СПОСОБ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ СЕМЯН СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ СИНХРОНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИЙ В КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЕ Российский патент 2002 года по МПК A01C1/00 A01H1/06 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и растениеводству, а именно к физическим методам воздействия на биологические объекты, в частности на семена, и может быть использовано в селекционно-генетической работе, направленной, например, на получение ценных мутантов сельскохозяйственных растений.

Клетки на разных фазах митотического цикла проявляют неодинаковую чувствительность к мутагенам. Синхронизируя клетки меристемы к чувствительным фазам клеточного цикла и изменяя продолжительность фаз митоза, можно повысить чувствительность клеток к мутагенам, т.е. способствовать увеличению частоты и спектра индуцированных мутаций, что важно для проведения селекционно-генетических работ.

Известен способ обработки семян сельскохозяйственных культур, при котором семена помещают в воду и создают ударную волну с давлением фронта 5...40 МПа за счет детонации взрывчатого вещества [1]. Величина давления и время его действия регулируются массой взрывчатого вещества и расстоянием между ним и поверхностью семян. Применение предлагаемого способа позволяет осуществить обработку семян при условии их объемного сжатия в течение короткого промежутка времени, не разрушая семена как биологические объекты. Указанный способ приводит к повышению урожайности сельскохозяйственных культур. Данное воздействие оказывает стимулирующее влияние на рост растения, однако состояние покоя в меристеме после ударно-волновой обработки является непродолжительным.

Известным методом физического воздействия для синхронизации клеточных делений в зародышевой меристеме зерновых культур также является способ обработки семян электромагнитным полем частотой 59,0-62,6 ГГц при плотности потока мощности 100-300 мкВт•см^-2 в непрерывном режиме в течение 10-30 мин [2] . Недостатки указанного способа заключаются в относительно невысокой эффективности синхронизации делений (не более 1,5...2,0 раз) и невозможности воздействия на отдельные фазы митотического цикла.

Известны также способы синхронизации митозов в меристеме ячменя, состоящие в воздействии 5-аминоурацила (5-АУ) [3], или 5-АУ и колхицина [4] на проростки или замоченные семена с последующей экспозицией объектов в воде при 2^oС в течение 12 ч. Указанные вещества могут вызывать отдаленные последствия в генетическом аппарате растений. Данные способы трудоемкие, многостадийные, длительные. Они требуют применения дорогостоящих реактивов и приводят к травмированию при высеве проростков, находящихся в состоянии активного прорастания. Вместе с тем эффект синхронизации при данном способе обработки меньше, чем в предыдущем.

Целью изобретения является увеличение эффекта синхронизации клеточных делений и продления отдельных фаз митотического цикла для проведения селекционно-генетических работ.

Поставленная цель достигается тем, что сухие семена обрабатывают ударной волной в водной среде при 2^oС с созданием импульсов 155...554 H•c•м^-2 с последующим их замачиванием в воде при данной температуре в течение 12 часов. Величина импульса регулируется массой взрывчатого вещества и расстоянием между ним и поверхностью семян. Последействие обработки сохраняется в течение 30 дней.

Сравнение известных решений с заявленным показало, что его отличительным признаком является выдерживание семян при 2^oС в течение 12 ч после ударно-волновой обработки с целью усиления стрессовой реакции и состояния покоя для повышения эффективности синхронизации делений клеток в меристемах и продления отдельных фаз митотического цикла. Проведение ударно-волновой обработки в воде при 2^oС необходимо для обеспечения стрессовой ситуации в момент прохождения ударной волны. Непродолжительное замачивание при ударно-волновой обработке допускает высушивание семян и их последующее хранение без изменения всхожести. Длительный период последействия является существенным преимуществом заявляемого способа, так как увеличивает время для выбора оптимальных сроков посева и (или) последующего воздействия мутагена на семена.

Пример. Сухие семена сельскохозяйственных культур (гречиха) подвергали ударно-волновой обработке в воде при 2^oС. Величину создаваемого импульса изменяли в диапазоне от 100...800 Н•c•м^-2. Величину удельного импульса (J, Н•с•м^-2) рассчитывали по формуле [5] J =P•Θ, где Р - давление на фронте ударной волны, МПа; Θ характеристическое время, определяющее интенсивность падения давления в данной точке с течением времени.

,
где Q - масса заряда взрывчатого вещества, кг;
R - расстояние от центра взрыва до поверхности семян, м.

После ударно-волновой обработки семена выдерживали в воде при 2^oС в течение 12 ч, что соответствует оптимальным режимам, приводимым в работах [3, 4]. В дальнейшем семена высушивали на воздухе при комнатной температуре до тех пор, пока их масса не станет постоянной.

После высушивания отбирали зрелые, выполненные плоды и проращивали их при 25^oС во влажной атмосфере. Корни проростков, начиная с возраста 48 ч, фиксировали в уксусной кислоте с этанолом (1:4) в течение 12 ч с интервалом 2 ч. Материал окрашивали в ацетоорсеине. Давленые препараты просматривали при 600-кратном (об. 40^х, ок. 15^х) увеличении и определяли митотический и фазовый индексы (МИ, ФИ) апикальных корневых меристем. Поскольку были обнаружены значительные изменения среднего МИ, для определения синхронности митозов использовали относительное увеличение максимального МИ по сравнению со средним в каждом варианте опыта и соотносили результаты, полученные на опытных растениях, с контролем.

Изменение МИ проростков гречихи в динамике приведены в табл. 1, где отражены данные для импульсов, равных 155...554 H•c•м^-2. Импульсы от 100 до 155 Н•с•м^-2 не повлияли на клеточные деления, и МИ не отличались от контрольных результатов. Импульсы свыше 554 Н•с•м^-2 оказались губительными для зародышей семени.

