КАМЕРА ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ПРОВЕДЕНИЯ СЕРИИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ МЕТОДОМ МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗА Российский патент 2008 года по МПК G01N27/447 

Изобретение относится к области медицины, а также к ветеринарии и микробиологии и предназначено для биологических исследований суспензий клеток и образцов биоптатов.

Известная камера для микроэлектрофореза конструкции Н.Abramson 1929 г. (см. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. «Микроэлектрофорез клеток крови в норме и патологии». Минск. «Беларусь», 1974 г.). Известное устройство содержит капилляр прямоугольного сечения, связанный с двумя отсеками, в которых находятся электроды. Суспензию клеток помещают в капилляр и воздействуют на нее постоянным электрическим полем, вызывающим однонаправленное движение клеток, имеющих электрический заряд.

Недостатком этой камеры является ее большой объем. Кроме того, конструкция камеры приводит к образованию выраженных конвекционных потоков жидкости, вызывающих перемещение клеток. Отсутствует термостабилизация. Возможности камеры ограничены из-за особенностей ее заполнения, позволяющих работать только с суспензиями некоторых типов клеток. Конструкция камеры не позволяет проводить одновременно несколько исследований на одной установке.

Известна камера для микроэлектрофореза (Патент RU 2271734 С2), взятая за прототип. Камера имеет корпус, в который вставляется выдвижная платформа с несколькими парами электродов. Камера имеет термодатчик и нагревательное устройство. Платформа снабжена бортиком, препятствующим растеканию жидкости. Имеются упоры, фиксирующие расстояние между предметным и покровным стеклом.

Недостатком известной камеры является то, что ее конструкция не устраняет испарение жидкости, что приводит к изменению параметров тока (напряжение, сила тока, сопротивление) и изменению концентрации веществ в инкубационной жидкости. Неравномерное испарение жидкости из камеры приводит к возникновению однонаправленного движения клеток, не связанного с воздействием электрического поля и мешающего проведению эксперимента. Быстрое испарение жидкости из камеры, особенно при работе в режиме термостабилизации, делает невозможными эксперименты длительностью более 5-7 минут без добавления новых порций жидкости. Накопление пузырей газообразных продуктов электролиза между предметным и покровным стеклом приводит к изменению направления силовых линий электрического поля и изменению направления движения клеток. Кроме того, пузыри могут приводить к исчезновению контакта между электродом и инкубационной жидкостью, находящейся между покровным и предметным стеклом (т.е. к разрыву электрической цепи) и прекращению работы камеры.

Невозможна перенастройка расстояния между покровным и предметным стеклами в процессе работы, в зависимости от потребностей и условий исследования. Отсутствует возможность параллельного проведения нескольких экспериментов, что делает камеру малопригодной для целей скрининговых исследований.

Камера не позволяет работать с клетками, обладающими высокими адгезивными свойствами (например, с клетками некоторых лимфосарком и лейкозов, фибробластами, клетками некоторых эпителиев).

Не предусмотрена возможность замены электродов.

Задачей заявленного изобретения является создание надежного устройства, повышающего точность исследований, проводимых с его помощью и обладающего расширенными функциональными возможностями.

Поставленная задача решается за счет того, что в камере для одновременного проведения серии экспериментов методом электрофореза, имеется несколько объединенных в одном блоке электрофоретических ячеек, каждая из которых имеет платформу, электродные отсеки, электроды, покровные и предметные стекла, термодатчик и нагревательное устройство; в платформах выполнены ступенчатые отверстия, в которых установлены предметные стекла, а на них установлены рамы с покровными стеклами; в платформе выполнены углубления, являющиеся электродными отсеками, в которых размещены электроды; электродные отсеки снабжены конденсирующими крышками; в прорезях ступенчатых отверстий закреплены рамы с зафиксированными полупроницаемыми мембранами, кроме того, камера снабжена приспособлением, обеспечивающим ее крепление на предметном столике микроскопа и позволяющим перемещать электрофоретические ячейки относительно объектива микроскопа.

Возможны, по меньшей мере, 2 варианта устройства камеры: 1) электрофоретические ячейки могут быть расположены параллельно в ряд. 2) электрофоретические ячейки могут быть расположены радиально вокруг общей оси вращения.

