СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ ТВЕРДЫЕ ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ЧАСТИЦЫ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/17 A61K47/02 A61K47/26 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение направлено на получение полипептидных форм в твердом состоянии, в которых полипептид стабилизирован против деградации при повышенных температурах в течение длительного периода времени. В частности, данное изобретение предоставляет формы и способы изготовления твердых полипептидных частиц, в которых полипептид стабилизирован с помощью одного или более стабилизирующих условий (средств).

Уровень техники

Из уровня техники известны имплантируемые устройства, способные выделять желаемые дозы активного агента, такого как полипептид, в течение продолжительного периода времени. Например, патенты США 5728396, 5985305, 6113938, 6156331, 6375978 и 6395292 рассматривают имплантируемые осмотические устройства, способные доставлять стабильную форму активного агента, раствора или суспензии с желаемой скоростью в течение длительного периода времени (т.е. в период длительностью от около двух недель до нескольких месяцев или более). Имплантируемые системы доставки лекарственных веществ включают в себя также материалы депонирующего типа, такие как описаны в патентах США 6468961, 6331311 и 6130200. Депонирующие материалы обычно секвестируют активный агент в биодеградирующих или биоэродирующих депонирующих материалах, так что активный агент выделяется из имплантированного депонирующего материала в результате диффузии активного агента или деградации или эрозии депонирующего материала. Примеры депонирующих материалов включают в себя системы, основанные на PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), которые обычно способны доставлять активный агент в течение периода от приблизительно двух недель до 6 месяцев. Поскольку они могут быть построены таким образом, чтобы выделять желаемый агент на терапевтических уровнях в течение продолжительного периода времени, имплантируемые системы выделения (лекарств) могут быть предпочтительными в обеспечении долговременного терапевтического дозирования желаемого активного агента, не требующего частых визитов в медицинское учреждение или повторного самолечения. Однако имеются различные технические трудности для доставки терапевтических полипептидов в течение длительного периода времени с использованием в имплантируемых системах доставки.

В частности, представляет интерес поддержание стабильности терапевтических полипептидов, нагруженных в имплантируемую систему, предназначенную для доставки полипептида в течение недель или месяцев. Чтобы добиться подходящих размеров имплантируемой системы, которая обеспечивает доставку терапевтических доз полипептида в течение продолжительного периода времени, в целом необходимо загрузить систему раствором или суспензией, содержащей высокую концентрацию полипептида, который должен быть доставлен. Однако, если такой раствор или суспензия подвергаются воздействию температур, которые достигают или превышают физиологические условия (например, температуры, которые достигают или превышают 37°С) в течение продолжительного периода времени, полипептид, содержащийся в растворе или суспензии, деградирует, если он не стабилизирован. Деградация полипептида, подвергающегося воздействию температур, которые приблизительно соответствуют или превышают физиологические, может протекать различными путями и изменять, уменьшать или устранять биологическую активность полипептида. Следовательно, чтобы добиться способности имплантируемой системы успешно доставлять терапевтический полипептид в течение длительного периода времени, загруженный полипептид должен быть стабилизирован против деградации, так чтобы система была способна доставлять терапевтические дозы биологически активного полипептида в течение функциональной жизни имплантируемой системы.

Сахара были использованы в полипептидных композициях для стабилизации полипептидов, содержащихся в этих композициях, против деградации с течением времени. В частности, сахара были использованы как лиопротекторы, действуя так, чтобы ингибировать агрегацию полипептидов путем уменьшения развертывания молекулы в процессе лиофилизации. Сахара также обеспечивают долговременную стабильность за счет ограничения молекулярной подвижности и минимизации молекулярных взаимодействий во время и после процесса лиофилизации. Однако при применении сахара для стабилизации полипептида часто бывает необходимо использовать большие его количества для достижения желаемой степени стабилизации. Как указано в патенте США 6267958, выданном Andya et al., может потребоваться молекулярное соотношение стабилизирующего сахара [с полипептидом] от 100 до 510, чтобы достигнуть приемлемого стабилизирующего эффекта, а полипептидные композиции, включающие в себя такое большое количество стабилизирующего сахара, не достаточно хорошо пригодны для загрузки в имплантируемые системы доставки лекарственного средства.

В тех случаях, когда для достижения желаемой степени стабилизации полипептида необходима высокая концентрация стабилизирующего сахара, общий объем полипептидной композиции, содержащейся в системе, увеличивается, тогда как максимальная концентрация полипептида, которая может быть загружена в систему, снижается. С уменьшением концентрации полипептида, загруженного в имплантируемую систему, в композиции количество полипептидной композиции, требующейся для достижения желаемого режима дозировки, и минимальный размер имплантируемой системы увеличиваются. Следовательно, было бы усовершенствованием в данной области техники создание композиций и способов стабилизации терапевтических полипептидов, которые снижают или полностью устраняют потребность в стабилизирующем сахаре. Было бы дополнительным усовершенствованием в этой области техники создание композиций и способов стабилизации полипептидов до такой степени, чтобы полипептид мог быть загружен в имплантируемую систему доставки в высокой концентрации, сохраняя при этом высокую стабильность и терапевтическую активность после воздействия температур физиологических условий или выходящих за эти пределы в течение длительного периода времени.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение включает твердые полипептидные частицы, в которых полипептид, содержащийся в частицах, стабилизирован против деградации при температурах, соответствующих физиологическим условиям, или выходящих за эти пределы. Термин "физиологические условия" в данном изобретении подразумевает среду, имеющую температуру около 37°С, а термин "полипептид" включает в себя олигопептиды и белки и охватывает любые природные или синтетические соединения, содержащие две или более аминокислот, соединенных карбоксильной группой одной из аминокислот с аминогруппой другой аминокислоты. В каждом варианте реализации полипептидные частицы по данному изобретению включают в себя полипептидный материал, который стабилизирован против деградации с помощью одного или более стабилизирующих средств. В частности, полипептидные частицы по данному изобретению изготавливаются так, чтобы стабилизировать содержащийся в них полипептид путем контроля одного или более из следующих характеристик частиц: рН, содержание сахара, содержание поверхностно-активного вещества, содержание буфера и концентрация ионов металлов. Поскольку полипептидные частицы по данному изобретению могут быть сформированы так, чтобы соединять аддитивные эффекты двух или более стабилизирующих факторов, где полипептидные частицы по данному изобретению включают в себя стабилизирующий сахар, количество стабилизирующего сахара, требующееся для достижения приемлемой стабильности полипептида, существенно уменьшается. В предпочтительном варианте реализации полипептидные частицы по данному изобретению приготавливаются так, чтобы стабилизировать содержащийся в них полипептид без использования стабилизирующего сахара.

Данное изобретение также включает водные стабилизирующие растворы. Чтобы сформировать твердые полипептидные частицы по данному изобретению, могут быть приготовлены и подвергнуты соответствующему процессу образования частиц, как лиофилизация или сушка распылением, водные стабилизирующие растворы в соответствии с данным изобретением, содержащие стабилизируемый полипептид. Водные стабилизирующие растворы в соответствии с данным изобретением, следовательно, приготавливаются так, что в ходе процесса формирования частиц водные стабилизирующие растворы достигают твердых полипептидных частиц, содержащих полипептидный материал, стабилизированный одним или более стабилизирующими средствами. Путем контроля рН, содержания сахара, содержания поверхностно-активного вещества, содержания буфера, концентрации ионов металлов или концентрации полипептидов в водных стабилизирующих растворах в соответствии с данным изобретением могут быть получены твердые полипептидные частицы, обладающие широким диапазоном желаемых характеристик стабилизации.

