СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ Российский патент 2008 года по МПК A01H1/06 A01C1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для повышения митотической активности меристем однодольных и двудольных растений.

Известен способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур для синхронизации клеточных делений в корневой меристеме. Способ заключается в однократном воздействии на семена ударной волной в водной среде при 2°С с созданием импульсов с параметрами из заданного интервала значений с последующим замачиванием семян в воде при данной температуре в течение 12 ч. Использование предложенного способа позволяет увеличить эффект синхронизации клеточных делений и продления фаз митотического цикла для проведения селекционно-генетических работ (см. патент на изобретения 2180474, МПК А01С 1/00).

Недостатками способа являются необходимость использования взрывчатых веществ, применения дополнительного оборудования для создания пониженной температуры и необходимость замачивания и высушивания семян после воздействия, что делает метод практически непригодным для обработки крупнотоннажных партий семян при использовании в сельскохозяйственном производстве. Кроме того, повышение митотической активности в этом способе достигается за счет блокирования клеточных делений на определенной стадии, а не за счет выхода клеток из состояния покоя. Это обеспечивает не постоянное, а однократное повышение митотической активности клеток.

Отмечается возможность стимуляции митотической активности меристем лука при ослаблении геомагнитного поля в 1 млн. раз (Шрагер Л.Н. Цитогенетический эффект действия ослабленного магнитного поля на правые и левые изомеры лука // Материалы Третьего Всесоюзного симпозиума «Влияние магнитных полей на биологические объекты». 17-19 июня 1975. - Калининград, 1975. - С.194-195).

Однако для реализации данного решения необходимо дорогостоящее экранирующее устройство.

Наиболее близким к предлагаемому решению является способ повышения митотической активности в корнях ржи сорта Вятка при действии неоднородного 60 Э и однородного 20 Э постоянных магнитных полей низкой напряженности (О некоторых особенностях действия постоянного магнитного поля на прорастание семян / Ю.И.Новицкий, В.Ю.Стрекова, Г.А.Тараканова и др. // «Говорят молодые ученые» (Доклады на первой Московской областной конференции молодых ученых). - М.: Изд. Московский рабочий, 1966, - т 1. - С.47-51).

Данный способ повышения митотической активности сопровождается увеличением размера ядер, числа ядрышек и содержания РНК в клетках, что говорит о необходимости более детального изучения вопроса о характере воздействия исследуемых постоянных магнитных полей на генетический аппарат клетки и безопасности такого воздействия. Кроме того, эффективность данного способа не подтверждена для большого числа видов растений.

Известно, что магнитные поля с различными биотропными параметрами способны оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на митотическую активность растительных тканей.

При разработке данного изобретения преследовалась задача создания простого способа при сокращении времени на его реализацию путем воздействия на семена растений переменным магнитным полем и подбора таких параметров электромагнитного поля и условий воздействия, которые сопровождались бы значительным и стабильным повышением митотической активности меристем как однодольных, так и двудольных растений.

Поставленная задача решается тем, что в способе стимуляции митотической активности клеток растений, включающем воздействие на семена растений магнитным полем, согласно решению воздействие осуществляют низкоинтенсивным низкочастотным переменным магнитным полем.

Оптимальные режимы воздействия: поле с индукцией 25 мТл в диапазоне частот 1-6 Гц в течение от часа до нескольких суток. При воздействии магнитным полем с большими значениями индукции время воздействия может быть сокращено; при уменьшении индукции следует увеличить время воздействия.

Воздействие осуществляют на прорастающие или покоящиеся семена. Воздействие на покоящиеся семена осуществляют не позднее, чем за 3 суток до проращивания.

Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 представлены графики изменения стимуляции митотической активности апикальных меристем однодольных растений на протяжении 6 фиксаций при проращивании зерновок в магнитном поле с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл в 3-х повторностях для двух культур: кукурузы и сорго. На фиг.2 приведена диаграмма среднего уровня стимуляции митотической активности меристем кукурузы (А) и сорго (Б) после воздействия магнитным полем различной частоты в течение 6 часов. На фиг.3 - диаграмма среднего уровня стимуляции митотической активности апикальных меристем корней кукурузы (1), сорго (2), подсолнечника (3) и укропа (4) при воздействии поля с частотой 6 Гц в течение 1 часа на покоящиеся (А) и прорастающие (Б) семена. На фиг.4 проиллюстрировано угасание стимулирующего эффекта на митотическую активность меристем сорго, вызываемого воздействием магнитного поля с частотой 6 Гц и индукцией 25 мТл в течение 1 часа на крупные зерновки при проращивании непосредственно после этого воздействия, а также через 3, 7, 20 и 40 суток.