Камера имеет 2 системы подачи тока в электрофоретические ячейки, что позволяет подавать его либо во все электрофоретические ячейки камеры, либо в часть из них, либо только в ту электрофоретическую ячейку, которая в данный момент располагается под объективом микроскопа.

Использование заявленного изобретения позволяет повысить точность проводимых исследований, а также в несколько раз увеличить производительность.

Объединение в одном блоке нескольких электрофоретических ячеек, поочередно через определенные промежутки времени подаваемых под объектив микроскопа, позволяет проводить одновременно серию экспериментов. Благодаря наличию электродных отсеков, заполненных жидкостью, и наличию конденсирующих крышек снижается влияние испарения. Уровень жидкости в электродных отсеках находится выше уровня жидкости, находящейся между предметным и покровным стеклом. Даже если некоторая часть жидкости из электродных отсеков испарится, это никак не скажется на объеме жидкости, находящейся между предметным и покровным стеклом, на контакте жидкости с электродами, а также на постоянстве параметров тока в камере. В связи с тем, что в электродных отсеках находится достаточно большой объем жидкости, испарение некоторого ее количества не приведет к существенному изменению концентраций веществ, входящих в состав инкубационной среды. Электродные отсеки имеют одинаковую форму и размеры, одинаковые мощности находящихся в них нагревательных элементов, площади, с которых испаряется жидкость, равны, поэтому испарение жидкости из них происходит одинаково и не приводит к возникновению потоков и появлению движения клеток, не связанного с воздействием электрического поля. Одновременное заполнение электродных отсеков одинаковыми объемами жидкости не приводит к возникновению в этот момент потоков жидкости. Особенности расположения электродов не позволяют пузырям газообразных продуктов электролиза скапливаться между предметным и покровным стеклом и прерывать электрическую цепь. Использование микровинтов позволяет точно регулировать зазор между предметным и покровным стеклами и при необходимости изменять его во время опыта. Расположение части нагревательных элементов непосредственно в жидкости (в резервуарах) способствует более эффективной термостабилизации. Благодаря наличию в предметном стекле отверстий, в которых закреплены трубки, достигается возможность дополнительного введения в камеру различных растворов и суспензий клеток.

При использовании предметных и покровных стекол из материалов, способных пропускать свет нужной части спектра, становится возможным проведение исследований с использованием флюоресцентной микроскопии при использовании различных меток с разными спектрами эмиссии.

Изготовление предметных и покровных стекол из материалов с низкой сорбционной способностью позволит избежать потерь (за счет адсорбции) веществ, используемых в условиях опыта в малых концентрациях.

Использование предметных и покровных стекол из материалов с низкими адгезивными свойствами делает возможной работу с клетками, обладающими высокой адгезией к стеклу и другим материалам.

Выполнение предметных и покровных стекол съемными делает их легко заменяемыми и резко расширяет возможности использования камеры, а при необходимости значительно упрощает ее ремонт.

Использование сменных комплектов электродов различной формы и размеров, выполненных из материалов, обладающих необходимыми свойствами, позволяет расширить возможности использования камеры и упрощает ее ремонт.

Использование регуляторов электрического сопротивления позволяет создавать в электрофоретических ячейках одинаковую (либо задаваемую условиями эксперимента) силу тока, что важно в некоторых случаях. Кроме того, при параллельном соединении нескольких электрофоретических ячеек общее электрическое сопротивление системы оказывается в несколько раз меньше, чем у одной электрофоретической ячейки, возрастание при этом силы тока приведет к выходу из строя источника тока, рассчитанного на работу с одной ячейкой. Поэтому регуляция электрического сопротивления является необходимой.

Возможны варианты, когда каждая электрофоретическая ячейка камеры может иметь не одну, а две или большее количество пар электродов. В этом случае ток подается поочередно между каждой парой электродов. Такое решение позволяет проводить исследования по влиянию структур цитоскелета на амплитуду колебаний ядер и участков цитолеммы клеток, иммобилизованных между предметным и покровным стеклами электрофоретической ячейки.

