АНТИМИКРОБНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2008 года по МПК A61K36/185 A61P31/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в качестве лекарственного средства из растительного сырья, обладающего антимикробным действием для лечения и профилактики заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, а также в качестве гигиенического и лечебно-косметического средства.

Известны синтетические антимикробные средства катапол, хлоргексидин и катамин, проявляющие высокую антиадгезивную активность, но оказывающие цитотоксический эффект [1].

Известно, что многие концентраты биологически активных веществ, получаемые путем экстракции различных частей растений, обладают антимикробной активностью, при этом не оказывают цитотоксического эффекта.

Известно антимикробное средство, обладающее антимикробной активностью, содержащее водный экстракт смеси корневищ и корней кровохлебки лекарственной, листьев шалфея лекарственного, листьев подорожника большого, листьев мать-и-мачехи, травы тысячелистника обыкновенного [2].

Известно антимикробное и антисептическое средство на основе экстракта из листьев эвкалипта и спирта этилового, содержание которого в средстве должно быть не меньше 65% [3].

Известно лечебно-профилактическое средство, обладающее ранозаживляющим и антимикробным действием, на основе спиртового экстракта из листьев ореха грецкого, полученного путем экстракции сырья 35-45% спиртом этиловым, с содержанием экстрактивных веществ не менее 3 мас.%, которое в соответствии с изобретением содержит жидкий, или густой, или сухой экстракт [4].

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, является расширение арсенала антимикробных препаратов растительного происхождения, обладающих высокой антиадгезивной активностью при использовании в минимальных количествах и не проявляющих токсического действия.

Поставленная задача решена тем, что установлена антимикробная активность концентрата водорастворимых веществ бересты. С этой целью определены минимальная токсическая доза концентрата водорастворимых веществ бересты, его минимальная ингибирующая концентрация, при которой происходит гибель микроорганизмов, а также антиадгезивная активность в небактерицидной концентрации в условиях, приближенных к условиям макроорганизма.

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в создании антимикробного средства, обладающего высокой антиадгезивной активностью при использовании в минимальных количествах и не оказывающего токсического действия.

Концентрат водорастворимых веществ бересты представляет собой жидкий экстракт с содержанием экстрактивных веществ менее 1,0 мас.%, полученный путем экстракции бересты полярным растворителем [5]. При удалении части или всего растворителя из жидкого экстракта получают концентрат водорастворимых веществ бересты в виде густого или сухого экстракта. Концентрат водорастворимых веществ бересты используют в качестве антимикробного средства непосредственно в виде экстракта, а также в составе лекарственных, лечебно-косметических и гигиенических средств в количестве от 0,001 до 0,01 мас.%, выполненных в форме таблеток, горошин, паст, элексиров, капель, капсул, гелей, аппликаций, мазей, кремов, суппозиторий, пластырей, повязок, салфеток.

Средства на основе березовых экстрактов широко применяются в традиционной и нетрадиционной медицине. Лекарственным сырьем, главным образом, являются березовые листья и почки, в то время как березовая кора и особенно береста содержат большое количество биологически активных веществ. В бересте березы бородавчатой выявлены: жирорастворимые экстрактивные вещества, представленные в основном тритерпеновыми спиртами, преимущественно бетулинолом и лупеолом, тритепеновыми кислотами и гликозидами, а также водорастворимые вещества, представленные преимущественно фенольными соединениями, в основном фенолкарбоновыми кислотами и флаваноидами, включая фенольные гликозиды - бетулозид (рододендрин) и гаултерин, флавонолы, катехины, лейкоантоцианы и дубильные вещества [6]. Основная часть экстрактивных веществ бересты представлена жирорастворимыми веществами - бетулинолом и лупеолом. Известны лекарственные средства на основе этих биологически актизных соединений [7], [8], [9], [10], [11].

Получение и использование концентратов водорастворимых веществ бересты до последнего времени считалось нецелесообразным, из-за низкого содержания водорастворимых веществ в бересте, которое составляет, примерно, 1%. В 2006 г. зарегистрирован патент на способ получения биологически активных веществ из бересты: концентрата водорастворимых веществ, концентрата бетулинола и концентрата тритерпеноидов - путем экстракции полярным растворителем [5].

Авторы изобретения на основании многочисленных исследований показали, что концентрат водорастворимых веществ бересты, несмотря на незначительное содержание в исходной бересте, имеет большое практическое значение, так как проявляет сильное антимикробное действие даже в концентрациях, измеряемых десятитысячными процента. Специфичность антимикробного действия обусловлена высокой антиадгезивной активностью концентрата водорастворимых веществ бересты, определяемой в небактериальной концентрации, получаемой при разведении концентрата менее 1:1000.