В общем случае требуемый эффект достигается для всех исследованных видов однодольных и двудольных растений при использовании низкочастотного низкоинтенсивного переменного магнитного поля. В случае, если воздействию подвергаются покоящиеся семена, экспозицию в поле следует осуществлять не позднее чем за 3 сут до их проращивания.

В дальнейшем изобретение поясняется описанием конкретных, но не ограничивающих изобретение вариантов осуществления.

Способ стимуляции митотической активности клеток растений был реализован следующим образом. Источником переменного магнитного поля с частотами от 1 до 6 Гц служил вращающийся диск диаметром 25 см, на котором радиально были прикреплены чередующиеся по полярности постоянные магниты с осью намагничивания, перпендикулярной плоскости диска. Диск, находящийся под чашкой Петри с семенами или проростками, вращался с помощью электродвигателя с фиксированной скоростью, обеспечивающей наличие в любой точке рабочей камеры переменного магнитного поля (МП) заданной частоты. Индукция МП внутри камеры вблизи ее дна составляла 25 мТл. Длительность экспозиции МП при данном значении индукции варьировала в зависимости от объекта, условий воздействия и частоты МП.

Пример 1. Проводились эксперименты с кукурузой линии Пурпурный тестер скороспелый. Растения постоянно находились в МП 6 Гц с начала замачивания зерновок в воде (замачивание длилось 24 часа) до момента одной из шести фиксаций материала (следующих друг за другом с одночасовым интервалом). Контрольные партии семян или проростков находились вне поля при прочих равных условиях. Опыты проводились в трех повторностях. Фиксация кончиков корешков, достигших 0,8 см, проводилась через сутки после начала проращивания. На давленых ацетокарминовых препаратах определялся митотический индекс в каждом случае в результате анализа от 15 до 30 тысяч клеток.

В результате анализа были отмечены значительные уровни стимуляции митотической активности, причем в различных повторностях в разные часы фиксации превышение уровня митотического индекса в опыте по сравнению с контролем составило от 16 до 62% (фиг.1).

Количественное преобладание среди делящихся клеток таковых на стадии профазы (в 90-99% делящихся клеток) позволяет сделать вывод, что материал был зафиксирован в период, соответствующий началу вступления меристематических клеток в первый, относительно синхронный, митоз. Таким образом, магнитные поля способны оказывать влияние на растительные объекты, начиная уже с самых ранних этапов их постэмбрионального развития.

Пример 2. Аналогичный эксперимент был проведен с сорго сорта Пищевое-35. Отличие рассматриваемой серии экспериментов от предыдущей заключается в более поздних сроках фиксации: для цитологического анализа фиксировались кончики корешков, достигших длины 1-1,5 см, через двое суток с момента начала проращивания. Митотический индекс определялся в результате анализа не менее 3 тысяч клеток.

Стимуляция МА меристем сорго в разные часы фиксации составляет 4-21% (фиг.1). Относительно низкие значения стимулирующего эффекта по сравнению с таковыми для кукурузы могут объясняться не только видовыми особенностями. Так как меристемы сорго исследовались на более поздней стадии развития проростков, это может быть связано с десинхронизацией циклов митоза.

Пример 3. 6-часовому воздействию поля с частотами 1 и 3 Гц подвергались покоящиеся зерновки кукурузы Пурпурный тестер скороспелый и сорго Пищевое-35. Непосредственно после воздействия поля зерновки замачивались в воде на 18 часов. Фиксировались кончики корешков через двое суток с момента начала проращивания. Митотический индекс определялся на основании анализа не менее 9 тысяч клеток.

Во всех случаях был отмечен стимулирующий эффект (фиг.2). Средний уровень стимуляции митотической активности меристем кукурузы под действием поля с частотой 1 Гц составляет (10±1,73)%, с частотой 3 Гц - (8±3,29)%. Аналогичные показатели для сорго выше - (26±2,42) и (18±3,67)% соответственно.

Пример 4. Проведена серия экспериментов, заключающаяся в одночасовой экспозиции покоящихся и прорастающих семян однодольных и двудольных растений в магнитном поле с частотой 6 Гц. Как представители однодольных использовались кукуруза (линия Пурпурный тестер скороспелый) и сорго (сорт Пищевое-35), как представители двудольных - подсолнечник (сорт Саратовский 85) и укроп (сорт Грибовский). Перед экспозицией семена замачивались в воде на 18 часов. Аналогичные операции проводились после экспозиции в поле покоящихся семян. Фиксация кончиков корешков проводилась через двое суток с момента начала проращивания. Митотический индекс определялся в результате анализа не менее 9 тысяч клеток.