Все вышеперечисленное способствует повышению надежности работы устройства, расширению возможностей его применения в указанных выше областях, повышению воспроизводимости и сопоставимости результатов исследований.

Заявленное устройство поясняется чертежами, где:

на фиг.1 представлен продольный разрез камеры с линейным расположением электрофоретических ячеек, закрепленной в салазочном устройстве;

на фиг.2 представлен вид сверху камеры с линейным расположением электрофоретических ячеек, закрепленной в салазочном устройстве;

на фиг.3 представлен продольный разрез салазочного устройства;

на фиг.4 представлен вид сверху салазочного устройства;

на фиг.5 представлен вид сбоку в разрезе камеры с радиальным расположением электрофоретических ячеек;

на фиг.6 представлен вид сверху камеры с радиальным расположением электрофоретических ячеек, закрепленной на предметном столике микроскопа;

на фиг.7 представлен вид сбоку в разрезе камеры с радиальным расположением электрофоретических ячеек, закрепленной на предметном столике микроскопа.

Заявленное устройство содержит объединенные в единый блок платформы 1 (фиг.1, 5), в каждой из которых имеются электродные отсеки 2, в которых располагаются электроды 3. Платформа имеет ступенчатое отверстие 4, на ступеньке 5 которого крепится предметное стекло 6. на котором закреплен термодатчик 7 (фиг.2, 6). Сверху в отверстие 4 (фиг.1, 5) вставляется рама 8 с закрепленным на ней покровным стеклом 9.

Боковые стенки рамы 8 плотно прилегает к поверхности отверстия 4 платформы 1, чем достигается невозможность попадания жидкости между стенками рамы и выступами корпуса, а также предотвращается всплывание рамы 8 с покровным стеклом 9 при заполнении камеры жидкостью. При необходимости рама 8 с покровным стеклом 9 может быть жестко закреплена с помощью фиксирующих винтов 10 (фиг.2, 6). В раме 8 (фиг.2, 6) смонтированы микровинты 11, регулирующие расстояние между покровным стеклом 9 (фиг.1, 5) и предметным стеклом 6. Сверху электродные отсеки 2 закрываются конденсирующими крышками 12, имеющими одно или несколько отверстий 13, предназначенных для выхода газообразных продуктов электролиза. На фиг.2, 6 конденсирующие крышки условно не показаны. Нагревательные элементы 14 (фиг.1, 2, 5) располагаются в резервуарах 2 и под предметным стеклом 6. Через отверстия в платформе 1 к электродам 3 подходят контактные винты 15 (фиг.2, 6), обеспечивающие также крепление электродов. Электроснабжение нагревательных элементов 14 (фиг.1, 2, 5) и провода, идущие от термодатчика 7 (фиг.2, 6), а также провода, идущие к контактным винтам 15, на чертежах условно не показаны. В предметном стекле 6 (фиг.1, 5) имеются отверстия 16, в которых закреплены трубки 17, по которым в камеру в процессе работы при необходимости могут быть введены дополнительные растворы и суспензии клеток. Электродные отсеки 2 отделены от пространства между предметным и покровным стеклом полупроницаемыми мембранами 18, закрепленными в съемных рамках 19. Наличие полупроницаемых мембран позволяет предотвратить попадание клеток из рабочей зоны в электродные отсеки и пропускать лишь молекулы (или ионы), размер которых не превышает диаметр пор мембраны.

Возможен вариант устройства, когда каждая электрофоретическая ячейка может иметь не одну, а несколько пар электродов, каждый из которых располагается в своем электродном отсеке.

Для подачи тока только в электрофоретическую ячейку, находящуюся в данный момент под объективом микроскопа, снизу на платформе 1 смонтированы дополнительные контакты 20, соединенные с электродами 3 (фиг.1, 5). В варианте с радиальным расположением электрофоретических ячеек дополнительные контакты 20 при приеме камерой соответствующих положений приходят в соприкосновение с контактными площадками 21 (фиг.7), закрепленными на предметном столике микроскопа и соединенными проводами 22 с источником тока. В варианте с линейным расположением электрофоретических ячеек (фиг.1) дополнительные контакты 20 при приеме камерой соответствующих положений приходят в соприкосновение с контактными площадками 23 (фиг.1, 3, 4), расположенными на салазочном устройстве 24 и соединенными с источником тока проводами 25. Салазочное устройство 24, закрепленное на предметном столике микроскопа, имеет отверстие 26 (фиг.3, 4), через которое проходит свет от осветителя микроскопа.

