СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 185 ГЕНА BRCA1 (185delAG) Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2445369C2

1. Область техники

Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при определении генотипа человека по полиморфизму в позиции 185 гена BRCA1 (185delAG) с отнесением исследуемого образца к гетерозиготе или гомозиготе по одному из аллельных вариантов.

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин: он поражает как минимум каждую десятую жительницу развитых стран и занимает лидирующие позиции по смертности вследствие несовершенства ранней диагностики. Индивидуальный риск РМЖ зачастую ассоциирован с отягощенной наследственностью, т.е. онкологическими мутациями, связанными с риском развития РМЖ. Говоря о выявлении лиц, относящихся к группе риска по развитию РМЖ, необходимо учитывать идентифицированные и охарактеризованные к настоящему времени гены - маркеры, мутации в которых приводят к развитию рака молочной железы и рака яичника. Одним из таких генов является ген BRCA1.

2. Уровень техники

Из литературных данных известно, что у жительниц России примерно 20% РМЖ, возникших в молодом возрасте (до 40-50 лет) на фоне неблагоприятной наследственности, объясняются мутациями в гене BRCA1. Для ряда мутаций гена BRCA1 показана устойчивая ассоциация с возрастанием риска развития РМЖ на протяжении жизни на 50-80%. Одной из таких мутаций является полиморфизм в позиции 185 гена BRCA1 (185delAG).

Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией резульатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза.

Известны различные способы, позволяющие определить тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией резульатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно меченных проб (олигонуклеотидов) (Andreas R.Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V.16, issue 4, Desember 2005).

При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца.

Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и два зонда с различными флуорецентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является его высокая стоимость.

Предлагаемое изобретение делает более доступным и удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования и применению только одного меченого зонда.

3. Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность применения лишь одного меченого зонда, что снижает затраты на исследование.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР аллель-специфичных праймеров на участок с искомой заменой, отличающихся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и зонд следующего нуклеотидного состава:

Праймер (отсутствие делеции AG)

BRCA1-1851 5'-gCT ATg CAg AAA ATC TTA gAg TgT CC-3'

Праймер (делеция AG)

BRCA1-1852 5'-ATg CTA TgC AgA AAA TCT TAg TgT CC-3'

Общий праймер

BRCA1-1853 5'-CAg TTA Agg AAA TCA gCA ATT ACA ATA gC-3

Общий зонд

BRCAl-185t (BHQ1)-5'-TTC ACT CTT g(FdT)g CTg ACT TAC CAg ATg ggA CA-3'-(P),

где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду T.

Дополнительно в реакционную смесь включают следующие стандартные компоненты:

- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов;

- реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% P40, 20 мМ MgCl2);

- бидистилированная вода;

- Taq-полимераза;

- минеральное масло;

- парафин.

На фиг.1 показан пример графиков накопления ДНК, полученных для аллель-специфичных реакций с использованием детектирующего амплификатора. Ось координат «х» - это уровень флуоресценции, «у» - номер цикла. График А - результат исследования гомозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе). График Б - результат исследования гетерозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе).

ПНР проводят в отдельных пробирках для каждого варианта аллеля. Для того чтобы отличить два аллеля, используют праймер на участок с исходной заменой, отличающийся для каждого аллеля, и общий для двух аллелей праймер.

В результате указанного выбора праймеров и зонда можно судить о генотипе исследуемого образца по форме и расположению кривых накопления ДНК.

4. Осуществление изобретения

В качестве материала для исследования рекомендуется использовать кровь, соскобы букального эпителия, биоптаты мягких тканей человека. Выделение ДНК из биоматериала производится с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК (не является предметом данного патента).

В данную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПНР в режиме реального времени, регистрацию сигнала осуществляют с помощью детектирующего амплификатора.

Генотип (аллельный состав) исследуемого образца определяют после окончания программы амплификации по соотношению пороговых циклов для каждого из продуктов ПЦР (пороговый цикл - номер температурного цикла ПЦР, на котором детектирующий амплификатор зарегестрировал появление специфичного сигнала для данного типа продукта реакции) следующим образом:

1 определяют среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей;

2 определяют разницу между Ct (ΔCt) для двух аллелей.

Для исследуемого образца возможны следующие варианты относительного расположения кинетических кривых:

A) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше. Такой образец следует интерпретировать как гомозиготный по исследуемому полиморфизму. Генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct.

Б) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов. Такой образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму.