Для всех объектов получены воспроизводимые эффекты стимуляции митотической активности в среднем для большинства культур - 16% (для сорго - 26%) при воздействии на покоящиеся семена и от 10 до 20% при воздействии на прорастающие (фиг.3).

Наибольший эффект стимуляции активности меристем сорго - (26±1,53)% - отмечен при экспозиции в поле покоящихся семян. Следует отметить, что уровень митотической активности в контроле во всех вариантах и повторностях был сходным. Воздействие на прорастающие зерновки сорго полем 6 Гц 1 час сопровождается стимулирующим эффектом, который составляет (13±2,61)%.

Средний уровень стимуляции митотической активности меристем кукурузы при воздействии на покоящиеся зерновки составляет (16±4,81)%. Однако воздействие поля 6 Гц 1 час на прорастающие зерновки кукурузы оказалось более эффективным: стимулирующий эффект в среднем составляет (20±4,00)%.

Воздействие поля на покоящиеся семянки подсолнечника сопровождалось повышением митотического индекса в среднем на (16±6,51)%. Воздействие на прорастающие семянки подсолнечника менее эффективно, так как в этом случае среднее значение стимулирующего эффекта равно (10±5,24)%.

Экспозиция в поле 6 Гц 1 час покоящихся семян укропа сопровождается повышением митотической активности в среднем на (16±2,20)%. Несколько больший средний уровень стимуляции наблюдается в эксперименте с прорастающими семенами - (18±3,19)%.

Пример 5. Исследовалось действие магнитного поля с частотами 15 и 30 Гц на покоящиеся зерновки сорго (сорт Пищевое-35). После экспозиции семена замачивались в воде на 18 часов. Фиксация кончиков корешков проводилась через двое суток с момента начала проращивания. Митотический индекс в каждой из трех повторностей определялся в результате анализа не менее 3 тысяч клеток. В этой серии экспериментов существенных изменений митотической активности в опыте по сравнению с контролем не отмечалось.

Пример 6. Проводилась серия экспериментов для выявления длительности сохранения эффекта стимулирующего воздействия на митотическую активность меристем растений после экспозиции покоящихся семян в магнитном поле. Зерновки сорго, подвергнутые воздействию поля 6 Гц 1 час, проращивались через разные промежутки времени после этого воздействия. Было установлено, что стимулирующий эффект не наблюдается у растений, полученных из семян, находившихся в МП неделю назад и раньше (фиг.4). Отсюда следует важный вывод для эффективного практического применения стимулирующего действия МП на митотическую активность: семенной материал рекомендуется проращивать в течение 3 суток после экспозиции в поле.

Выше были приведены примеры осуществления способа, которые достаточно подробно и точно характеризуют его сущность. Таким образом, следует признать, что при воздействии магнитного поля с индукцией 25 мТл в диапазоне частот 1-6 Гц на покоящиеся и прорастающие семена однодольных и двудольных растений удается добиться повышения митотической активности меристем.

Целесообразно для каждого объекта подбирать оптимальное значение частоты и условий воздействия. Однако в любом случае диапазон частот 1-6 Гц МП с индукцией 25 мТл обеспечивает достижение положительных результатов.

На семена однодольных или двудольных растений воздействуют низкочастотным переменным магнитным полем низкой интенсивности для стабильного повышения митотической активности их меристем. Оптимальными режимами воздействия являются поле с индукцией 25 мТл в диапазоне частот 1-6 Гц в течение от часа до нескольких суток. При воздействии магнитным полем с большими значениями индукции время воздействия может быть сокращено. При меньшей индукции время воздействия увеличивают. Воздействию подвергают прорастающие или покоящиеся семена. На покоящиеся семена воздействуют не позднее, чем за 3 суток до их проращивания. 5 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ стимуляции митотической активности клеток растений, заключающийся в воздействии на семена растений магнитным полем, отличающийся тем, что воздействие осуществляют низкоинтенсивным низкочастотным переменным магнитным полем.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют на прорастающие или покоящиеся семена.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют полем с индукцией 25 мТл в диапазоне частот 1-6 Гц в течение от одного часа до нескольких суток.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на прорастающие семена укропа или кукурузы воздействуют с частотой 6 Гц в течение часа.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что на покоящиеся семена сорго или подсолнечника воздействуют с частотой 6 Гц в течение часа.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие на покоящиеся семена осуществляют не позднее чем за 3 сут до проращивания.