, который приводит к сенсибилизации генерации ими синглетного кислорода. Такой фотосенсибилизатор обладает рядом преимуществ:

1. Использование ковалентного связывания КТ и хлорина е6 в комплекс обеспечивает стабильность комплексов и малые расстояния между КТ и хлорином е6. Это позволяет снизить терапевтическую дозу препарата за счет сенсибилизации фотодинамического эффекта хлорина е6 квантовыми точками;

2. Существенно расширен спектральный диапазон излучения, которое активирует комплексы;

3. Благодаря большим сечениям поглощения в полупроводниковых квантовых точках для активации комплексов можно эффективно использовать двух- и трехфотонное возбуждение, которое спектрально соответствует области прозрачности биологических тканей;

4. Поверхность КТ может быть использована для присоединения специальных молекул доставщиков, которые увеличивают селективность накопления комплексов в трансформированных клетках.

Однако прототип имеет следующие недостатки:

1. Формирование комплексов проводится в водных средах, в которых органические фотосенсибилизаторы и, в особенности, хлорин е6, характеризуются плохой стабильностью и склонны к образованию агрегатов. Это приведет к значительному снижению эффективности активации молекул кислорода и, как результат, к уменьшению ФДТ эффекта и к увеличению терапевтических доз препарата. Следует отметить, что агрегация фотосенсибилизатора может приводить к полной потере способности фотосенсибилизатора активировать молекулы кислорода, т.е. к полной потере функциональности препарата. Обращает на себя внимание тот факт, что вопросам агрегации органических фотосенсибилизаторов в составе комплексов с наночастицами, и в частности с КТ, практически не уделяется внимания ни в одном из рассмотренных патентов.

2. Для увеличения селективности накопления комплексов в опухоли предлагается использовать специальные молекулы. При таком подходе речь по сути идет о создании сложной, трехкомпонентной структуры, усложнение методов формирования и очистки которой приведут к резкому повышению себестоимости конечного лекарственного препарата на основе таких комплексов. Также следует отметить, что в случае использования антител в качестве агентов адресной доставки возникают определенные сложности, которые обусловлены строгим специфическим их взаимодействием с определенным антигеном. В первую очередь недостатки использования антител связаны с большой степенью гетерогенности реальных опухолей. Это приводит к сложности подбора единого антигена, достаточно хорошо экспрессированного для всей опухоли. Также следует отметить, что антитела представляют собой большие белковые молекулы, которые достаточно трудно проникают как вглубь опухоли, так и внутрь трансформированных клеток. В последнем случае, когда антитело остается на поверхности клетки, резко возрастает вероятность активизации иммунной системы и, как следствие, выработки антител на данные антитела.

Задачей данного изобретения является повышение эффективности фотодинамического эффекта в трансформированных клетках за счет сохранения фотофизических свойств мономерной формы хлорина е6 в комплексах с квантовыми точками и присутствия на поверхности КТ энантиомеров хиральных молекул стабилизаторов, что обеспечивает увеличение селективности накопления предлагаемого фотосенсибилизатора в трансформированных клетках.

Поставленная задача достигается тем, что формируется фотосенсибилизатор на основе полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6, состоящий из ковалентно связанных комплексов хиральных полупроводниковых квантовых точек группы А2В6 и молекул хлорина е6 в мономерной форме, характеризующийся возможностью селективного накопления в трансформированных клетках за счет наличия на поверхности полупроводниковых квантовых точек энантиомера хиральной молекулы.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что формирование комплексов осуществляется в результате ковалентного связывания в комплекс хиральных полупроводниковых квантовых точек с молекулами хлорина е6 в мономерной форме в диметилсульфоксиде. После формирования комплексов происходит их очистка и концентрирование, затем полученный концентрированный раствор комплексов вводится в водный раствор. В результате облучения комплексов КТ/Се6 светом с длиной волны, которая эффективно ими поглощается, комплексы переходят в возбужденное состояние, в котором при взаимодействии с молекулами кислорода способны переводить их в активную синглетную форму.

Селективность накопления предлагаемого фотосенсибилизатора в трансформированных клетках достигается за счет стереоспецифического взаимодействия энантиомера хиральной молекулы на поверхности КТ, которое будет усиливать онкотропные свойства молекул Се6, входящих в состав данных комплексов.

Предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества:

1. Формирование комплексов полупроводниковых квантовых точек с молекулами хлорина е6 осуществляется в диметилсульфоксиде, что обеспечивает наличие в комплексах только мономерной формы хлорина е6 и, как следствие, его максимальную эффективность в качестве генератора синглетного кислорода при использовании предлагаемого фотосенсибилизатора в ФДТ.

2. Формирование комплексов, в которых с квантовой точкой связываются сразу несколько молекул хлорина е6 в мономерной форме, позволяет существенно увеличить ФДТ-эффект и, как следствие, снизить терапевтическую фотосенсибилизатора.

3. Использование в комплексах хиральных квантовых точек позволяет увеличить селективность накопления комплексов в трансформированных клетках без технического усложнения методики формирования и очистки комплексов по сравнению с использованием специальных молекул, выступающих в качестве агентов адресной доставки. Это техническое решение позволяет существенно упростить процедуру формирования предлагаемого фотосенсибилизатора, что, в свою очередь, увеличивает его стабильность и уменьшает себестоимость.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется на фиг. 1-11, на которых представлены:

Фиг. 1. Спектры кругового дихроизма CdSe/ZnS КТ, стабилизированных L-, D-гистидином и ТОРО (кривые 1, 2 и 3 соответственно), а также спектр поглощения CdSe/ZnS КТ.

Фиг. 2. Спектры поглощения активированного 1,3-дициклогексилкарбодиимидом хлорина е6 (1), CdSe/ZnS КТ, стабилизированных L-гистидином, (2) и их комплексов (3) в эквимолярных концентрациях в ДМСО.

Фиг. 3. Спектры кругового дихроизма Се6 (1), CdSe/ZnS КТ, стабилизированных L-гистидином, (2) и их комплексов (3) в ДМСО.

Фиг. 4. Спектры люминесценции CdSe/ZnS КТ (1), Се6 (2) и их комплексов (3) в ДМСО, длина волны возбуждающего света 450 нм.

Фиг. 5. Спектры возбуждения люминесценции Се6 (1), комплексов CdSe/ZnS КТ с 1, 2 и 5 молекулами Се6 в комплексах (2-4) и спектр поглощения КТ (5) в дистилляте. Длина волны регистрации люминесценции 680 нм.

Фиг. 6. Зависимость интенсивности люминесценции в максимуме полосы люминесценции химического сенсора на синглетный кислород SOSG (525 нм) от времени облучения светом с длиной волны 450 нм в присутствии эквимолярных концентраций Се6 (1), CdSe/ZnS КТ (2) и их комплексов (3).

Фиг. 7. Зависимость интенсивности люминесценции в максимуме полосы люминесценции SOSG (525 нм) от времени облучения светом с длиной волны 450 нм в присутствии комплексов КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована разными молекулами.

Фиг. 8. Зависимость внутриклеточной концентрации Се6 от времени инкубирования образцов живых клеток АКЭ комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована L-гистидином или D-гистидином.

Фиг. 9. Зависимость внутриклеточной концентрации Се6 от времени инкубирования образцов живых клеток АКЭ комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована L-цистеином или D-цистеином.

Фиг. 10. Результаты ФДТ теста на живых клетках АКЭ, инкубированных с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована L-гистидином или D-гистидином.

Фиг. 11. Результаты ФДТ теста на живых клетках АКЭ, инкубированных с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована L-цистеином или D-цистеином.