Для применения данного способа в промышленном масштабе компоненты реакционной смеси возможно выпускать в наборе, готовом для применения:

- пробирки со смесью для амплификации, запечатанной парафином, включающие реакционный буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентные зонды;

- пробирки с раствором Taq-полимеразы;

- пробирки с минеральным маслом.

При использовании данного набора в пробирки со смесью для амплификации добавляют раствор Taq-полимеразы, минеральное масло и подготовленный образец ДНК.

Похожие патенты RU2445369C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 5382 ГЕНА BRCA1 (5382insC) 2010
  • Турчанинова Мария Андреевна
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2445368C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 4343 ГЕНА BRCA1 (rs1799950) 2010
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2445373C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 2579 ГЕНА BRCA1 (rs4986850) 2010
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2445371C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 6174 ГЕНА BRCA2 (617delT) 2010
  • Ребриков Денис Владимирович
RU2445372C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА 1-АЛЬФА ПОЗИЦИЯ 889(С/Т) 2006
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Грудакова Елена Геннадьевна
RU2332669C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА 6 ПОЗИЦИЯ 174(G/C) 2006
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Грудакова Елена Геннадьевна
RU2332670C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА 18 ПОЗИЦИЯ 607(С/А) 2006
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Грудакова Елена Геннадьевна
RU2343480C2
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ДНК-ТЕСТИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ Н63D И C282Y В ГЕНЕ HFE, СВЯЗАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМ ГЕМОХРОМАТОЗОМ 2006
  • Самоходская Лариса Михайловна
  • Ткачук Всеволод Арсеньевич
  • Бочков Валерий Николаевич
  • Балацкий Александр Владимирович
  • Макаревич Павел Игоревич
RU2304170C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ BRCA1 5382insC И СНЕК2 1100delC 2011
  • Анисименко Максим Сергеевич
  • Коваленко Сергей Петрович
RU2473700C2
Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для определения аллей полиморфизма rs55986091 и способ его применения 2022
  • Винокуров Михаил Андреевич
  • Миронов Константин Олегович
  • Домонова Эльвира Алексеевна
  • Романюк Татьяна Николаевна
  • Попова Анна Анатольевна
  • Акимкин Василий Геннадьевич
RU2804110C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 445 369 C2

Реферат патента 2012 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ПОЗИЦИИ 185 ГЕНА BRCA1 (185delAG)

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 185 гена BRCA1 (185delAG). Способ заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд. Изобретение позволяет снизить затраты на генетические исследования и повысить их доступность за счет использования стандартного оборудования и применения только одного меченого зонда. 2 ил.

Формула изобретения RU 2 445 369 C2

Способ определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 185 гена BRCA1 (185delAG), основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в реальном времени, характеризующийся тем, что используются праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, общий для двух аллелей праймер и общий флуоресцентный зонд следующего нуклеотидного состава:
Праймер (отсутствие делеции AG)
BRCA1-1851 5'-gCT ATg CAg ААА АТС ТТА gAg TgT СС-3'
Праймер (делеция AG)
BRCA1-1852 5'-ATg СТА TgC AgA ААА ТСТ TAg TgT СС-3'
Общий праймер
BRCA1-1853 5'-CAg ТТА Agg ААА ТСА gCA АТТ АСА АТА gC-3
Общий зонд
BRCAl-185t (BHQ1)-5'-TTC ACT CTT g(FdT)g CTg ACT TAC CAg ATg
ggA CA-3'-(P),
где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т,
и после проведения ПЦР с использованием указанных праймеров определяется среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей, и фиксируется разница между Ct (ΔCt) для двух аллелей, и если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов, такой образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму, а если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше, то такой образец следует интерпретировать как гомозиготный по исследуемому полиморфизму, а генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2012 года RU2445369C2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА 18 ПОЗИЦИЯ 607(С/А) 2006
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Грудакова Елена Геннадьевна
RU2343480C2
Двухтактный транзисторный инвертор 1981
  • Ковалев Николай Сергеевич
SU964929A1
WEITZEL J.N
et al., Evidence for common ancestral origin of a recurring BRCA1 genomic rearrangement identified in high-risk Hispanic families, Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev., 2007, v.l6, n.8, p.1615-1620
JAZAERI A.A
et al., Gene expression profiles of BRCA1-linked, BRCA2-linked, and sporadic ovarian cancers, J
Natl
Cancer Inst., 2002, v.94, n.l3, p.990-1000.

RU 2 445 369 C2

Авторы

Турчанинова Мария Андреевна

Ребриков Денис Владимирович

Даты

2012-03-20Публикация

2010-06-07Подача