Данное изобретение также включает способы изготовления стабилизированных твердых полипептидных частиц. Способ по данному изобретению включает растворение полипептида, который должен быть стабилизирован, в стабилизирующем водном растворе по данному изобретению и последующее восстановление полипептида в виде твердых полипептидных частиц. Состав композиции твердых пептидных частиц, получаемых способом по данному изобретению, зависит от используемого водного стабилизирующего раствора. В одном из вариантов реализации способ по данному изобретению включает растворение стабилизируемого полипептида в кислом стабилизирующем растворе. В другом варианте реализации способ по данному изобретению включает растворение стабилизируемого полипептида в кислом стабилизирующем растворе в присутствии стабилизирующего сахара или иона металла, или обоих компонентов - сахара и иона металла. Еще в одном варианте реализации способ по данному изобретению включает растворение стабилизируемого полипептида в забуференном близком к нейтральному стабилизирующем растворе в присутствии поверхностно-активного вещества, стабилизирующего сахара, иона металла или стабилизирующего сахара и иона металла одновременно. В каждом варианте реализации способа по данному изобретению этап восстановления твердых пептидных частиц может выполняться путем включения водных стабилизирующих растворов в соответствующий процесс образования частиц, такой как лиофилизация или сушка распылением. Хотя способ по данному изобретению может варьироваться для получения частиц, содержащих одну из множества композиций, в каждом случае способ по данному изобретению адаптирован для получения твердых полипептидных частиц, в которых полипептид стабилизирован с помощью одного или более стабилизирующих средств.

Твердые полипептидные частицы по данному изобретению обеспечивают превосходную стабилизацию полипептида, позволяющую добиться 96%-ного восстановления стабилизированного пептида после двух месяцев хранения при 60°С. Более того, твердые полипептидные частицы по данному изобретению могут быть загружены в суспензионные композиции при сравнительно высоких концентрациях (например, 25% полипептидных частиц или более), что облегчает формирование суспензии со сравнительно высокой концентрацией стабилизированного пептида. Твердые полипептидные частицы по данному изобретению, следовательно, облегчают загрузку имплантируемой системы доставки приемлемого размера концентрацией стабилизированного терапевтического полипептида, которая достаточно высока, чтобы сделать возможной выделение терапевтических доз стабилизированного терапевтического полипептида в течение длительного периода времени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет график, иллюстрирующий общую деградацию (по RP-HPLC) и агрегацию (SEC) лиофилизированного РАСАР (ацетат аммония, рН приблизительно 6,4) при хранении при 40°С в течение 3 месяцев.

Фиг. 2 представляет график, иллюстрирующий стабильность лиофилизированного РАСАР, хранившегося при 4°С, 40°С и 60°С в течение 3 месяцев.

Фиг. 3 представляет график, иллюстрирующий подавление формирования агрегатов РАСАР при 40°С, где РАСАР приготовлен в виде твердых частиц с использованием различных наполнителей.

Фиг. 4 представляет график, иллюстрирующий подавление формирования агрегатов РАСАР при 60°С, где РАСАР приготовлен в виде твердых частиц с использованием различных наполнителей.

Фиг. 5 представляет график, иллюстрирующий стабилизирующий эффект гистидина, сукцината и сахарозы на общую деградацию РАСАР при 40°С.

Фиг. 6 представляет график, иллюстрирующий стабилизирующий эффект сахарозы на подавление формирования агрегатов РАСАР в суспензии BA/PVP при 40°С.

Фиг. 7 представляет график, иллюстрирующий стабилизирующий эффект сахарозы на подавление формирования агрегатов РАСАР в суспензии LL/GML/PVP при 40°C.

Фиг. 8 представляет график, иллюстрирующий общую деградацию PACAP в различных суспензионных носителях при хранении при 40°C в течение 3 месяцев.

Фиг. 9 иллюстрирует общую деградацию, определенную с помощью RP HPLC, и деградацию, определенную с помощью SEC, PACAP, содержащегося в частицах, лиофилизированных при кажущемся pH 2, при кажущемся pH 4, и при кажущемся pH 6 и хранении при 60°C в течение 2 месяцев.

Таблица 1 представляет результаты изучения, проведенного для оценки стабильности PACAP, диспергированного в различных суспензионных носителях, при инкубации суспензий PACAP при 65°C в течение 4 ч.

Таблица 2 представляет результаты изучения, проведенного для оценки стабильности PACAP, инкубированного при 37°C в течение 17 дней, в котором PACAP оценивали при лиофилизации чистого вещества (PACAP) или PACAP, диспергированного с одним из трех различных суспензионных носителей.

Таблица 3 представляет результаты изучения, проведенного для оценки стабильности PACAP, инкубированного при 60°C в течение 17 дней, в котором PACAP оценивали при лиофилизации чистого вещества (PACAP) или PACAP, диспергированного с одним из трех различных суспензионных носителей.

Таблица 4 представляет вычисленные скорости деградации и агрегации PACAP, когда PACAP инкорпорирован в состав твердых частиц, включающих различные наполнители, и такие частицы инкубируются при 40°C и 60°C.

Таблица 5 представляет вычисленные скорости деградации и агрегации PACAP, содержащегося в твердых частицах, образованных из трех разных растворов, приготовленных в NH₄OAc-буфере при pH 6, причем каждый из трех растворов содержал разные количества сахарозы.

Таблица 6 представляет результаты изучения, проведенного с целью оценить стабилизацию PACAP, достигнутую путем формирования твердых частиц PACAP при различных pH и с одним из трех разных сахаров.

Таблица 7 представляет результаты изучения, проведенного с целью оценить аддитивную стабилизацию PACAP, достигнутую путем формирования твердых частиц PACAP при различных pH с одним или более из разных наполнителей.

Таблица 8 представляет результаты изучения, проведенного с целью оценить стабилизацию PACAP, достигнутую путем формирования твердых частиц PACAP при различных pH в присутствии CaCl₂, гистидина или CaCl₂ и гистидина одновременно.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом варианте реализации твердые полипептидные частицы по данному изобретению включают в себя полипептид, стабильный при кислом pH, и изготовлены так, что обладают способностью восстанавливать кислый pH. pH водного стабилизирующего раствора до формирования частиц ("кажущийся pH") влияет на pH образующихся затем частиц ("восстановленный pH") и определяет протонированное состояние полипептида в твердых полипептидных частицах. Для целей данного изобретения частицы с восстановленным кислым рН включают в себя полипептидные частицы, демонстрирующие восстановленный рН ниже 5, причем предпочтительны частицы с восстановленным рН ниже 4, а особенно предпочтительны частицы с восстановленным рН в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 4. Контроль pH, демонстрируемый твердыми полипептидными частицами по данному изобретению, позволяет контролировать состояние протонированности полипептида в составе твердых частиц, при этом обнаружено, что формирование твердых полипептидных частиц по данному изобретению при кислых рН придает им значительный стабилизирующий эффект. Полагают, что формирование твердых полипептидных частиц по данному изобретению при кислых pH стабилизирует полипептид вследствие того, что кислая среда усиливает протонирование аминогрупп в составе полипептида. Часто аминогруппы полипептида вовлекаются в образование реакционноспособных промежуточных продуктов, которые склонны к межмолекулярным и внутримолекулярным реакциям, изменяющим химическую природу пептида и его функции, что является существенным путем деградации полипептида. Полагают, что поддержанием полипептида в среде, благоприятствующей протонированию аминогрупп в составе полипептида, ограничивается вовлечение аминогрупп полипептидных частиц по первому варианту реализации в формирование реакционно-способных промежуточных продуктов и, в результате, ограничивается деградация полипептида, происходящая вследствие меж- и внутримолекулярных реакций.