Пример 1. В комплексах коллоидных водорастворимых полупроводниковых квантовых точек с молекулами хлорина е6 (КТ/Се6), образованных в результате электростатического взаимодействия или ковалентного связывания, наблюдается диполь-дипольный перенос энергии от квантовых точек CdSe/ZnS к хлорину е6 (I.V. Martynenko, А.О. Orlova, V.G. Maslov, A.V. Baranov, A.V. Fedorov and M. Artemyev. Energy transfer in complexes of water-soluble quantum dots and chlorin еб molecules in different environments // Beilstein J. Nanotechnol. 2013, 4, 895-902 и IV Martynenko, VA Kuznetsova, AO Orlova, PA Kanaev, VG Maslov, A Loudon, V Zaharov, P Parfenov, Yu К Gun'ko, AV Baranov and AV Fedorov. Chlorin еб-ZnSe/ZnS quantum dots based system as reagent for photodynam-ic therapy// Nanotechnology 26 (2015) 055102 (9pp)). Однако в водных растворах в комплексах КТ/Се6 с увеличением концентрации Се6 наблюдается уменьшение эффективности переноса энергии фотовозбуждения от КТ к молекулам Се6 и падение квантового выхода люминесценции молекул Се6, что, как правило, свидетельствует об уменьшении эффективности генерации синглетного кислорода молекулами. Это обстоятельство заметно снижает эффективность применения таких комплексов в ФДТ. Наиболее вероятной причиной снижения эффективности функционирования комплексов КТ/Се6, сформированных в водных растворах, является хорошо известная агрегация молекул. В то же время известно, что в диметилсульфоксиде (ДМСО) молекулы хлорина е6 находятся в мономерной форме (D.A. Schwartz, D.R. Gamelin//Optical Science and Technology, SPIE's 48th Annual Meeting. 2003, International Society for Optics and Photonics. P. 1-7.), которая характеризуется максимальным квантовым выходом генерации синглетного кислорода и, соответственно, предпочтительна при использовании комплексов КТ/Се6 в ФДТ. ДМСО обладает высокой проникающей способностью в биологических тканях и при добавке в небольшом процентном соотношении (до 10% по объему) не проявляет цитотоксичности по отношению к живым клеткам (Т.М. Rippin, V.J. Bykov, S.M. Freund, G. Selivanova, K. Wiman, A.R. Fersht//Oncogene. 2002. V. 21. №14. P. 2119-2129). Существующее ограничение по объему добавок ДМСО ни в коем случае не является препятствием для реализации идеи формирования фотосенсибилизатора на основе квантоворазмерных наноструктур, пригодного для ФДТ, в данном растворителе. Это обусловлено тем, что на поверхности КТ находятся молекулы, которые обеспечивают растворимость КТ и, соответственно, комплексов КТ/Се6 как в ДМСО, так и в водных растворах. Поэтому сформированные в ДМСО комплексы могут быть переведены в водный раствор в результате микродобавки в него высококонцентрированного раствора комплексов в ДМСО.

Для демонстрации работоспособности предлагаемого изобретения были сформированы комплексы хиральных полупроводниковых КТ с молекулами хлорина е6 (КТ/Се6) в диметилсульфоксиде. Типичным представителем коллоидных полупроводниковых квантовых точек группы А2 В6 являются квантовые точки селенида кадмия типа ядро-оболочка, покрытые несколькими слоями полупроводника сульфида цинка, полученные методом горячей инжекции (В.О. Dabbousi, J. Rodriguez-Viejo, F.V. Mikulec, J.R. Heine, H. Mattoussi, R. Ober, K. F. Jensen, and M.G. Bawendi. (CdSe)ZnS Core-Shell Quantum Dots: Synthesis and Characterization of a Size Series of Highly Luminescent Nanocrystallites// J. Phys. Chem. B, 1997, 101 (46), pp. 9463-9475). Для получения гидрофильных КТ, способных образовывать коллоидные растворы в водных средах и в диметилсульфоксиде, была осуществлена стандартная процедура замены исходного стабилизатора поверхности КТ на энантиомеры хиральных молекул: L-, D-цистеина, L-, D-пеницилламина, L-, D-аргинина, L-, D-гистидина. Для анализа влияния хиральности КТ на эффективность внутриклеточного проникновения в качестве образца сравнения использовались CdSe/ZnS КТ, стабилизированные ахиральными молекулами тиогликолевой кислоты (ТГК). В результате замены поверхностного стабилизатора КТ из органической фазы были перенесены в диметилсульфоксид. В качестве примера на Фиг. 1 приведены спектры кругового дихроизма (КД) CdSe/ZnS квантовых точек с диаметром ядра 3.5 нм, стабилизированных исходно молекулами триоктилфосфин оксида (ТОРО), которые были переведены из толуола в ДМСО с использованием L-, и D-гистидина. Видно, что CdSe/ZnS КТ, стабилизированные молекулами ТОРО, не проявляют оптической активности, о чем свидетельствует отсутствие полос в их спектре КД (кривая 3). В то же время, стабилизация КТ L- и D-энантиомерами гистидина (кривые 1 и 2, соответственно) привела к появлению характеристических полос в их спектрах КД, спектральное положение которых соответствует электронным переходам в спектре поглощения данных КТ (кривая 4). При проведении аналогичного замещения молекул ТОРО на поверхности CdSe/ZnS КТ на энантиомеры аргинина, цистеина и пеницилламина в спектрах КД образцов наблюдалась аналогичная картина.