Подача тока одновременно во все электрофоретические ячейки камеры осуществляется в варианте с их радиальным расположением через коммутирующее устройство 27 (фиг.7), смонтированное на оси 28, вокруг которой вращается вся камера (фиг.5, 7). Сама ось 28 крепится в отверстии 29 (фиг.7), выполненном на предметном столике микроскопа. Вращение камеры вокруг оси 28 (фиг.5) обеспечивается подшипниками 30. Коммутирующее устройство 27 (фиг.7) состоит из контактных подшипников 31 (фиг.5), изолирующих прокладок 32, изолирующей шайбы 33 и контактных втулок 34, с которыми соединяются провода 35, идущие от источника тока. На оси 28 коммутирующее устройство 27 фиксируется с помощью гайки 36. Коммутирующее устройство снаружи прикрыто защитным кожухом 37, имеющим отверстия 38, через которые проходят контактные винты 39. На платформах 1 камеры монтируются резисторы 40 (фиг.5, 6). Провода, идущие от контактных винтов 39 к резисторам 40 и от них к электродам 3, на чертеже условно не показаны.

В варианте с линейным расположением электрофоретических ячеек подача тока от источника во все электрофоретические ячейки камеры обеспечивается соединением их параллельно с помощью проводов, которые должны крепиться к контактным винтам 15 и на фиг.2 условно не обозначены. Регулировка электрического сопротивления в каждой из электрофоретических ячеек также может осуществляться с помощью резисторов или реостатов, дополнительно введенных в электрическую цепь камеры. На фиг.1, 2 для упрощения чертежа они не показаны.

Камера для электрофореза клеток работает следующим образом.

В электрофоретические ячейки со снятыми конденсирующими крышками 12 (фиг.1, 5) и рамами 8 с покровными стеклами 9 на предметные стекла 6 пипеткой или шприцем вносятся необходимые объемы суспензии клеток либо необходимые объемы жидкости, в которые помещаются образцы биопсийного материала. Эту жидкость или суспензию целесообразно предварительно прогреть до той температуры, при которой будет проводиться исследование. Затем сверху в прорези ступенчатых отверстий вставляются рамы 8 с покровными стеклами 9. при этом жидкость должна полностью заполнить пространство между предметными стеклами 6 и покровными стеклами 9, признаком чего служит попадание минимальных количеств жидкости в резервуары 2 (при необходимости этот небольшой избыток может быть легко удален). Расстояние, на которое покровное стекло 9 может быть приближено к предметному стеклу 6, устанавливается микровинтами 11 (фиг.2, 6) до начала работы, но при необходимости может быть изменено после заполнения камеры жидкостью в процессе работы. Рамы 8 (фиг.1, 5) с покровными стеклами 9 могут быть жестко зафиксированы относительно платформы с помощью фиксирующих винтов 10 (фиг.2, 6). В электродные отсеки 2 устанавливаются рамы 19 (фиг.1, 5) с мембранами 18.

Затем одновременно во все электродные отсеки 2 электрофоретической ячейки вносятся строго одинаковые объемы жидкости. Сверху резервуары 2 закрывают конденсирующими крышками 12. Желательно, чтобы вносимая в электродные отсеки жидкость была предварительно доведена до необходимой температуры.

Камера с изучаемыми объектами помещается на предметный столик микроскопа и подключается к источнику тока, например прибору «Биотест» из комплекса устройств для проведения микроэлектрофореза «Цито-эксперт», входящего в реестр медицинских приборов (удостоверение РФ от 14.06.05 № ФС 022а 2005, 174405), или к иному подобному прибору.