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что колебания МИ контрольных проростков гречихи были незначительными. Максимальное значение достигалось в 50 ч и составляло , а среднее - . Относительное увеличение максимального МИ равнялось 1,20. При J=155 Н•с•м^-2 среднее значение МИ составило . Максимальное значение МИ в 52 ч составляло . Его относительное увеличение по сравнению со средним в данном варианте опыта составило 1,77, то есть синхронность делений превысила контроль на 47,5%. При J=401 Н•с•м^-2 среднее значение МИ составляло . Максимальное значение МИ возросло до через 50 ч. Относительное увеличение МИ соответствовало 3,30, что указывало на увеличение синхронности клеточных делений в 2,8 раза по сравнению с контролем. При воздействии J=554 Н•с•м^-2 среднее значение МИ уменьшилось до , что было на 31% ниже контроля. Максимальное значение МИ соответствовало 88,1%, его относительное увеличение составило 1,57. Синхронность митозов возросла на 30,8% относительно контроля.

Отмечены колебания фазовых индексов (фиг. 1,а). У 48-50-часовых контрольных проростков более клеток находились на стадии профазы, а у 52-56-часовых проростков начали преобладать клетки на стадии мета- и анафазы. Их количество превышало от общего числа клеток. Количество телофазных клеток начинало увеличиваться у 54-56-часовых проростков и достигло максимума у 58-часовых проростков. Максимум МИ соответствовал 50-52-часовым проросткам, когда или преобладали профазные клетки (), или количество клеток в стадии про-, мета-, анафазы было приблизительно одинаково (соответственно 257, 285, ), а в стадии анафазы - несколько ниже, (фиг. 1,а).

После обработки при J=155 Н•с•м^-2 амплитуда колебаний ФИ (рис.1,б) была более значительной, чем в контроле. Отмечено существенное увеличение числа анафазных клеток (до ) у 54-часовых проростков, указывающее на задержку большинства клеток на данной стадии. Эти нарушения были временными, так как уже через 56 часов отмечался максимум телофазных клеток (). Максимум МИ соответствовал прохождению метафазы и особенно анафазы большинством клеток, что также указывало на изменение в смене фаз митоза.

Обработка J=401 Н•с•м^-2 способствовала наиболее значительным изменениям ФИ (фиг. 1,в). Увеличилось количество клеток, находящихся на стадии профазы (48 часов - , 50 часов - ) и анафазы (52 часа - , 54 часа - ). Первые телофазы появились только через 52 часа, тогда как в контроле они присутствовали постоянно.

Под действием J=554 Н•с•м^-2 амплитуда колебаний ФИ также превышала контроль (фиг. 1, г). Характерно увеличение количества метафазных клеток до через 52 и 54 часа и анафазных клеток до через 54 часа. Количество профазных клеток 48 часов в опыте соответствовало контролю ( и соответственно). Первые телофазы появились только через 54 часа, а через 56 часов составляли уже .

При анализе аномалий делений анафазно-телофазным методом во всех вариантах опыта аберраций хромосом (мосты и фрагменты) не было обнаружено. Таким образом, предварительная обработка оказывает влияние на прохождение митотического цикла, но не вызывает повреждений хромосом, то есть сама не вызывает мутагенного эффекта и может быть использована для синхронизации клеточных делений.

В специальных экспериментах исследовалось последействие обработки. Семена обрабатывали по описанной методике, 3 партии семян хранили в течение 1, 30 и 40 суток, проращивали и определяли МИ в возрасте 48-58 часов. Данные приведены в табл. 2. Видно, что последействие обработки сохраняется при хранении семян до 30 суток.

Как следует из табл. 2, при хранении семян в течение 1 суток после обработки обнаруживается максимальный эффект синхронизации (в 1,47...2,75 раз). При хранении в течение 30 суток эффективность воздействия практически не изменяется. При хранении в течение 40 суток эффект синхронизации митозов снижается и составляет 9-98%.

Источники информации
1. Патент РФ 2083073 Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур. Атрощенко Э.С., Хрянин В.Н и др.

2. А. С. 1692408 "Способ предпосевной обработки семян для синхронизации клеточных делений в зародышевой меристеме зерновых культур. Н.Г. Шестопалова, Л.Г. Головина и др.

3. Бендрорайтите Л.П. Цитология и генетика, 1978, т.12, 3 - С.195-199.

4. Артемьева В.В. Автореферат диссертации на соискание уч. степени кан. биол. наук. Л., 1987, 22 с.

5. Пихтовников Р.В., Завьялова В.И. Штамповка листового металла взрывом. М.: Машиностроение, 1964. - С.42-43.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и растениеводству, а именно к физическим методам воздействия на биологические объекты, в частности на семена, и может быть использовано в селекционно-генетической работе, направленной, например, на получение ценных мутантов сельскохозяйственных растений. Способ заключается в однократном воздействии на семена ударной волной в водной среде при 2^oС с созданием импульсов 155...554 Н•с•м^-2 с последующим замачиванием семян в воде при данной температуре в течение 12 ч. Использование предложенного способа позволяет увеличить эффект синхронизации клеточных делений и продления фаз митотического цикла для проведения селекционно-генетических работ. 2 табл., 1 ил.

Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур для синхронизации клеточных делений в корневой меристеме, включающий однократное воздействие на семена ударной волной в водной среде, отличающийся тем, что ударную обработку семян проводят в воде при 2^oС с созданием импульсов 155. . . 554 Н•с•м^-2 с последующим замачиванием семян в воде при данной температуре в течение 12 ч.