СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА 6 ПОЗИЦИЯ 174(G/C) Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при определении генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 6 позиция 174(G/C), отнеся исследуемый образец к гетерозиготе или гомозиготе по одному из аллельных вариантов.

Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза. Известны различные способы, позволяющие определять тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченых проб (олигонуклеотидов) (Heesen М, Obertacke U, Schade FU, Bloemeke В, Majetschak М. The interleukin-6 G(-174)C polymorphism and the ex vivo interleukin-6 response to endotoxin in severely injured blunt trauma patients. Eur Cytokine Netw. 2002 Jan-Mar; 13(1): 72-7).

При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца.

Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и две пробы с различными флуоресцентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток (см. приложенный файл). ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является его высокая стоимость.

Техническим результатом изобретения является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность применения лишь одной меченой пробы, что снижает затраты на исследования и ведет к уменьшению их стоимости.

Указанный результат достигается тем, что в способе определения генотипа человека, основанном на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченых проб, генотип человека определяют по полиморфизму в гене интерлейкина 6 позиция 174(G/C), при этом реакционная смесь включает праймеры на участок с искомой заменой, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу следующего вида:

Праймер (аллель G): 5'-CCCCCTAGTTGTGTCTTGCG-3'

Праймер (аллель С): 5'-CCCCCTAGTTGTGTCTTGCC-3'

Общий праймер (аллели G,C): 5'-GAGCCTCAGACATCTCCAGTCC-3'

Общая проба (аллели G,C): (BHQ1)-5'-TTGGTGAGGG(FdT)GGGGCCAGAGC-3'-(P), где

BHQ1 -присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции;

FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Дополнительно в реакционную смесь включают следующие стандартные компоненты:

- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов;

- реакционный буфер (состав реакционного буфера: 100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl₂);

- бидистиллированная вода;

- Taq-полимераза;

- минеральное масло;

- парафин.

На чертеже показан пример графиков накопления ДНК, полученных с использованием детектирующего амплификатора для аллель-специфичных реакций. Ось координат «х» - это уровень флуоресценции, «у» - номер цикла. График А - результат исследования гомозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе). График Б - результат исследования гомозиготного образца (кривые изображены в логарифмическом масштабе). График В - результат исследования гетерозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе). График Г - результат исследования гетерозиготного образца (кривые изображены в логарифмическом масштабе).

ПЦР проводят в отдельных пробирках для каждого варианта аллеля. Для того чтобы отличить два аллеля используют праймер на участок с искомой заменой, отличающийся для каждого аллеля, и общий для двух аллелей праймер.

В результате указанного выбора праймеров и пробы можно судить о генотипе исследуемого образца по форме и расположению кривых накопления ДНК.

В данную реакционную смесь добавляют образец ДНК, и проводят ПЦР в режиме реального времени, регистрацию сигнала производят с помощью детектирующих амплификаторов.

Генотип (аллельный состав) исследуемого образца определяют после окончания программы амплификации по соотношению пороговых циклов для каждого из продуктов ПЦР (пороговый цикл - номер температурного цикла ПЦР, на котором детектирующий амплификатор зарегистрировал появление специфичного сигнала для данного вида продуктов реакции) следующим образом:

I. Определяют среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей.

II. Определяют разницу между Ct (ΔCt) для двух аллелей.

Для исследуемого образца возможны следующие варианты относительного расположения кинетических кривых:

а) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов. Такой образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму.

б) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше. Такой образец следует интерпретировать как гомозиготный. Генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct.

Для применения данного способа в промышленном масштабе компоненты реакционной смеси возможно выпускать в наборе, готовом для применения:

- пробирки со смесью для амплификации, запечатанной парафином, включающие реакционный буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентные пробы;

- пробирки с раствором Taq-полимеразой;

- пробирки с минеральным маслом.

При использовании данного набора в пробирки со смесью для амплификации добавляют раствор Taq-полимеразы, минеральное масло и подготовленный образец ДНК.

Для исследования рекомендуется использование крови человека, из которой производят выделение ДНК с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК, включающего:

- фиколл-урографин (реагент для выделения лимфоцитов);

- лизирующий раствор (реагент для лизиса клеток);

- реагент для преципитации (реагент для осаждения нуклеиновых кислот);

- промывочный раствор №1 (реагент для удаления посторонних примесей из препарата нуклеиновых кислот и инактивации РНКаз);

- промывочный раствор №2 (реагент для удаления посторонних примесей из препарата нуклеиновых кислот);

- буфер для растворения (реагент для растворения нуклеиновых кислот, свободный от РНКаз).

Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и касается способа определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 6, позиция 174(G/C). Сущность изобретения включает способ определения генотипа человека, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченых проб, при этом реакционная смесь включает праймеры на участок с искомой заменой, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа. 1 ил.

1. Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 6 позиция 174(G/C), основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченых проб, отличающийся тем, что реакционная смесь включает праймеры на участок с искомой заменой, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу следующего вида:

Праймер (аллель G): 5'-CCC CCT AGT TGT GTC TTG CG-3'

Праймер (аллель С): 5'-CCC CCT AGT TGT GTC TTG CC-3'

Общий праймер (аллели G,C): 5'-GAG CCT CAG ACA TCT CCA GTC C-3'

Общая проба (аллели G,C): (BHQ1)-5'-TTG GTG AGG G(FdT)G GGG CCA GAG C-3'-(P), где

BHQ1 - присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции,

FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т и после окончания программы амплификации определяют среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей, затем определяют разницу между Ct (ACt) для двух аллелей, и если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов, то такой образец следует интерпретировать, как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму, а если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше, то такой образец следует интерпретировать, как гомозиготный, генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct.

смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов;

реакционный буфер (состав реакционного буфера: 100 мМ Tris-HCl (рН 8,8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0,8% Р40, 20 мМ MgCl₂);

бидистиллированая вода;

Taq-полимераза;

минеральное масло;

парафин.