Для формирования комплексов КТ/Се6 в ДМСО был использован стандартный линковщик 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC) (Ulrich Н. Chemistry and technology of carbodiimides. John Wiley & Sons, 2008), который формирует пептидную связь между аминогруппой стабилизатора поверхности КТ (гистидина, аргинина, пеницилламина и цистеина) и карбоксильной группой Се6. Для стабилизации DCC использовался N-Гидроксисукцинимид (NHS), данные соединения были добавлены к раствору Се6 в ДМСО (C_Ce6 ~ 5⋅10^-5 М) в эквимолярном соотношении. Полученная смесь активно перемешивалась на шейкере в течение 150 минут при скорости 600 оборотов/минуту. Активированный Се6 добавлялся в виде микродобавок (50 мкл) к раствору CdSe/ZnS КТ в ДМСО (3 мл), после этого растворы выдерживались в темноте при комнатной температуре при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке в течение 12 часов.

На Фиг. 2 приведены спектры поглощения активированного Се6, КТ и их смеси в эквимолярном соотношении (кривые 1, 2 и 3 соответственно). Положение первой полосы поглощения Се6 (~ 660 нм) свидетельствует о том, что Се6 находится в мономерной форме (Пархоц М.В., Галиевский В.А., Сташевский А.С., Трухачева Т.В., Джагаров Б.М. Динамика и эффективность фотосенсибилизированного образования синглетного кислорода хлорином е6: влияние рН раствора и поливинилпирролидона. Оптика и спектроскопия, 2009, Т. 107, №6, С. 1026-1032.). Анализ спектра поглощения смешанного раствора КТ и Се6 (кривая 3) показал, что в присутствии КТ спектр поглощения Се6 не меняется, т.е. Се6 в смеси с КТ находится в мономерной форме. Об образовании комплексов КТ/Се6 свидетельствует изменение спектра КД Се6 в смеси с КТ, приведенного на Фиг. 3. Видно, что амплитуда длинноволновой полосы Се6 (~ 660 нм) увеличивается в ~ 2 раза, а полоса КД в области полосы Соре (~ 400 нм) уменьшается в 2.5 раза. На Фиг. 4 приведены спектры люминесценции активированного Се6, КТ и их смеси в эквимолярном соотношении в ДМСО (кривые 1, 2 и 3 соответственно). Видно, что добавление раствора Се6 (50 мкл) к раствору КТ (3 мл) приводит к заметному тушению люминесценции квантовых точек и к появлению в образце люминесценции Се6 (~ 670 нм). При неизменности спектра поглощения Се6 в смеси с КТ, изменениях в спектре КД Се6, двукратное увеличение интенсивности люминесценции Се6 свидетельствует об образовании комплексов с эффективным переносом энергии от КТ к молекулам Се6.