В зависимости от задач эксперимента выбирают режим подачи тока, который может подаваться либо во все электрофоретические ячейки камеры, либо в часть из них, либо только в ту электрофоретическую ячейку, которая в данный момент времени находится под объективом микроскопа. Для подачи тока во все электрофоретические ячейки камеры с их радиальным расположением с помощью проводов контактные винты 15 (фиг.6) (примыкающие к электродам 3) соединяют проводами с контактными винтами 39 (фиг.5) коммутирующего устройства 27 (фиг.7), которое в свою очередь проводами 35 (фиг.5) соединяется с источником тока. Для подачи тока в камеру с линейным расположением электрофоретических ячеек последние с помощью проводов соединяются друг с другом параллельно через контактные винты 15 (фиг.2), после чего производится подключение к источнику тока. Если в одну или несколько ячеек в условиях данного эксперимента подача тока не нужна, провода, идущие к соответствующим электродам, отсоединяют (в обоих рассматриваемых вариантах устройства). Как уже было сказано выше, в электрическую схему могут быть введены резисторы (реостаты).

При подаче тока только в ту электрофоретическую ячейку, которая в данный момент находится под объективом микроскопа, в варианте камеры с линейным расположением электрофоретических ячеек, ток от источника подается по проводам 25 (фиг.4) на контактные площадки 23 салазочного устройства 24, либо, в варианте с радиальным расположением электрофоретических ячеек, ток подается по проводам 22 (фиг.7) на контактные площадки 21, находящиеся на предметном столике микроскопа.

При использовании варианта камеры, электрофоретические ячейки которой имеют более одной пары электродов, подача тока между парами электродов осуществляется поочередно в порядке, задаваемом настройками прибора «Биотест» из комплекса устройств для проведения микроэлектрофореза «Цитоэксперт» (удостоверение РФ от 14.06.05 № ФС 022а 2005, 174405) или иного подобного прибора.

После подключения камеры к источнику тока измеряют электрическое напряжение между электродами (для этого необходимо снять конденсирующие крышки). Производится регулировка величины подаваемого напряжения.

При необходимости с помощью резисторов 40 (фиг.6) добиваются одинакового (или необходимого для целей эксперимента) электрического сопротивления во всех электрофоретических ячейках камеры. Желательно настройку провести в предварительном эксперименте с заполнением ячеек соответствующими растворами перед началом основного эксперимента.

Затем включается режим термостабилизации и температура жидкости в камере доводится до необходимой.

Наблюдение за движением объектов в камере может осуществляться через микроскоп визуально, либо может проводиться видеосъемка или иная регистрация данных. После завершения наблюдения (видеосъемки) в одной электрофоретической ячейке под объектив подается следующая электрофоретическая ячейка и процесс повторяется. Перемещение достигается поворотом устройства на необходимый угол, если используется радиальный вариант камеры, либо путем смещения устройства по салазочному механизму, если используется линейный вариант устройства. Таким образом, за время эксперимента одна и та же камера побывает под объективом микроскопа несколько раз. Это удобно, поскольку позволит провести серию наблюдений (видеозаписей) через необходимые промежутки времени и отследить процесс в динамике. Без ухудшения качества результатов становится возможным провести одновременно целую серию экспериментов, проводя наблюдение (визуальное или видеосъемку) за клетками, находящимися в различных ячейках.

При необходимости в ту или иную электрофоретическую ячейку через трубки 17 (фиг.1, 5) могут быть дополнительно введены различные растворы или клеточные суспензии. При проведении некоторых исследований может возникнуть необходимость изменения расстояния между предметным стеклом 6 и покровным стеклом 9. Для этого прекращают подачу тока на электроды камеры, затем, поворачивая винты 10 (фиг.2, 6), освобождают раму 8 с покровным стеклом 9 (фиг.1, 5) от жесткой фиксации и с помощью микровинтов 11 (фиг.2, 6) устанавливают нужное расстояние между предметным стеклом 6 (фиг.1, 5) и покровным стеклом 9. После чего рама 8 с покровным стеклом 9 вновь фиксируется с помощью винтов 10 (фиг.2, 6). Затем, с целью стандартизации результатов, изменившиеся сопротивления доводятся резисторами 40 (фиг.6) до требуемого значения, после чего эксперимент может быть продолжен. После окончания исследования камера отключается от источника тока, убирается с предметного столика микроскопа, снимаются конденсирующие крышки 12 (фиг.1, 5), рамы 8 с покровными стеклами 9 освобождается от фиксации винтами 10 (фиг.2) и вынимается из платформы 1 (фиг.1, 5), вынимаются из электродных отсеков 2 рамы 19 с полупроницаемыми мембранами 18. Затем проводится промывание камеры и всех ее съемных частей с помощью воды и моющих средств. После чего осуществляется их дезинфекция путем помещения в раствор хлоргексидина или иного дезинфицирующего средства, не повреждающего материал камеры, на время, указанное в инструкции по его использованию. После дезинфекции камера несколько раз промывается дистиллированной водой и высушивается. При этом допускается сушка в струе теплого воздуха.