Добавление ионов металла к твердым частицам согласно первому варианту реализации обеспечивает дополнительную стабилизацию полипептида. В тех случаях, когда твердые полипептидные частицы изготавливаются по первому варианту реализации с включением ионов металлов, последние предпочтительно представлены двухвалентными солями, такими как CaCl₂, MgCl₂ или ZnCl₂. Точное количество ионов металлов, включенных в твердые полипептидные частицы по первому варианту реализации, зависит от конкретного стабилизируемого пептида, pH частиц и присутствия или отсутствия стабилизирующего сахара. Однако, когда твердые пептидные частицы согласно первому варианту реализации включают в себя ион металла, частица обычно формируется так, что молярное соотношение иона металла к стабилизированному полипептиду находится в пределах между 1/1 и 10/1, с предпочтительным молярным соотношением в диапазоне от приблизительно 2/1 до приблизительно 6/1, особенно предпочтительно молярное соотношение около 4/1. Добавление ионов металлов к твердым полипептидным частицам по данному изобретению уменьшает димеризацию полипептида с течением времени и, таким образом, обеспечивает дополнительную стабилизацию полипептида. Полагают, что ионы металлов влияют на уменьшение димеризации полипептида через формирование ионных связей или солевых мостиков с молекулами полипептида, ограничивая возможность взаимодействия между молекулами полипептида.

Добавление стабилизирующего сахара к твердым пептидным частицам в соответствии с первым вариантом реализации также вносит дополнительную стабилизацию полипептида. Включение стабилизирующего сахара вносит дополнительную стабилизацию через ограничение молекулярной подвижности полипептида и уменьшение межмолекулярных взаимодействий между молекулами полипептида. Однако, поскольку твердые полипептидные частицы по данному изобретению могут быть приготовлены так, чтобы стабилизировать полипептид двумя или более стабилизирующими средствами, где твердые полипептидные частицы по данному изобретению изготавливаются с включением стабилизирующего сахара, количество сахара, требующегося для достижения приемлемого уровня стабильности, значительно уменьшается. В частности, когда твердые полипептидные частицы по первому варианту реализации изготавливаются с включением стабилизирующего сахара, сахар обычно включают в количествах, лежащих в диапазоне от приблизительно 0,1/1 (массовое соотношение) до приблизительно 1/1 (массовое соотношение) по отношению к стабилизируемому полипептиду. В предпочтительных вариантах реализации твердые полипептидные частицы по данному изобретению, включающие в себя стабилизирующий сахар, содержат последний в количествах, лежащих в диапазоне от приблизительно 0,1/1 (мас./мас.) до приблизительно 0,5/1 (мас./мас.) или от приблизительно 0,1/1 (мас./мас.) до приблизительно 0,25/1 (мас./мас.) относительно стабилизируемого полипептида. Когда твердые полипептидные частицы по первому варианту реализации изготавливаются с включением и стабилизирующего сахара, и ионов металлов, количества сахара и ионов металлов, требующихся для достижения желаемой степени стабилизации полипептида, могут быть уменьшены по сравнению с формами, которые включают в себя стабилизирующий сахар без ионов металлов или ионы металлов без стабилизирующего сахара. Такое потенциальное преимущество может быть достигнуто благодаря аддитивным стабилизирующим эффектам сахара, ионов металлов и кислому рН среды.

Хотя невосстанавливающие сахара обычно пригодны в качестве стабилизаторов в твердых полипептидных частицах по данному изобретению, установлено, что не все сахара пригодны для стабилизации пептидных частиц по первому варианту реализации. Конкретно, обнаружено, что сахароза - сахар, который обычно используется для стабилизации полипептидов, непригоден для использования в условиях кислой среды. Напротив, когда сахароза используется в таких условиях, она вызывает дестабилизирующий эффект. Полагают, что такой дестабилизирующий эффект формируется, поскольку сама по себе сахароза химически нестабильна в кислой среде. В частности, при кислом рН сахароза претерпевает гидролиз в глюкозу и фруктозу. В то же время, трегалоза - дисахарид, подобный сахарозе, химически стабилен в условиях кислой среды и повышенных температур. Метил-маннопиранозид ("метил-МП") - моносахарид, также химически стабильный в кислой среде. Более того, установлено, что и трегалоза, и метил-МП обеспечивают существенную аддитивную стабилизацию полипептида при включении их в состав твердых полипептидных частиц, изготовленных с кислым рН. Следовательно, когда твердые полипептидные частицы согласно первому варианту реализации изготовлены с включением в них стабилизирующего сахара, сахар, включенный в композицию, должен быть стабилен в условиях кислой среды и, предпочтительно, в условиях кислой среды при температурах, соответствующих физиологическим условиям или превышающих их.

Твердые полипептидные частицы согласно первому варианту реализации могут быть изготовлены из водных стабилизирующих растворов. Чтобы изготовить водный стабилизирующий раствор, пригодный для изготовления твердых полипептидных частиц по первому варианту реализации, стабилизируемый полипептид растворяют в кислом растворе. Кислый водный стабилизирующий раствор мог быть получен добавлением подходящей кислоты, такой как HCl, в количестве, которое обеспечивает раствору желаемый pH. pH водного стабилизирующего раствора по данному изобретению играет ключевую роль в стабилизации полипептида, содержащегося в твердых полипептидных частицах, которые изготавливаются с использованием водного стабилизирующего раствора. Чтобы получить твердые полипептидные частицы по первому варианту реализации (т.е. имеющие кислый восстановленный рН), может быть необходимо приготовить водный стабилизирующий раствор с кажущимся рН, который значительно ниже, чем финальный восстановленный рН. Водный стабилизирующий раствор, пригодный для изготовления твердых полипептидных частиц по первому варианту реализации, может также включать в себя соль металла или стабилизирующий сахар, растворенные в нем. Количество соли металла или стабилизирующего сахара, растворенное в водном стабилизирующем растворе, пригодном для изготовления твердых полипептидных частиц по первому варианту реализации, может варьироваться. Однако в тех случаях, когда водный стабилизирующий раствор для приготовления твердых полипептидных частиц включает в себя стабилизирующий сахар, водный стабилизирующий раствор предпочтительно должен включать в себя желаемое количество стабилизирующего сахара в диапазоне от приблизительно 0,1/1 (соотношение мас./мас.) до приблизительно 1/1 (соотношение мас./мас.) по отношению к стабилизируемому полипептиду. Более того, когда водный стабилизирующий раствор, используемый для приготовления твердых полипептидных частиц, включает в себя ион металла, водный стабилизирующий раствор предпочтительно изготавливается с включением в него желаемого иона металла в молярном соотношении иона металла к полипептиду в пределах от приблизительно 1/1 до приблизительно 10/1.

