КАПИЛЛЯРОУКРЕПЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2008 года по МПК A61K36/185 A61P9/14 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается применения природного гексанового экстракта бересты (ГЭБ) в качестве капилляроукрепляющего средства.

В экстрактах внешней коры различных видов берез преобладают пентациклические тритерпеноиды ряда лупана, основными компонентами которых являются бетулин, обуславливающий белый цвет коры березы, и лупеол. Структурные формулы бетулина и лупеола представлены на фиг.1.

Известные способы получения экстрактов бересты основаны на ее обработке различными органическими растворителями. Для получения сухих экстрактов растворитель отгоняют и при необходимости производят дополнительную очистку продукта (Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение // Химия древесины. - 1994. - №3. - С.3-28).

Описан способ выделения сухого экстракта, включающий обработку бересты 90-95%-ным этиловым спиртом при температуре 70-75°С в присутствии активированного угля (RU 2172178).

Известен способ получения сухого экстракта обработкой бересты уайт-спиритом в течение 2 часов при 155°С (RU 2138508).

Предложен способ получения экстракта бересты обработкой измельченной бересты гексаном в течение 3-5 часов с последующей обработкой экстракта равным объемом воды (RU 2206572).

С целью выделения основного компонента экстрактов коры березы - бетулина - полученные экстракты подвергают дальнейшей обработке водой и водно-щелочными растворами, в которых бетулин практически не растворим. Однако существующие методы получения и очистки бетулина являются достаточно трудоемкими и энергетически затратными, что существенно удорожает его стоимость и ограничивает области применения в качестве биологически активного вещества. Технически гораздо проще и дешевле использовать бетулинсодержащие экстракты бересты, получаемые традиционными методами экстракции органическими растворителями.

Для получения гексанового экстракта бересты измельченную бересту коры березы (Betulla pendula Roth) фракции 1-2 мм экстрагировали кипящим гексаном в аппарате Сокслета. После удаления гексана на роторном испарителе получили сухой экстракт белого цвета.

Анализ и идентификацию экстракта бересты проводили с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле, хромато-масс-спектрометрии (ХМС) на приборе GCD Plus (Hewlett-Packard) с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора. Условия хроматографирования были следующими: температура ввода пробы 250°С; начальная температура 220°С, программа подъема температуры до 280°С со скоростью 2°С/мин, изотермальный режим 2 мин, подъем температуры до 300°С со скоростью 10°С/мин, изотермальный режим 20 мин; температура трансферной линии 280°С, источника ионов - 175°С, режим электронного удара при 70 eV, детекция масс от 45 до 450 m/z, в качестве газа-носителя использовали гелий; скорость потока составляла 1 мл/мин. Идентификация компонентов осуществлена сопоставлением времен удерживания пиков на хроматограмме и полных масс-спектров отдельных компонентов с соответсвующими данными чистых соединений библиотеки масс-спектрометра. Относительное количественное содержание химических компонентов экстракта рассчитано методом внутренней нормализации площадей пиков без корректирующих коэффициентов чувствительности.

Элементный анализ экстрактов проводили с использованием элементного анализатора FLASH™ 1112. Данные по элементному составу бересты и гексанового экстракта бересты представлен в табл.1. Температура плавления гексанового экстракта бересты составляет 246°С.

Согласно данным тонкослойной хроматографии основным компонентом гексанового экстракта являются тритерпеновые соединения и в небольших количествах присутствуют полярные вещества и алифатические углеводороды. Хроматограмма гексанового экстракта бересты представлена на фиг.2, а относительное содержание компонентов, согласно данным ХМС, приведено в табл.2.

Полученные данные (фиг.2 и табл.2) свидетельствуют о том, что относительное содержание бетулина в ГЭБ составляет 59.4%, лупеола 31.7%. Остальные компоненты ГЭБ, относительное содержание которых составляет от 0.6 до 2.5%, представляют собой соединения лупанового ряда с молекулярной массой 426 и фитостерины, а также минорные примеси альдегидов бетулина и лупеола с молекулярной массой 440 и 424 соответственно.

В последнее время проводятся интенсивные исследования фармакологических свойств экстрактов березовой коры.

Известны гепатопротекторные (RU 2244554) и антивирусные (RU 2252774) свойства экстракта бересты, его адаптогенное (RU 2240799) и антигипоксическое (RU 2252773) действие, способность индуцировать выработку интерферона (RU 2252775).

Задачей изобретения является расширение спектра фармакологического действия экстрактов бересты березовой коры и применение гексанового экстракта бересты в качестве капилляроукрепляющего средства.

Известны капилляроукрепляющие средства - рутин, кверцетин, дигидрокверцетин (RU № 2014841).

Наиболее близким к предлагаемому по назначению препарату является капилляроукрепляющее средство 1%-ный спиртовый раствор бетулина (RU 2276980). Недостатком использования бетулина в качестве капилляроукрепляющего средства являются сложные, многоступенчатые, трудоемкие способы получения и очистки бетулина, которые существенно удорожают его стоимость.

Исследование токсичности гексанового экстракта бересты.