Изобретение предназначено для биологических исследований суспензий клеток и образцов биоптатов и позволяет одновременно осуществлять несколько экспериментов. Сущность изобретения: в камере для одновременного проведения серии экспериментов методом электрофореза, содержащей несколько объединенных в одном блоке электрофоретических ячеек, каждая из которых имеет платформу, электроды, покровные и предметные стекла, термодатчик и нагревательные устройства, в платформах выполнены ступенчатые отверстия, в которых установлены предметные стекла, а на них установлены рамы с покровными стеклами, причем в платформе выполнены углубления, являющиеся электродными отсеками, в которых размещены электроды, электродные отсеки снабжены конденсирующими крышками, в прорезях ступенчатых отверстий закреплены рамы с зафиксированными полупроницаемыми мембранами. Кроме того, камера снабжена приспособлением, обеспечивающим ее крепление на предметном столике микроскопа и позволяющим перемещать электрофоретические ячейки относительно объектива микроскопа. Изобретение позволяет создать надежное устройство, повышающее точность исследований и обладающее расширенными функциональными возможностями. 11 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Камера для одновременного проведения серии экспериментов методом электрофореза, содержащая несколько объединенных в одном блоке электрофоретических ячеек, каждая из которых имеет платформу, электроды, покровные и предметные стекла, термодатчик и нагревательные устройства, отличающаяся тем, что в платформах выполнены ступенчатые отверстия, в которых установлены предметные стекла, а на них установлены рамы с покровными стеклами, причем, в платформе выполнены углубления, являющиеся электродными отсеками, в которых размещены электроды, электродные отсеки снабжены конденсирующими крышками, в прорезях ступенчатых отверстий закреплены рамы с зафиксированными полупроницаемыми мембранами, кроме того, камера снабжена приспособлением, обеспечивающим ее крепление на предметном столике микроскопа и позволяющим перемещать электрофоретические ячейки относительно объектива микроскопа.2. Камера по п.1, отличающаяся тем, что платформы расположены параллельно в ряд.3. Камера по п.1, отличающаяся тем, что платформы расположены радиально вокруг общей оси вращения.4. Камера по п.1, отличающаяся тем, что в рамах покровных стекол установлены микровинты для регуляции расстояния между предметным и покровным стеклами.5. Камера по п.1, отличающаяся тем, что предметные и покровные стекла выполнены из материалов, пропускающих свет нужной части спектра, например, ультрафиолетовое излучение.6. Камера по п.1, отличающаяся тем, что в предметном стекле выполнены отверстия с закрепленными в них трубками для дополнительного введения растворов и суспензий клеток.7. Камера по п.1, отличающаяся тем, что предметные и покровные стекла могут быть изготовлены из материала, имеющего низкие адсорбционные свойства, например из полипропилена.8. Камера по п.1, отличающаяся тем, что предметные и покровные стекла могут быть изготовлены из материала, имеющего низкие адгезионные свойства.9. Камера по п.1, отличающаяся тем, что предметные и покровные стекла выполнены съемными.10. Камера по п.1, отличающаяся тем, что электроды выполнены сменными и могут быть выполнены из материалов с различными свойствами и иметь различные форму и размеры.11. Камера по п.1, отличающаяся тем, что снабжена системой регулировки электрического сопротивления каждой электрофоретической ячейки.12. Камера по п.1, отличающаяся тем, что имеет 2 системы подачи тока, позволяющие подавать его либо во все электрофоретические ячейки камеры, либо в часть из них, либо только в ту электрофоретическую ячейку, которая в данный момент располагается под объективом микроскопа.