На следующем этапе полученные комплексы были сконцентрированы с использованием концентраторов Amicon Ultra-10 Centrifugal Filter Units (10 кДа), которые позволяют отделить комплексы от свободных компонентов смеси. Полученные комплексы КТ/Се6 с различным соотношением концентраций были отделены от не прореагировавших компонентов путем центрифугирования образцов в концентраторах в течение 10 минут на скорости 3000 оборотов/минуту. Выделенные комплексы КТ/Се6 были незамедлительно переведены в водные растворы с физиологическим уровнем рН и проведено исследование их спектров поглощения, люминесценции и возбуждения люминесценции, которые практически не отличались от аналогичных спектров комплексов в ДМСО. Наиболее представительными и информативными для комплексов КТ/Се6 являются спектры возбуждения люминесценции Се6 в комплексах с КТ, поскольку наличие вклада поглощения КТ в эти спектры свидетельствует о внутрикомплексном переносе энергии от КТ к Се6. На Фиг. 5 приведены спектры возбуждения люминесценции Се6 в комплексах с КТ в водных растворах для комплексов с разным числом молекул Се6 (от 1 до 5). Приведенные спектры возбуждения люминесценции нормированы на концентрацию Се6. Это позволяет напрямую из спектров возбуждения люминесценции Се6 оценивать вклад переноса энергии от КТ в общую интенсивность люминесценции Се6. Увеличение вклада поглощения КТ в области 300-530 нм в спектр возбуждения люминесценции Се6 свидетельствует о том, что эффективность переноса энергии в данных комплексах может быть увеличена в два раза при увеличении среднего числа молекул Се6 в комплексах с КТ от 1 до 5. Таким образом, продемонстрировано, что в ковалентно связанных в ДМСО комплексах КТ/Се6 наблюдается эффективный перенос энергии фотовозбуждения от КТ к мономерной форме Се6, причем увеличение среднего числа молекул Се6 в комплексах от 1 до 5 позволяет двукратно увеличить эффективность внутрикомплексного переноса энергии.

Пример 2. Способность комплексов КТ, стабилизованных L- и D- энантиомерами пеницилламина, цистеина, аргинина, гистидина, а также ахиральными молекулами тиогликолевой кислоты, с молекулами Се6 генерировать синглетную форму кислорода была протестирована с использованием специального химического сенсора на основе комплекса флуоресцеина и антрацена (Singlet Oxygen Sensor Green, SOSG) (S. Kim, M. Fujitsuka, and T. Majima. Photochemistry of Singlet Oxygen Sensor Green//J. Phys. Chem. B, 2013, 117 (45), pp 13985-13992). Для этого были приготовлены смешанные водные растворы SOSG (C_SOSG=10^-6 М) и комплексов КТ/Се6 (С_{комплексов}=10^-7 М), в которых на 1 КТ приходилось в среднем от 1 до 5 молекул Се6. Растворы многократно освещались светом с длиной волны 450 нм (плотность мощности, падающая на образцы, 4 млВт/см), время каждой засветки составляло 20 секунд. Во время освещения растворы непрерывно перемешивались на магнитной мешалке. Детектирование синглетного кислорода проводилось по появлению и увеличению интенсивности полосы люминесценции с максимумом на 525 нм. На Фиг. 6 приведены зависимости интенсивности люминесценции SOSG на длине волны 525 нм для образцов, содержащих эквимолярные концентрации CdSe КТ (C_KT=10^-7 М), Се6 и комплексов КТ/Се6 (1, 2 и 3, соответственно). Поскольку интенсивность люминесценции SOSG прямо пропорциональна концентрации синглетного кислорода в образцах, то при одинаковых концентрациях комплексов и отдельных компонентов (КТ и Се6) в одинаковых условиях проведения эксперимента можно сравнить эффективность генерации синглетного кислорода комплексами КТ/Се6 и отдельных компонентов. Видно, что без Се6 КТ практически не генерируют синглетный кислород, что хорошо согласуется с данными о квантовом выходе генерации водорастворимых КТ (~ 1%), а эффективность генерации синглетного кислорода комплексами более чем в два раза выше, чем мономерной формой Се6 той же концентрации. На Фиг. 7 приведены зависимости интенсивности люминесценции SOSG на длине волны 525 нм при освещении светом 450 нм образцов, содержащих комплексы КТ/Се6 (5 молекул Се6 на 1 КТ), в которых поверхность КТ стабилизована энантиомерами различных хиральных молекул: D-цистеином, L-аргинином, D-пеницилламином, L- и D-гистидином, а также ахиральными молекулами ТГК. Видно, что эффективность генерации синглетного кислорода комплексами, содержащими КТ с различным стабилизатором поверхности, мало зависит от типа стабилизатора. Этот результат является вполне ожидаемым, поскольку эффективность генерации синглетного кислорода определяется фотофизическими свойствами комплексов, которые, в свою очередь, определяются условиями их формирования, типом связывания компонентов в комплекс и фотохимическими свойствами Се6 в комплексах, которые были одинаковыми в данном случае и не зависели от используемого типа стабилизатора поверхности КТ. Таким образом, продемонстрировано, что сформированные комплексы КТ/Се6 способны эффективно генерировать синглетный кислород в водных средах, причем эффективность генерации синглетного кислорода данными комплексами не зависит от типа стабилизатора поверхности КТ.