Изучение антимикробного действия концентрата водорастворимых веществ бересты, в дальнейшем обозначенного как концентрат, для применения его в качестве антимикробного средства, оказывающего минимальное токсическое действие, предусматривает следующие исследования:

1. определение минимальной токсической дозы (МТД);

2. определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК);

3. определение степени подавления адгезии в небактерицидной концентрации.

Методика проведения эксперимента

1. Определение минимальной токсической дозы.

Суспензию эпителиальных клеток фибробластов эмбриона человека кожно-мышечных (ФКМЭЧ) или легочных (ФЛЭЧ) в концентрации 100-200 тыс/мл вносят в пробирки с покровными стеклами (10×20 мм) в объеме 2 мл на стекло. Монослой эпителия формируется в течение 48 ч при 37°С, после чего культуральную среду сливают и стекла с монослоем инкубируют в среде, содержащей концентрат в разведении 1:10. Для контроля монослой инкубируют в среде без концентрата. Через 30 мин или 24 ч экспозиции среду сливают, монослой фиксируют этанолом и окрашивают азурэозином. Препараты исследуют под микроскопом, оценивая состояние клеток (целостность монослоя, отсутствие или наличие дегенеративных изменений в клетках), по сравнению с контролем.

2. Определение минимальной ингибирующей концентрации.

В питательную среду, содержащую концентрат в разведении 1:10, 1:100, 1:1000 вносят одинаковую посевную дозу стафилококка (1×10⁵ KOE). Через 24 ч инкубации при 37°С определяют наличие роста по наличию или отсутствию помутнения среды в каждой пробирке по сравнению с контрольной (среда без концентрата). Для определения жизнеспособных клеток из всех пробирок делают высевы на чашки с плотной питательной средой. По наличию колоний, формирующихся на чашках через 24 ч инкубации при 37°С, определяют минимальную ингибирующую концентрацию.

3. Определение степени подавления адгезии (% адгезии от контроля).

Из пробирок Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКМЭЧ или ФЛЭЧ сливают ростовую среду Игла и добавляют 1,8 мл концентрата и 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в дозе 10⁹ КОЕ/мл, получая конечную концентрацию тест-штамма 10⁹ КОЕ/мл. Пробирки инкубируют 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке проводят совместное инкубирование 1,8 мл поддерживающей среды Игла с 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в конечной дозе 10⁸ КОЕ/мл.

Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям:

1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке;

2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%),

3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.

Для изучения антимикробной активности концентрата водорастворимых веществ бересты использованы следующие препараты:

- тест-микроб - S.aureus 2628 или S.aureus 209;

- ростовая среда - 5%-ный гемогидролизат, или среда 199, или среда Игла;

- тест-культура фибробластов эмбриона человека кожно-мышечных (ФКМЭЧ) или легочных (ФЛЭЧ).

Исследование антимикробной активности концентрата проводилось на образцах, полученных экстракцией полярными растворителями, а именно: водой (КВВБ1), и водно-спиртовыми растворами с различной концентрацией спирта, при этом в качестве спирта использовали этанол (КВВБ2) и изопропанол (КВВБ3).

На основании результатов исследования выявлено следующее:

1. все исследуемые концентраты в разведении 1:10 не оказывают токсическое действие на культуру клеток;

2. все исследуемые концентраты обладали минимальной ингибирующей концентрацией в разведении 1:1000;

3. все исследуемые концентраты в разведении менее 1:1000, то есть в небактерицидной концентрации, на порядок снижали процент адгезии тест-штамма S.aureus.

В таблице приведены данные по адгезивной активности тест-штамма S.aureus в присутствии концентрата водорастворимых веществ бересты в небактерицидной концентрации при разведении менее 1:1000.

Таким образом, установлено, что концентрат с содержанием экстрактивных водорастворимых веществ менее 1,0 мас.% обладает бактерицидной активностью в разведении 1:1000, причем при разведении 1:10 не проявляет токсичности в отношении клеток макроорганизма и проявляет антиадгезивную активность в небактериальных концентрациях в разведении менее 1:1000 в условиях, приближенных к условиям макроорганизма. Исследование антимикробной активности концентрата создает неограниченные возможности его применения, так как он проявляет высокую антиадгезивную активность и не оказывает токсического действия. Концентрат получают в виде жидкого экстракта с содержанием экстрактивных веществ менее 1,0 мас.%, а также в виде густого или сухого экстракта.