Чтобы приготовить твердые полипептидные частицы по первому варианту реализации из кислого водного стабилизирующего раствора, стабилизирующий раствор подвергается известному процессу формирования частиц. Например, водный стабилизирующий раствор по данному изобретению может быть подвергнут лиофилизации или высушиванию распылением, чтобы получить твердые пептидные частицы. В особом варианте реализации твердые полипептидные частицы по данному изобретению изготавливаются из водного стабилизирующего раствора по данному изобретению с использованием цикла лиофилизации, который включает в себя замораживание стабилизирующего раствора при 4°C в течение 30 минут и при -50°C в течение 3 часов (при скорости охлаждения 2,5°C/мин). После замораживания водного стабилизирующего раствора, как описано выше, первичный цикл высушивания проводится в камере с давлением 50 mT при -30°C в течение 10 минут, а затем при 0°C в течение 10 часов. За первичным циклом высушивания следует вторичный цикл высушивания в камере с давлением 200 mT при 0°C в течение 3 часов, затем при 20°C в течение 12 часов и при 30°C в течение 6 часов с линейным изменением температуры во всех случаях со скоростью 0,5°C/мин. Однако данное изобретение не ограничено твердыми полипептидными частицами, полученными в точном соответствии с описанным здесь процессом лиофилизации. Известно несколько пригодных процессов лиофилизации и высушивания распылением в области изготовления белковых частиц, которые могут быть применены для получения твердых полипептидных частиц по данному изобретению.

По второму варианту реализации твердые полипептидные частицы по данному изобретению изготовлены с восстановленным рН, близким к нейтральному. В данном документе термин "близкий к нейтральному" касается рН от 5 до приблизительно. 8. Предпочтительно твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются с восстановленным pH между приблизительно pH 5 и pH 7. Полипептидные частицы по второму варианту реализации данного изобретения включают в себя буфер, либо поверхностно-активное вещество, либо стабилизирующий сахар, ион металла или стабилизирующий сахар вместе с ионом металла. Было обнаружено, что приготовление твердых полипептидных частиц с восстановленным рН, близким к нейтральному, с включением в них буферных наполнителей, существенно стабилизирует полипептидный материал, входящий в состав твердых частиц. Полагают, что при рН, близких к нейтральному, буфер может служить для стабилизации полипептида, включенного в состав твердых частиц, вследствие противоионного эффекта. В частности, полагают, что буфер может взаимодействовать или связываться с одним или более сайтами в составе полипептида, проявляющими тенденцию межмолекулярно или внутримолекулярно реагировать, таким образом, что эти сайты перестают быть доступными для реакции.

Буферами, пригодными для использования в изготовлении твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, являются такие, которые забуферивают при рН, близких к нейтральным. Конкретные примеры буферов, которые могут быть использованы в твердых полипептидных частицах по второму варианту реализации, включают в себя аминокислотные и пептидные буферы, такие как гистидиновый буфер (His-6) или буфер "гистидин - глутаминовая кислота" (His-Glu), и неорганические буферы, такие как сукцинатный или цитратный буфер. Твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации обычно изготавливаются с содержанием буфера до 20% по массе, причем полипептидные частицы по весу до приблизительно 15% буфера являются предпочтительными. Однако точное количество буфера, включенное в состав твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, может варьироваться в соответствии с количеством и типом полипептида в составе частиц. Более того, количество и тип буфера, использованного для приготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, могут также устанавливаться для получения твердых полипептидных частиц с желаемым восстановленным pH.

При изготовлении твердых частиц по второму варианту реализации с включением в них стабилизирующего сахара или иона металла, либо одновременно стабилизирующего сахара и иона металла стабилизация полипептида в составе частиц повышается по сравнению с достигаемой при простом изготовлении полипептида в среде, близкой к нейтральной в присутствии буфера. Когда твердые полипептидные частицы изготавливаются по второму варианту реализации с включением в них стабилизирующего сахара или иона металла, либо одновременно стабилизирующего сахара и иона металла одновременно, количество сахара и иона металла, включенных в частицы, предпочтительно попадает в пределы, описанные в отношении частиц по первому варианту реализации. В частности, если твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются с включением в них стабилизирующего сахара, количество стабилизирующего сахара, включенного в частицы, предпочтительно находится в пределах от приблизительно 0,1/1 (мас./мас.) до приблизительно 1/1 (мас./мас.) по отношению к стабилизируемому полипептиду. Следует повторить, что невосстанавливающие сахара обычно бывают пригодны в качестве стабилизирующих сахаров в твердых полипептидных частицах по данному изобретению, однако, поскольку они изготавливаются при рН, близком к нейтральному, твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации могут включать в себя стабилизирующие сахара, такие как сахароза, которые нестабильны в кислой среде. Далее, если твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются с включением в них ионов металла, частицы предпочтительно изготавливаются с включением желаемого иона в молярном соотношении иона металла к полипептиду от приблизительно 1/1 до приблизительно 10/1. Когда твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются с включением и стабилизирующего сахара, и ионов металла, количества сахара и ионов металла, требующиеся для достижения желаемой степени стабилизации полипептида, могут быть уменьшены по сравнению с композициями, которые включают в себя либо стабилизирующий сахар без ионов металла, либо ионы металла без стабилизирующего сахара. Такое потенциальное преимущество может достигаться благодаря аддитивным стабилизирующим эффектам сахара, ионов металла и буферных условий, близких к нейтральному pH.

Когда твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются с включением в них поверхностно-активного вещества, в качестве последнего предпочтительно используется анионное поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS). Количество поверхностно-активного вещества, включенного в состав твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, может варьироваться в соответствии с количеством и типом стабилизируемого полипептида, так же как и с природой и количеством других наполнителей, включенных в состав частиц. Тем не менее, когда твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации изготавливаются из водного стабилизирующего раствора, желаемое поверхностно-активное вещество содержится в количествах, находящихся в пределах от приблизительно 0,02 мас.% до приблизительно 0,2 мас.%.

Твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации могут быть приготовлены из водного стабилизирующего раствора. Чтобы приготовить водный стабилизирующий раствор, пригодный для изготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, стабилизируемый полипептид растворяют в растворе, обладающем приблизительно нейтральным кажущимся pH и включающем в себя поверхностно-активное вещество, соль металла, стабилизирующий сахар или одновременно соль металла и стабилизирующий сахар, по желанию. Близкий к нейтральному стабилизирующий раствор может быть получен добавлением подходящего буфера, такого как указано выше, в количестве, обеспечивающем образование раствора с желаемым кажущимся pH. Так же, как это справедливо для водных стабилизирующих растворов, используемых для приготовления твердых полипептидных частиц по первому варианту реализации, кажущийся pH водного стабилизирующего раствора, используемого для изготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, влияет на восстановленный pH твердых полипептидных частиц, приготовленных с использованием водного стабилизирующего раствора. Следовательно, количество и тип буфера, используемого в водном стабилизирующем растворе для изготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, могут варьироваться, чтобы достичь желаемого кажущегося pH и желаемого восстановленного pH. Далее, чтобы получить твердые полипептидные частицы, которые характеризуются содержанием буфера в описанных здесь пределах, количество буфера, включенного в состав водного стабилизирующего раствора, должно варьироваться в зависимости от, среди прочих факторов, типа используемого буфера, точного желаемого количества буфера в твердых частицах, а также природы и количества полипептида и других наполнителей, включенных в состав твердых частиц. Например, в Примерах, детально описанных ниже, стабилизирующие растворы характеризуются 10 мМ концентрацией гистидинового буфера, обеспечивающей образование твердых полипептидных частиц, содержащих 14 мас.% буферного материала.