Острая токсичность гексанового экстракта бересты была исследована в опытах на белых беспородных мышах. ГЭБ вводили внутрижелудочно в виде 10%-ной крахмальной взвеси в дозах от 1000 до 7000 мг/кг. Токсичность оценивали по клиническим симптомам отравления, физиологическим тестам и выживаемости животных в течение 2-х недель. При внутрижелудочном введении ГЭБ в дозах от 3000 до 6000 мг/кг гибели животных не отмечено, у животных наблюдалось только незначительное угнетение центральной нервной системы. При введении ГЭБ в дозе 7000 мг/кг наблюдалась гибель части животных, причем в картине острого отравления наблюдалось нарушение дыхания и снижение двигательной активности.

На основании проведенного токсикологического исследования сделан вывод о том, что ГЭБ не является ядовитым и согласно международной токсикологической классификации относится к 4 классу малотоксичных веществ: среднесмертельная доза (ЛД₅₀) бетулина составляет более 7000 мг/кг (табл.3).

Пример 1. Исследование капилляроукрепляющего действия ГЭБ.

Изучение влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи проводили по методу Ойвина и Монаковой на мышах массой 10-12 г. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода 1%-го водного метиленового синего в очаг воспаления, вызываемого нанесением на депилированную поверхность кожи 0,05 мл ксилола. Опытным группам мышей (по 15 животных в каждой) за 1 час до внутрибрюшинного введения 0,25 мл 1%-ного раствора метиленового синего внутрижелудочно вводили исследуемые вещества в дозе 200 мг/кг в виде 1%-ного спиртового раствора. Контрольной группе мышей за час до введения раствора метиленового синего вводили этиловый спирт. Регистрировали время выделения метиленового синего в очаге воспаления. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с применением программы EXCAL. Для оценки статистической достоверности различий сравниваемых средних величин использовали критерий Стъюдента.

Результаты изучения влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи мышей представлены в табл.4. Эталоном сравнения служили дигидрокверцетин (ДКВ) и бетулин, капилляроукрепляющие свойства которых известны.

Установлено, что капилляроукрепляющий эффект гексанового экстракта бересты в дозе 200 мг/кг выше, чем бетулина в этой же дозе, и выше в 1,7 раз, чем капилляроукрепляющий эффект дигидрокверцетина в дозе 100 мг/кг.

Пример 2. Исследования проводились аналогично примеру 1, только опытной группе мышей вводили 1%-ный спиртовый раствор ГЭБ в дозе 400 мг/кг, что соответствовало 0,4 мл раствора (табл.4). При введении дозы ГЭБ 400 мг/кг капилляроукрепляющий эффект составил 102.7% от контроля, т.е в этой дозе капилляроукрепляющий в 1,7 раз выше, чем капилляроукрепляющий эффект ГЭБ в дозе 200 мг/кг. Капилляроукрепляющий эффект ГЭБ в дозе 400 мг/кг выше, чем капилляроукрепляющий эффект дигидрокверцетина в дозе 300 мг/кг.

На основании проведенных исследований установлено, что гексановый экстракт бересты - вещество растительного происхождения, не являющееся токсичным для организма, который получается в одну стадию из измельченной бересты, обладает выраженным дозозависимым капилляроукрепляющим действием и может использоваться при лечении различных заболеваний. Отмечено, что качественное и количественное содержание активных компонентов, входящих в состав заявленного экстракта (по большей мере представленные бетулином 59,4% и лупеолом 31,7%), приводит к синергетическому потенцированию биологической активности ингредиентов по сравнению с использованием просто бетулина и влияет на заявленный технический результат.

Таблица 1
Элементный состав бересты и гексанового экстракта берестыОбразецСодержание элементов, % СНOSNБереста70,629,0419,570,080,07Гексановый экстракт бересты81,8711,556,800,000,07

Таблица 2
Относительное содержание основных компонентов гексанового экстракта бересты по данным ХМСКомпонентМ⁺% от суммыБетулин44259,4Лупеол42631,7β-ситостерол4120,6Изомер лупеола4261,4Альдегид лупеола4242,4Изомер лупеола4260,7Изомер лупеола4260,8Альдегид бетулина4402,5Фитостерин4260,7

Таблица 3
Основные показатели острой токсичности гексанового экстракта берестыВеществоПоказатели токсичности, мг/кгЛД₁₆ЛД₅₀Гексановый экстракт бересты5750>7000Бетулин6500>9000Дигидрокверцетин28103630

Таблица 4
Влияние ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи мышейВеществоДоза, мг/кгВремя выхода метиленовой сини, секКапилляроукрепляющий эффект, разница в % от контроляКонтроль-14,7±1,5*-ГЭБ20023,7±3,4*60,540029,8±4,2*102,7Бетулин20021,7±3,8*47,640036,3±4,0*146,9ДКВ10021,5±2,6*33,930025,4±2,8*77,7*р<0,05 по отношению к контролю

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к капилляроукрепляющему средству. Применение 1%-го спиртового раствора гексанового экстракта бересты с определенным содержанием в экстракте бетулина и лупеола в качестве капилляроукрепляющего средства. Вышеописанное средство обладает повышенным капилляроукрепляющим эффектом. 2 ил., 4 табл.

Применение 1%-го спиртового раствора гексанового экстракта бересты с содержанием в экстракте 59,4% бетулина и 31,7% лупеола в качестве капилляроукрепляющего средства.