Пример 3. Для демонстрации работоспособности предлагаемого изобретения был проведен ФДТ тест для комплексов хиральных CdSe/ZnS КТ с молекулами Се6 на живых клетках асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), которая вводилась подкожно в виде суспензии белым лабораторным мышам обоих полов в возрасте восьми недель и имеющим вес порядка 20 грамм. Асциты выращивались в течение 10 дней. Для исследований были получены клеточные суспензии из брюшной полости мышей на 10 день после инъекции, которые были очищены от эритроцитов в буферном растворе (~ 10 минут) и их дважды центрифугировали на скорости 1500 оборотов/минуту в течение 10 минут в растворе Хенкса. Осадок растворяли в солевом растворе Хенкса. Для каждого образца 10⁶ клеток на 1 мл солевого раствора Хенкса помещали в ячейки 24-луночного планшета для культивирования клеток. Образцы инкубировали в темноте при температуре 37°С в 5% атмосфере CO₂ в течение 1, 2, 4, и 7 часов, концентрация комплексов C_KT/Се6 составляла 10^-6 М, а свободного C_Ce6=5⋅10^-6 М.

На величину внутриклеточного фотодинамического эффекта, который приводит к разрушению трансформированных клеток, влияет как эффективность генерации синглетного кислорода хлорином е6 в комплексах с хиральными КТ, так и внутриклеточная концентрация комплексов, которая зависит от хиральных свойств КТ. Была сделана оценка внутриклеточного фотодинамического эффекта от комплексов CdSe/ZnS КТ, стабилизированных как хиральными, так и ахиральными молекулами, с молекулами Се6, в которых с одной КТ были ковалентно связаны 5 молекул Се6. В качестве образцов сравнения использовались образцы клеток АКБ, инкубированные свободным Се6, концентрация которого соответствовала концентрации Се6 в комплексах с КТ. Для определения внутриклеточной концентрации Се6 и комплексов образцы клеток осаждались центрифугированием на скорости 1500 оборотов/минуту в течение 5 минут. Полученный осадок помещался в кварцевую кювету толщиной 1 мм, причем кювета заполнялась таким образом, чтобы клетки образовывали практически плотную упаковку. Это обеспечивало отсутствие эффектов, связанных с неравномерностью образца. Для минимизации рассеяния спектры поглощения регистрировались на спектрофотометре UV Probe - 3600 (Шимадзу, Япония) с встроенной интегрирующей сферой. Внутриклеточная концентрация Се6 определялась по спектрам поглощения образцов клеток с использованием формулы D=ε⋅c⋅l, где D - оптическая плотность в максимуме полосы Соре (405 нм), ε - коэффициент экстинкции Се6 в полосе Соре, l - длина оптического пути (толщина кюветы - 1 мм). На Фиг. 8 в качестве примера приведены данные по концентрации Се6 в клетках АКЭ при различном времени инкубирования образцов с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована молекулами L- и D-гистидина, и свободным Се6. Видно, что независимо от времени инкубирования внутриклеточная концентрация Се6 оказывается выше в комплексах с КТ, поверхность которых стабилизирована L-гистидином. При этом использование в комплексах КТ, стабилизированных молекулами D-гистидина, приводит к тому, что внутриклеточная концентрация Се6 оказывается немного меньше, чем при использовании ахирального стабилизатора поверхности КТ - тиогликолевой кислоты. Для демонстрации того, что эффект увеличения внутриклеточной концентрации Се6 обусловлен энантиоселективным накоплением комплексов хиральных КТ с Се6, на Фиг. 9 приведены данные по внутриклеточной концентрации Се6 в составе комплексов КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована энантиомерами другой хиральной молекулы - цистеином. Видно, что, как и в случае использования в качестве стабилизатора поверхности L-гистидина, для комплексов КТ/Се6, в которых поверхность стабилизирована L-цистеином, концентрация Се6 существенно выше, чем в случае свободного Се6. Это свидетельствует о том, что наличие на поверхности КТ энантиомеров хиральных молекул приводит к заметному увеличению внутриклеточной концентрации Се6 в составе комплексов КТ/Се6 по сравнению с его свободной формой, т.е. увеличивает селективность его накопления в клетках.