Количество соли металла или стабилизирующего сахара, растворенных в водном стабилизирующем растворе, пригодное для получения твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации, также может варьироваться в зависимости от количества и природы соли металла или стабилизирующего сахара. Однако, когда водный стабилизирующий раствор для изготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации включает стабилизирующий сахар, водный стабилизирующий раствор должен предпочтительно содержать желаемый стабилизирующий сахар в количестве, лежащем в вышеописанных пределах (т.e. от приблизительно 0,1/1 (массовое соотношение) до приблизительно 1/1 (массовое соотношение) по отношению к стабилизируемому полипептиду, с предпочтительными диапазонами от приблизительно 0,1/1 (массовое соотношение) до приблизительно 0,5/1 (массовое соотношение) и от приблизительно 0,1/1 (массовое соотношение) до 0,25/1 (массовое соотношение)). Далее, когда водный стабилизирующий раствор для приготовления твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации включает в себя ион металла, водный стабилизирующий раствор предпочтительно изготавливается с включением в него желаемого иона металла в молярном соотношении иона металла к полипептиду, лежащим в уже описанном диапазоне (т.е. молярное соотношение иона металла к полипептиду в диапазоне от приблизительно 1/1 до приблизительно 10/1, с предпочтительным диапазоном от приблизительно 2/1 до приблизительно 6/1 и особенно предпочтительным молярным соотношением приблизительно 4/1).

Чтобы получить твердые полипептидные частицы по второму варианту реализации из близкого к нейтральному водного стабилизирующего раствора, близкий к нейтральному стабилизирующий раствор подвергают известному процессу формирования частиц. Как описано в связи с формированием частиц по первому варианту реализации, твердые частицы по второму варианту реализации могут быть сформированы из соответствующим образом приготовленного водного стабилизирующего раствора с использованием лиофилизации или высушивания распылением. Например, процесс лиофилизации, описанный здесь, пригоден для получения твердых полипептидных частиц по второму варианту реализации из водного стабилизирующего раствора. Следует повторить, что данное изобретение не ограничивается использованием того процесса лиофилизации, который здесь описан детально. Процессы формирования частиц путем лиофилизации и высушивания распылением хорошо известны в данной области техники и любой подходящий процесс лиофилизации или высушивания распылением может быть применен к водным стабилизирующим растворам по данному изобретению для получения твердых полипептидных частиц по данному изобретению.

Твердые полипептидные частицы, водные стабилизирующие растворы и способы по данному изобретению особенно хорошо пригодны для стабилизации пептидов, принадлежащих к надсемейству пептидов, включающему в себя полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP) и глюкагон. У человека надсемейство, к которому принадлежат PACAP и глюкагон, включает в себя по меньшей мере девять различных типов биоактивных пептидов: PACAP-27, PACAP-38, глюкагон, глюкагоноподобные пептиды, такие как GLP-1 и GLP-2, рилизинг-фактор гормона роста (GRF), вазоактивный интестинальный полипептид (VIP), гистидин-метиониновый пептид (PHM), секретин и глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP). Восемь из этих девяти типов биоактивных пептидов обнаружены в мозге и классифицированы как нейропептиды. Кроме того, многие члены надсемейства PACAP/глюкагон представлены в желудочно-кишечных органах, поджелудочной железе и гонадах (см., The origin and function of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/ glucagon superfamily, Endocrine Reviews, 21(6):619-670). Пептиды, входящие в надсемейство PACAP/глюкагон, сходны по аминокислотной структуре их N-конца, а гены и молекулы-предшественники, используемые в клеточной продукции разнообразных различающихся между собой пептидов надсемейства PACAP/глюкагон, сходны по структуре.

Особый интерес представляет собой синтетический аналог PACAP-R3 агониста (аналог PACAP), производимый Bayer Corporation (Bayer). Этот синтетический пептид характеризуется следующей последовательностью из 31 аминокислоты: HSDAVFTDNY TRLRKQVAAK KYLQSIKNKR Y. Корпорация Bayer разработала аналог PACAP для усиления его действия и селективности к R3-рецептору в поджелудочной железе. Чтобы усилить стабильность аналога PACAP, оригинальный метионин в положении 17 был замещен на валин, а аспарагин, оригинально находящийся в положении 24, замещен на глутамин. Аналог PACAP эффективен при лечении диабета типа II, и было бы желательно доставлять аналог PACAP из имплантируемой системы субъекту (человеку) в терапевтических дозах в течение периода по меньшей мере в три месяца, а предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев. Однако независимо от того, находится ли он в твердом состоянии или растворен в водном или органическом растворителе, незащищенный аналог PACAP нестабилен при температурах, приближающихся или превосходящих физиологические условия. Следовательно, чтобы загрузить аналог PACAP в суспензию, пригодную для доставки из имплантируемой системы доставки в течение длительного времени, твердые частицы с аналогом PACAP должны быть стабилизированы против деградации, которая в противном случае наступает вследствие длительного воздействия температур, приближающихся к физиологическим условиям или превосходящих их.

Поскольку аналог PACAP в твердом состоянии подвергается воздействию температуры, приближающейся к физиологическим условиям или превосходящей ее, наиболее существенной причиной деградации, как было установлено, является образование агрегатов. В частности, при использовании лиофилизированного аналога PACAP, было установлено, что наиболее важными продуктами деградации незащищенного лиофилизированного аналога PACAP являются: ковалентные димеры, димер-OAc и продукты присоединения PACAP-OAc. В настоящее время полагают, что деградация аналога PACAP в такие агрегированные продукты происходит вследствие внутримолекулярного формирования циклического имида, за которым следует нуклеофильная реакционная атака со стороны ионов ацетата или другой молекулы аналога PACAP, или их обоих. Вероятно, сайтами модификации при таких предполагаемых путях деградации являются аминокислоты Аsp3Аla4 и Gln24Ser25 молекулы аналога PACAP. Было также определено, что разрыв связи на N-конце пептида также может приводить к деградации твердого незащищенного аналога PACAP. Этот протеолиз обнаруживается, в основном, при pH 4 и, вероятно, происходит через принудительное закрытие внутримолекулярного кольца карбоксильной боковой цепи Аsp3. Однако, как это детально изложено в нижеследующих Примерах, различные варианты реализации твердых полипептидных частиц по данному изобретению эффективны против деградации, даже когда частицы находятся при температурах 40°C и 60°C в течение нескольких месяцев.

Хотя несколько различных вариантов реализации способа получения твердых полипептидных частиц по данному изобретению обеспечивают эффективную стабилизацию аналога PACAP, три варианта реализации обеспечивают высшую степень стабилизации. В одном из вариантов реализации твердые частицы аналога PACAP лиофилизируются из стабилизирующего раствора с кажущимся pH 2. Растворитель для стабилизирующего раствора образуется из H₂O, имеющей pH, установленный на уровне желаемого значения с помощью разведенной HCl. Твердые частицы аналога PACAP по данному варианту реализации дают 92% восстановления исходного аналога PACAP и допускают формирование лишь 1,1% формирования димера после хранения при 60°C в течение двух месяцев. Фиг. 9 представляет стабильность в результате двухмесячного хранения и демонстрирует значительное увеличение стабильности твердых части PACAP, приготовленных из стабилизирующего раствора с кажущимся pH 2.

По второму варианту реализации твердые полипептидные частицы изготавливаются при кислом pH и включают в себя трегалозу и аналог PACAP в массовом соотношении 0,55/1 (трегалоза/аналог PACAP). Такие частицы дают 96% восстановления от исходного содержания аналога PACAP и только 0,7% формирования димера даже после двух месяцев хранения при 60°C. Для получения твердых частиц с аналогом PACAP, характеризующихся кислым pH и включающих в себя трегалозу и аналог PACAP в массовом соотношении 0,55/1, может быть использован кислый водный стабилизирующий раствор. Такой стабилизирующий раствор может быть изготовлен с использованием подходящей кислоты, такой как разведенная HCl. pH такого раствора (кажущийся pH) предпочтительно устанавливается приблизительно на уровне pH 2, а трегалозу и аналог PACAP растворяют в таком растворе при желаемом массовом соотношении 0,55/1. Приготовленный раствор затем может подвергнуться лиофилизации или высушиванию распылением для получения желаемых твердых частиц с аналогом PACAP.