Концентрат в качестве антимикробного средства используют непосредственно в виде экстрактов или вводят в состав лекарственных, лечебно-косметических и гигиенических средств в форме таблеток, горошин, паст, элексиров, капель, капсул, гелей, аппликаций, мазей, кремов, суппозиторий, пластырей, повязок, салфеток. Содержание антимикробного средства в составе лекарственных, лечебно-косметических и гигиенических средств примерно 0,01-0,001 мас.%, несмотря на то, что в опытах in vitro антимикробная активность концентратов проявлялась в меньших количествах. Это связано с тем, что в условиях применения антимикробного средства у человека или животного на поверхности кожи, полости рта, носа, уха, влагалища средство будет частично терять свою активность за счет связывания с биологическими субстратами этих полостей.

Для приготовления таблеток, горошек или желатиновых капсул с твердым покрытием биоконцентрат смешивают с фармацевтически инертным неорганическим или органическим структурообразователем, например, лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, или стеариновую кислоту, или ее соли. Для приготовления желатиновых капсул с мягким покрытием, гелей и аппликаций используют растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Для приготовления эликсиров, капель используют воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. В суппозиториях, кремах и мазях используют природные или гидрогенизированные масла, воски, жиры и полутвердые или жидкие полиолы. Для изготовления санитарно-гигиенических салфеток, повязок или подушечек используют преимущественно хлопчато-бумажный тканный или трикотажный материал, пропитанный антимикробным средством в количестве 10-70% от массы гигиенического средства. В состав лекарственного, косметического или гигиенического средства могут входить стабилизаторы, солюбилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, красители, подслащивающие вещества, соли, буферы, отдушки, консерванты, антиоксиданты.

Лекарственное, лечебно-косметическое и гигиеническое средство готовят по технологии, которая хорошо известна в фармации и косметике.

В примерах приведены условия получения концентрата.

Пример 1. 50 г измельченной бересты загружают в круглодонную колбу, заливают 600 мл воды и экстрагируют, с обратным холодильником, в течение 1 час при температуре 100°С. Затем экстракт отделяют от бересты любым известным способом и получают концентрат водорастворимых веществ в растворе с содержанием экстрактивных веществ в растворе 0,1 мас.%.

Пример 2. 50 г измельченной бересты заливают 150 мл 96 % этанола и экстрагируют в течение 20 час при температуре 20°С. Затем экстракт отделяют от бересты любым известным способом и получают концентрат водорастворимых веществ в растворе с содержанием экстрактивных веществ в растворе 0,3 мас.%.

Пример 3. 50 г измельченной бересты заливают 1000 мл 1,5% изопропанола и экстрагируют в течение 0,5 час при температуре 80°С. Затем экстракт отделяют от бересты любым известным способом и получают концентрат водорастворимых веществ в растворе с содержанием экстрактивных веществ в растворе 0,5 мас.%.

Использование антимикробного средства в составе лекарственного, косметического, или гигиенического средства иллюстрируется следующими примерами.

Пример 4. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты в растворе этилового спирта, полученного, как в примере 2, вводят в концентрации 0,01% в лечебно-профилактическое средство для гигиены полости рта зубной эликсир. Зубной эликсир содержит, мас.%: водорастворимая форма прополиса, взятого в количестве 2,0; ментол 0,02; спиртовой экстракт бересты 0,01; спирт этиловый 31,0, вода остальное.

Пример 5. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты, полученного, как в примере 3, вводят в концентрации 0,005% в состав мази для лечения псориаза. Мазь содержит при следующем соотношении компонентов, мас.%: водные экстракты череды 0,1; листьев березы белой 0,1; чистотела большого 0,1; календулы лекарственной 0,1;сушеницы болотной 0,1 и масляные экстракты тех же растений; изопропанольный экстракт бересты 0,001; вазелин медицинский 1,0; ланолин 2,5; камфару 0,1; льняное масло 1,0; изопропанольный экстракт бересты 0,005 и солидол медицинский остальное. Соотношение водного и масляного экстрактов растений 5:1.

Пример 6. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты, полученного, как в примере 1, вводят в концентрации 0,001% в состав противоязвенного средства. Состав противоязвенного средства включает на 1 таблетку весом 1,0 г, г: висмута нитрат основной 0,350; магния карбонат основной 0,400; натрия гидрокарбонат 0,200; водорастворимые экстракты коры крушины 0,011; корневище аира 0,025; корня солодки 0,003; листьев березы 0,010; бересты 0,00001.