Оценка внутриклеточного фотодинамического эффекта была выполнена на образцах клеток АКЭ, инкубированных в течение 7 часов с комплексами КТ/Се6 (10^-6 М, соотношение КТ:Се6=1:5) и Се6 (5⋅10^-6 М), при облучении светом с длиной волны 450 нм (плотность мощности, падающей на образцы, 25 мВт/см²) в течение 5 и 10 минут. Количество мертвых клеток оценивалось с использованием 0.4%-ного раствора трипанового синего, которым окрашивали клетки в течение 5 минут. Особенностью данного красителя является то, что он способен проникать и накапливаться только в мертвых клетках. Для оценки количества живых и мертвых клеток использовался автоматизированный счетчик клеток ТС10 (Bio-Rad). На Фиг. 10 приведены данные о выживаемости клеток АКЭ, инкубированных с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована молекулами L- и D-гистидина, и с отдельными компонентами соответствующих концентраций. Видно, что КТ не обладают ни темновой, ни световой цитотоксичностью. В то же время фотодинамический эффект в образцах, инкубированных комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована L-гистидином (С_компл=10^-6 М, КТ:Се6=1:5), практически в ~ 8 раз выше, чем при инкубировании клеток молекулами Се6 (C_Ce6=5⋅10^-6 М). На Фиг. 11 приведены данные о выживаемости клеток АКЭ, инкубированных с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована молекулами L- и D-цистеина, и с отдельными компонентами соответствующих концентраций. Видно, что как и в случае использования энантиомеров гистидина для образцов, инкубированных с комплексами КТ/Се6, в которых поверхность КТ стабилизирована молекулами L-цистеина, (С_компл=10^-6 М, КТ:Се6=1:5), величина ФДТ эффекта в 7,5 раз выше, чем при инкубировании клеток молекулами Се6 (C_Ce6=5⋅10^-6 М). Полученные данные наглядно демонстрируют, что увеличение ФДТ эффекта в клетках АКЭ обусловлено энантиоселективным накоплением комплексов хиральных КТ с молекулами Се6, которое обусловлено наличием на поверхности КТ энантиомера хиральной молекулы.

Таким образом, приведенные примеры наглядно демонстрируют, что фотосенсибилизатор на основе хиральных полупроводниковых квантовых точек и молекул хлорина е6 демонстрирует многократное увеличение внутриклеточного фотодинамического эффекта на живых клетках АКЭ по сравнению со свободными молекулами хлорина е6 той же концентрации за счет синергетического эффекта, обусловленного энантиоселективным накоплением комплексов хиральных КТ и эффективным внутрикомплексным переносом энергии от КТ к молекулам Се6, находящихся в комплексе в мономерной форме.

Изобретение относится к медицине и касается фотосенсибилизатора на основе полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6, содержащего ковалентно связанные комплексы полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6, где комплексы состоят из хиральных полупроводниковых квантовых точек группы А2В6 и молекул хлорина е6 в мономерной форме с возможностью селективного накопления фотосенсибилизатора в трансформированных клетках. Изобретение обеспечивает увеличение селективности накопления фотосенсибилизатора в трансформированных клетках. 1 з.п. ф-лы, 11 ил. 3 пр.

1. Фотосенсибилизатор на основе полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6, содержащий ковалентно связанные комплексы полупроводниковых квантовых точек и хлорина е6, отличающийся тем, что комплексы состоят из хиральных полупроводниковых квантовых точек группы А2В6 и молекул хлорина е6 в мономерной форме с возможностью селективного накопления фотосенсибилизатора в трансформированных клетках.

2. Фотосенсибилизатор по п. 1, отличающийся тем, что на поверхности хиральных полупроводниковых квантовых точек адсорбированы энантиомеры хиральной молекулы.