По третьему варианту реализации твердые полипептидные частицы опять-таки изготавливаются при кислом pH и включают в себя аналог PACAP и ионы Ca²⁺ при молярном соотношении 4/1 (Ca²⁺/аналог PACAP). Через два месяца хранения при 60°C частицы, изготовленные в соответствии с такой формой, обеспечивают восстановление 95% исходного содержания аналога PACAP и образование только 0,8% димера. Чтобы получить твердые частицы с аналогом PACAP, характеризующиеся кислым pH и включающие в свой состав Ca²⁺ и аналог PACAP в молярном соотношении 4/1, может быть приготовлен кислый водный стабилизирующий раствор. Опять-таки, такой раствор может быть приготовлен с использованием подходящей кислоты, такой как разведенная HCl, а pH раствора предпочтительно устанавливается на уровне приблизительно pH 2. Соответствующее количество ионов Ca²⁺ и аналога PACAP могут быть введены в раствор путем растворения нужных количеств CaCl₂ и PACAP, что приводит к образованию раствора, имеющего молярное соотношение Ca²⁺ к аналогу PACAP 4/1. Приготовленный стабилизирующий раствор может затем быть подвергнут лиофилизации или высушиванию распылением для получения желаемых твердых частиц с аналогом PACAP.

Хотя стабильность аналога PACAP, содержащегося в частицах, описанных здесь, оценивали в течение максимального периода в два месяца при максимальной температуре 60°C, результаты, полученные при такой оценке, и сравнение кинетики деградации при 40°C показывают, что способ по данному изобретению пригоден для получения твердых частиц с аналогом PACAP, стабилизированных против деградации в течение срока, значительно превышающего два месяца при температурах, приближающихся к физиологической температуре (т.e. 40°C). Конкретно, было обнаружено, что общая скорость деградации аналога PACAP, содержащегося в частицах, приблизительно в пять раз выше при 60°C, чем при 40°C. Далее, скорость агрегации или димеризации в твердых частицах с PACAP, изготовленных по данному изобретению, в десять раз выше, чем при 40°C. Следовательно, когда твердые частицы с аналогом PACAP, изготовленные способом по данному изобретению, поддерживаются при приблизительно 37°C, это означает, что аналог PACAP, содержащийся в этих частицах, будет сохранять приемлемую стабильность в течение шести месяцев и, вероятно, больше.

Хотя Примеры, описанные ниже, касаются стабилизации аналога PACAP, данное изобретение не так ограничено. Например, способ по данному изобретению может быть использован для получения стабилизированных твердых частиц с другими членами надсемейства PACAP/глюкагон, особенно такие члены семейства, как человеческий VTP и человеческий рилизинг-фактор гормона роста, которые обладают существенной гомологией аминокислотных последовательностей. Однако способ по данному изобретению также не ограничен стабилизацией членов надсемейства PACAP/глюкагон. Твердые полипептидные частицы, водные стабилизирующие растворы и способ по данному изобретению могут быть полезны для стабилизации любого полипептида, который проявляет деградацию вследствие протеолиза или формирования агрегатов, или чья первичная структура подвержена тем путям деградации, которые наблюдаются в случае PACAP.

ПРИМЕР 1

Вследствие природы суспензионных носителей, используемых в имплантируемых системах выделения, смешивание массы суспензионного состава и последующая загрузка суспензионного состава в имплантируемые системы часто проводятся при повышенных температурах. Чтобы оценить стабильность аналога PACAP (или проще - PACAP), суспендированного в различных суспензионных носителях при повышенных температурах, незащищенный лиофилизированный PACAP суспендировали в четырех различных суспензионных носителях (LL/GML/PVP, BA/PVP, EHL/PVP, и PEG/PVP). Чтобы суспендировать PACAP в суспензионном носителе 3,3 мг PACAP ацетата вручную смешивали с каждой из этих различных суспензий, чтобы добиться содержания в них PACAP, приблизительно равным 3%. Стабильность суспензии формы PACAP затем оценивали после инкубации при 65°C в течение четырех часов. Стабильность изготовленной суспензии PACAP оценивали с помощью обращенно-фазной хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC) и эксклюзионной хроматографии (по размеру) (SEC), и, как ясно из таблицы 1, результаты показали, что PACAP оставался стабильным в течение четырехчасового периода инкубации и, следовательно, сохраняется при температурных условиях, типичных для производственных процессов приготовления суспензии.

Суспензии PACAP затем инкубировали при 37°C и 65°C в течение еще 17 дней. После 17-дневного дополнительного периода инкубации минимальная утеря стабильности наблюдалась в суспензии, инкубировавшейся при 37°C (Таблица 2), тогда как сравнительно более агрессивная деградация наблюдалась в суспензиях, инкубировавшихся при 65°C (Таблица 3). Результаты показывают, что агрегация, обусловленная ковалентным связыванием, является главным путем деградации оцениваемых суспензий PACAP. Тот факт, что агрегация обнаруживалась при наличии и в отсутствие носителя предполагает, что суспензионный носитель не является ответственным за возникающую внутреннюю ассоциацию. Кроме того, свой вклад в потерю лиофилизированного РАСАР вносят и другие пути химической деградации.

ПРИМЕР 2

Предварительные данные исследования процесса привели к оценке стабилизационного эффекта сахара (сахарозы) и неионного поверхностно-активного вещества (Tween 80) на лиофилизаты и суспензии PACAP. Для выполнения такой оценки приготавливали образцы с PACAP в 10 мМ NH₄OAc (pH 6,4) при трех уровнях Tween 80 (0; 0,05; 0,2 массовых %) и сахарозы (массовые соотношения 0; 0,5/1, 1/1). Так же готовили растворы PACAP в 10 мМ гистидине (pH 6,4) и сукцинате натрия (pH 5,6). Каждый из растворов PACAP лиофилизировали для получения твердых частиц PACAP и в отдельные ячейки вносили образцы по 3,3 мг материала, полученного из каждого раствора, так что в ячейках либо не содержалось дополнительных компонентов (1), либо (2) 0,2 массовых % Tween 80, (3) 0,2 массовых % Tween 80 + 0,5:1 (массовое соотношение) сахарозы и (4) 1:1 (массовое соотношение) сахарозы. Различные образцы с 3,3 мг материала вручную смешивали с LL/GML/PVP и BA/PVP для получения суспензионных форм, имеющих приблизительно 3%-ное содержание PACAP, и суспензионную форму подвергали четырехчасовой инкубации при 65°C. После этого первоначального периода инкубации различные суспензионные формы сохраняли, как описано ниже, и оценивали с помощью обращенно-фазной хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC) и эксклюзионной хроматографии (по размеру) (SEC).

Хранение Температура/Время024 дня3 месяца2-8°Cх-x40°C-Xx60°C-Xx

Фиг. 1 показывает, что сахароза подавляла агрегацию PACAP, тогда как присутствие Tween 80 эффекта не имело. Общая стабильность, вычисленная как процент сохранившегося PACAP, также возрастала соответственно. Показано, что агрегация PACAP является функцией температуры хранения (Фиг. 2). Лиофилизированный PACAP без стабилизатора оставался стабильным в течение по меньшей мере 3 месяцев при 4°C, а агрегация происходит значительно быстрее при 60°C, чем при 40°C. Данное исследование показывает, что сахароза стабилизирует лиофилизированный PACAP и при физиологической (40°C), и при повышенной (60°C) температурах.