Пример 7. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты, полученного, как в примере 2, вводят в концентрации 0,002% в состав свечей для лечения гнойно-воспалительных гинекологических заболеваний. Состав препарата, мас.%: твердый жир 98,000; растительные стерины 1,848; синтомицин 0,150, спиртовой экстракт бересты 0,002.

Пример 8. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты, полученного, как в примере 1, вводят в концентрации 0,01% в состав бактерицидного пластыря. Пластырь состоит из составляющих: подложки из натурального волокна, на которую нанесен слой адгезива, который содержит каучук натуральный 12,85% и/или каучук синтетический 12,85%, окись цинка 32,0%, ланолин безводный 9,9%, масло вазелиновое медицинское 11,3%, канифоль сосновая 20,35%, антиокислительная присадка Агидол-1 0,70%; на ней закрепляют гигроскопичную и атравматичную прокладку, выполненную из нетканого натурального и/или синтетического материала, на который нанесен следующий антисептический состав: фурацилин 0,03 %, водный экстракт бересты 0,01 %, бриллиантовый зеленый 0,01%.

Пример 9. Антимикробное средство в виде концентрата водорастворимых веществ бересты, полученного, как в примере 3, вводят в концентрации 0,01% в состав косметического средства для ухода за проблемной кожей, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде геля и содержит при следующем соотношении компонентов, мас.%: водные экстракты фукуса пузырчатого 10,00; чая зеленого 10,00; водно-спиртовые экстракты листьев березы 1,49; можжевельника 0,50; хвоща полевого 3,50; перца кайенского 1,00, а также глицерин 3,00; карбопол 0,80; триэтаноламин 0,50; горчицу сарептскую 0,50; нипагин 0,1, нипазол 0,1; эфирное масло мандарина 0,05; изопропанольный экстракт бересты 0,01, остальное вода.

Пример 10. Антимикробное средство - концентрат водорастворимых веществ бересты, полученный, как в примере 2, разбавляют дистиллированной водой 1:1000. Разбавленным раствором пропитывают салфетку, выполненную из хлопчатобумажной ткани, затем салфетку герметично упаковывают.

Таблица
Адгезивная активность тест-штамма S.aureus в присутствии концентрата водорастворимых веществ бересты в небактерицидной концентрации при разведении менее 1:1000.Тест-объектПоказатели интенсивности процесса адгезии тест-штамма S.aureusИА% ПКМН% адгезии от контроляКонтроль:825200100КВВБ11552,5КВВБ22484,0КВВБЗ1994,5

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. SU 1359300 A1.

2. RU 1762931 A1.

3. SU 799762 A1.

4. RU 2153349 A1.

5. RU 2283655 A1.

6. Р.В.Куцик, Б.М.Зузук. Береза бородавчатая (Береза повислая). Ж. Провизор, №10, 2001 г.

7. RU 2240799 A1.

8. RU 2252773 A1.

9. RU 2252774 A1.

10. RU 2252775 A1.

11. RU 2244554 A1.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в качестве лекарственного средства. Антимикробное средство представляет собой концентрат водорастворимых веществ бересты, полученный путем экстракции бересты полярным растворителем, с содержанием экстрактивных веществ менее 1,0 мас.% при разведении менее 1:1000, при этом оно выполнено в виде густого или сухого экстракта и может быть в форме таблеток, горошин, капсул, мазей, суппозиторий, капель, кремов, гелей, повязок, аппликаций, пластырей, салфеток, эликсиров. Антимикробное средство может быть введено в лекарственное средство, лечебно-косметическое и гигиеническое средство в количестве от 0,001 до 0,01 мас.%. средство расширяет арсенал антимикробных средств, обладающих высокой антиадгезивной активностью и не оказывающих токсического действия. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Антимикробное средство, обладающее антиадгезивной активностью, характеризующееся тем, что оно представляет собой концентрат водорастворимых веществ бересты, полученный путем экстракции бересты полярным растворителем, с содержанием экстрактивных веществ менее 1,0 мас.% при разведении менее 1:1000.2. Антимикробное средство по п.1 выполнено в виде густого или сухого экстракта.3. Антимикробное средство по п.1 выполнено в форме таблеток, горошин, капсул, мазей, суппозиторий, капель, кремов, гелей, повязок, аппликаций, пластырей, салфеток, эликсиров.4. Антимикробное средство по п.1, которое может быть введено в лекарственное средство, лечебно-косметическое и гигиеническое средство в количестве от 0,001 до 0,01 мас.%.