Фиг. 3 и 4 показывают линейное нарастание формирования агрегатов PACAP в течение 3 месяцев при 40 и 60°C, соответственно в лиофилизированных формах с различными наполнителями. Гистидин и сукцинат натрия продемонстрировали лучшие стабилизирующие свойства, чем ацетат аммония. За исключением образцов, содержащих сахарозу в массовом соотношении 1:1, скорость агрегации при 60°C была приблизительно в 10 раз выше, чем наблюдавшаяся при 40°C, а скорость общей деградации была приблизительно в 5 раз выше при 60°C, чем наблюдавшаяся при 40°C (Таблица 4). Эти результаты показывают, что высокое содержание сахарозы повышает термическую стабильность за счет снижения общей молекулярной подвижности и межбелковых взаимодействий.

Общая деградация, с одной стороны, демонстрирует менее выраженную линейную зависимость в течение трехмесячного периода времени (Фиг.5). Этот эксперимент показывает, что лиофилизированный РАСАР (приготовленный при кажущемся рН 6,4 в ацетате аммония), содержащий равные количества сахарозы (массовое соотношение), дает лучшую (но неприемлемую) стабильность с рассчитанной общей деградацией 8,4% за 6 месяцев при 40°С.

Кроме того, этот эксперимент показал, что сахароза подавляет формирование агрегатов в суспензиях РАСАР в BA/PVP и LL/GML/PVP (Фиг.6 и 7) так же, как формы лиофилизированного РАСАР без добавок. Стабилизирующий эффект сахарозы в отношении формирования агрегатов выглядит меньшим в суспензии BA/PVP. Также большее количество сахарозы требуется для сходной долговременной стабильности РАСАР в BA/PVP (Фиг.8).

Чтобы охарактеризовать деградацию продуктов и выяснить пути деградации, восстановленный образец для определения стабильности (лиофилизированный РАСАР, хранившийся при 60°С в течение 24 дней) анализировали с помощью время-пролетной масс-спектрометрии электрораспылением, а продукты деградации идентифицировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC).

Молекулярная масса (MW) 3743 атомных единиц массы приписывается интактному РАСАР. Основываясь на анализе с помощью обращенно-фазовой хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC) показано, что основные продукты деградации идентифицируются как ковалентные димеры и продукты присоединения димер-ОАс. Существенно, что вся группа пиков, элюирующихся после главного пика, но до пиков, связанных с элюцией димеров, имеют массу, равную продуктам присоединения РАСАР-ОАс (т.е. 3785 атомных единиц массы). Комбинированные результаты анализа с помощью обращенно-фазовой хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC) и время-пролетной масс-спектрометрии электрораспылением предполагают деградацию, происходящую через одинаковые реакционноспособные промежуточные продукты. Основываясь на этом анализе, потенциальный механизм деградации может постулироваться в нижеследующем виде:

Схема 1: Гипотетический механизм

Можно предположить, что деградация проходит по двухступенчатому механизму через формирование промежуточного циклического имида, лимитирующего скорость процесса, за которым следует нуклеофильное присоединение иона ацетата, другой молекулы РАСАР или их обоих. Так как содержание воды было низким во всех образцах (<1%), деамидирование как результат нуклеофильного присоединения воды не было преобладающим.

ПРИМЕР 3

Твердые частицы с РАСАР готовили путем процесса лиофилизации (FTS Duro stop) из трех различных растворов полипептидов с NH₄OAc-буфером при pH 6. Каждый из трех разных растворов, содержащих разное количество сахарозы, первый из которых сахарозы не содержал, второй содержал сахарозу и РАСАР в массовом соотношении 0,5/1 и третий, содержащий, сахарозу и РАСАР в массовом соотношении 1/1. Твердые частицы с PACAP, приготовленные из каждого из трех растворов, хранили при контроле температуры в диапазонах от 2°C до 8°C, при температуре, приближающейся к физиологической (40°C), и при температуре, превосходящей физиологическую (60°C). Стабильность PACAP, содержащегося в каждой группе твердых частиц с PACAP, определяли через 24 дня и через 3 месяца. Чтобы определить стабильность PACAP в каждой группе частиц, частицы восстанавливали в воде и анализировали с помощью обращенно-фазной хроматографии высокого разрешения (RP-HPLC) (элюция в градиенте ацетонитрила с подвижной фазой, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты с УФ-детектированием при длине волны 214 нм) и эксклюзионной хроматографии (по размеру) HPLC (SEC, изократическая элюция, 30% ацетонитрил, смешанный с 70% водным раствором, содержащим 0,1% трифторуксусной кислоты и 200 мМ хлористого натрия с УФ-детектированием при длине волны 220 нм).

Было установлено, что скорость агрегации (оцениваемая с помощью SEC) в 10 раз выше при 60°C, чем при 40°C, для всех исследованных форм (Таблица 5). За исключением твердых частиц с PACAP, приготовленных при массовом соотношении PACAP к сахарозе, равном 1/1, скорость суммарной деградации (определяемой с помощью RP HPLC), наблюдавшаяся в разных типах твердых частиц с PACAP, была приблизительно в 5 раз выше при 60°C, чем при 40°C.

ПРИМЕР 4

Оценивали действие pH на стабильность молекул PACAP в зависимости от времени. Чтобы выполнить такую оценку, сырье PACAP сначала растворяли в H₂O, приготавливая три разных раствора, первый из которых имел pH 2, второй раствор имел pH 4, а третий раствор имел pH 6. pH каждого из растворов устанавливали на уровне желаемого значения с помощью разведенного HCl. Каждый из трех растворов помещали в лиофилизационные флаконы, и из каждого из трех растворов путем уже описанного здесь процесса получали твердые частицы с PACAP. Частицы из каждого из трех растворов затем сохраняли в течение двух месяцев при 60°C, а стабильность PACAP в составе твердых частиц затем определяли с помощью RP-HPLC и SEC. Фиг. 9 представляет результаты исследования стабильности после двух месяцев хранения, которые показывают значительное усиление стабильности твердых частиц с PACAP, приготовленных при кислом pH.

ПРИМЕР 5

Оценивали стабильность PACAP, включенного в состав твердых частиц, приготовленных при варьирующемся pH с потенциально стабилизирующим сахаром. В каждом случае твердые частицы с PACAP, состоящие из 7,3 молярных эквивалентов одного из трех разных сахаров: сахарозы, трегалозы и метилманнопиранозида (все производства фирмы Sigma). Оцениваемые твердые частицы с PACAP приготавливались из восьми разных водных растворов. Два первых водных раствора приготавливали путем растворения PACAP в первом растворе с pH 2, а второй раствор имел pH 6 (как и в предыдущих случаях pH различных растворов, описанных в этом Примере, устанавливали с помощью разведенного HCl). Третий и четвертый водные растворы приготавливали путем растворения PACAP и метил-MP в растворе, имеющем pH 2, и в растворе, имеющем pH 6. Пятый и шестой водный растворы приготавливались путем растворения PACAP и трегалозы в растворе, имеющем pH 2, и в растворе, имеющем pH 6. Седьмой и восьмой водные растворы приготавливали путем растворения PACAP и сахарозы в растворе, имеющем pH 2, и растворе, имеющем pH 6.

Твердые частицы с PACAP приготавливали из каждого из восьми растворов путем лиофилизации, как уже было описано, и твердые частицы с PACAP, полученные из каждого из восьми растворов затем сохраняли при 60°C в течение двух месяцев. После экспозиции различных твердых частиц с PACAP при 60°C в течение двух месяцев стабильность PACAP, включенного в состав различных частиц, оценивали с помощью RP HPLC и SEC.

Анализ с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) показывает, что три исследованных сахара усиливали стабильность при включении их в частицы с PACAP, приготовленные при pH 6. В частности, при pH 6 сахароза обеспечивала приблизительно шестикратное улучшение в предупреждении формирования агрегатов, а трегалоза обеспечивала приблизительно четырехкратное улучшение по этому показателю. Далее, и трегалоза, и метил-MP обеспечивали дополнительную стабильность частицам с PACAP, включенным в состав частиц, приготовленных при pH 2 (Таблица 6) по отношению к частицам с PACAP, приготовленными при pH 2 без добавления стабилизирующего сахара. Однако сахароза при включении в состав частиц с PACAP, приготовленных при pH 2, проявляет существенный дестабилизирующий эффект. Дестабилизирующий эффект сахарозы на PACAP, приготовленный при pH 2, как полагают, является результатом разложения сахарозы в ходе приготовления частиц с PACAP из раствора с кислым pH.

ПРИМЕР 6

Готовили частицы с PACAP, содержащие гистидиновый буфер (фирмы Sigma), и частицы с PACAP, содержащие гистидиновый буфер в комбинации с хлористым кальцием (CaCl₂, фирма JT Baker), сахарозой и додецилсульфатом натрия (SDS, фирма Pierce) и оценивали стабилизацию PACAP, обеспечиваемую такими частицами. Чтобы оценить частицы с PACAP готовили шесть различных водных растворов. Каждый раствор включал в себя растворенное в нем желаемое количество PACAP, а pH каждого из шести растворов устанавливали на уровне рН 6 путем добавления разведенной HCl. Первый водный раствор готовили без добавок (гистидиновый буфер, CaCl₂, сахароза или SDS). Второй водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера. Третий водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера, а также с 10 мМ концентрацией CaCl₂. Четвертый водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера и включали в него сахарозу в массовом соотношении 0,5/1 (сахароза/PACAP) по отношению к PACAP. Пятый водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера, 10 мМ концентрацией CaCl₂, а также такого количества сахарозы, обеспечивающего массовое соотношение 0,5/1 (сахароза/PACAP) по отношению к PACAP. Шестой водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера и 0,02 массовых % SDS. Затем готовили твердые частицы с PACAP из каждого из шести растворов с использованием уже описанного здесь процесса лиофилизации. Частицы с PACAP, приготовленные из каждого из этих растворов затем сохраняли при 60°C в течение двух месяцев, а стабильность PACAP, содержащегося в различных частицах, после такого хранения оценивали с помощью RP-HPLC и SEC. Как видно из Таблицы 7, присутствие гистидинового буфера значительно подавляет формирование агрегатов PACAP (приблизительно шестикратное уменьшение формирования агрегатов). Кроме того, сахароза, CaCl₂ и SDS дополнительно стабилизируют пептид, обеспечивая приблизительно 14-20-кратное уменьшение формирования агрегатов.

ПРИМЕР 7

Чтобы оценить стабилизирующий эффект CaCl₂ на частицы с PACAP, приготовленные при кислом или близком к нейтральному pH, изготавливали четыре разных типа частиц, хранившиеся при 60°C в течение двух месяцев, а затем анализировали деградацию PACAP. Четыре разных формы частиц готовили из четырех разных водных растворов. Каждый из четырех растворов включал в себя желаемое количество растворенного в нем PACAP, а pH каждого раствора устанавливали на желаемом уровне с использованием разведенного HCl. Первый водный раствор готовили без добавок (гистидина или CaCl₂), а pH первого раствора устанавливали на уровне 2. Второй водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией CaCl₂, а pH второго раствора устанавливали на уровне 2. Третий водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера, а четвертый водный раствор готовили с 10 мМ концентрацией гистидинового буфера, а также 10 мМ концентрацией CaCl₂. Твердые частицы с PACAP готовили из каждого из четырех водных растворов (состав каждой из различных частиц описан в Таблице 8) с помощью уже описанного процесса лиофилизации, а частицы с PACAP, полученные из четырех растворов, хранили при 60°C в течение двух месяцев. После хранения частиц при 60°C в течение двух месяцев стабильность PACAP, включенного в состав частиц, оценивали с помощью RP-HPLC и SEC. Как можно видеть из Таблицы 8, результаты такой оценки показывают, что CaCl₂ дополнительно усиливает стабильность частиц с PACAP при pH 2 и рН 6 (Таблица 8).

Изобретение раскрывает получение полипептидных форм в твердом состоянии, в которых полипептид стабилизирован против деградации при физиологических условиях или выходящих за эти пределы в течение длительного периода времени. Стабилизированные полипептидные частицы, содержащие полипептид, выбранный из надсемейства полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза/глюкагон, и стабилизирующий агент, выбранный из дисахаридов и моносахаридов, которые стабильны при выбранном кислом значении рН, при этом полипептидные частицы приготовлены из водного раствора, имеющего выбранное кислое значение рН, и стабильны при температурах до 60°С в течение по меньшей мере двух месяцев. Твердые полипептидные частицы по данному изобретению обеспечивают стабилизацию полипептида, позволяющую добиться 96%-ного восстановления стабилизированного пептида после хранения. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 8 табл.

1. Стабилизированные полипептидные частицы, содержащие полипептид, выбранный из надсемейства полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза/глюкагон, и стабилизирующий агент, выбранный из дисахаридов и моносахаридов, которые стабильны при выбранном кислом значении рН, при этом полипептидные частицы приготовлены из водного раствора, имеющего выбранное кислое значение рН, и стабильны при температурах до 60°С в течение по меньшей мере двух месяцев.2. Полипептидные частицы по п.1, в которых стабилизирующий агент выбран из трегалозы и метил-маннопиранозида.3. Полипептидные частицы по п.1, в которых стабилизирующий агент включен в состав полипептидных частиц в массовом соотношении стабилизирующего агента к полипептиду, находящемся в диапазоне от приблизительно 0,1/1 до приблизительно 1/1.4. Полипептидные частицы по п.1, в которых полипептид выбран из группы, состоящей из полипептидов, активирующих аденилатциклазу гипофиза, глюкагонов, глюкагоноподобных полипептидов, рилизинг-фактора гормона роста, вазоактивного интестинального полипептида, пептида гистидин-метионин, секретина и глюкозо-зависимого инсулинотропного полипептида.5. Стабилизированные полипептидные частицы, содержащие полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, и трегалозу, где массовое соотношение трегалозы и полипептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза, включенных в состав полипептидных частиц, составляет приблизительно 0,55/1, а полипептидные частицы приготовлены из водного раствора, имеющего кислое значение рН.6. Полипептидные частицы по п.1, дополнительно содержащие буфер, выбранный из аминокислотных и пептидных буферов, а также поверхностно-активное вещество.7. Полипептидные частицы по п.6, в которых поверхностно-активное вещество составляет от приблизительно 0,02 мас.% до приблизительно 0,2 мас.% полипептидных частиц.8. Полипептидные частицы по п.6, в которых в которых поверхностно-активное вещество содержит додецилсульфат натрия.9. Полипептидные частицы по п.6, в которых поверхностно-активное вещество содержит додецилсульфат натрия и составляет от приблизительно 0,02 мас.% до приблизительно 0,2 мас.% полипептидных частиц.10. Полипептидные частицы по п.1, которые при восстановлении проявляют кислое значение рН.11. Полипептидные частицы по п.1, в которых кислое значение рН при восстановлении частиц составляет приблизительно ниже 5.