СПОСОБ МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗА КЛЕТОК КРОВИ И ЭПИТЕЛИОЦИТОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики заболеваний и определения эффективности лечения в гематологии, онкологии, дерматовенерологии, гинекологии, гастроэнтерологии, проктологии, отоларингологии, других отраслях медицины, а также в ветеринарии, биологии.

Известен способ микроэлектрофореза эритроцитов - Н. Abramson. 1942 - (см. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. "Электрофорез клеток крови в норме и патологии", Минск, 1974, с. 33-35), заключающийся в помещении в постоянное электрическое поле определенного объема крови.

Недостатком известного способа является его невысокая точность, обусловленная трудностями микроскопии, поскольку происходит наложение изображений нескольких эритроцитов в поле зрения; наличие сопротивления для перемещения клеток крови внутри стеклянного капилляра и сложностями термостатирования.

Известен способ микроэлектрофореза эритроцитов, взятый в качестве прототипа (см. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. "Электрофорез клеток крови в норме и патологии", Минск, 1974, с. 33-35), заключающийся в микроскопическом исследовании в постоянном электрическом поле определенного объема крови. При этом способе клетки помещают в жидкую забуференную инкубационную среду с концентрацией клеточной взвеси в переделах 0,05%. Среду с клетками помещают в исследовательскую камеру, которая содержит анод и катод и создает постоянное электрическое поле. Под воздействием электрического поля клетки перемещаются к аноду. Скорость перемещения зависит от мембранного потенциала клеток, от их функционального состояния. Изменения в скорости перемещения клеток регистрировали с использованием биологического микроскопа.

Недостатками известного метода являются: возможность ошибок из-за торможения подвижных клеток при контакте с неподвижными клетками, невозможность или затруднения в использовании метода для исследования эпителиоцитов. Ряд недостатков прототипа связан с технологией исследования: необходимостью разведения клеточного субстрата в 1000-2000 раз. Это увеличивает время получения информации. Направленная миграция клеток от одного полюса к другому затрудняет микроскопическое исследование таких цитологических параметров, как проницаемость клеток для прижизненных красителей, усложняет микрометрию.

Сущность заявленного изобретения заключается в том, что согласно способу микроэлектрофореза клеток крови и эпителиоцитов, включающего помещение исследуемых объектов в инкубационную среду и электрическое поле, оценку биоэлектрических показателей по изменению положений клеток, а также их оболочек, ядер, исследуемые объекты помещают в знакопеременное, многовекторное и симметрическое электрическое поле. Кроме того, используют 8-векторное электрическое поле.

Преимущество заявленного способа заключается в том, что оно позволяет исследовать разные типы клеток. Это расширяет возможности при использовании методики для диагностики заболеваний, определении эффективности лечения. Многовекторность и знакопеременность электрических полей, воздействующих на клетки, позволяют исключить ошибки, связанные с торможением клеток при их перемещении к одному из полюсов. Основной причиной торможения при перемещении клеток в ответ на воздействие электрического поля является контакт подвижной клетки с неподвижной. Заявленный способ позволяет использовать относительно небольшие разведения исследуемых фракций клеток. В предложенном нами способе используют разведение в 20-100 раз. Более высокая концентрация клеток, не уменьшая точность исследования, позволяет быстрее и в более полном объеме получить необходимую информацию. Способ позволяет исключить микротечи жидкости с клетками, что повышает его точность.

Заявленный способ поясняется чертежами: на фиг. 1 - процентное соотношение числа активированных электрическими полями эритроцитов человека у практически здоровых лиц и больных железодефицитной анемией (ЖДА); на фиг. 2 - амплитудные характеристики у практически здоровых лиц и у больных ЖДА; на фиг. 3 - векторные характеристики прижизненных реакций ядер и оболочки эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта человека.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. В исследовательскую камеру, предварительно нагретую до 37^oC, вносят 0.5 - 0.6 мл инкубационной среды с прижизненно взятыми клетками. На жидкость помещают покровное стекло. Между электродами и покровным стеклом помещают бумажные фильтры, предварительно смоченные в инкубационном растворе. С помощью прибора между симметрично расположенными парами электродов создают знакопеременные, многовекторные электрические поля. Под воздействием электрических полей клетки или их структурные компоненты изменяют свое положение, что регистрируют при микроскопическом исследовании. Для определения процента клеток, проявляющих реакцию в виде возвратно-поступательных движений их тел или их частей используют от 50 до 100 клеток. При исследовании эпителиоцитов с помощью окулярного микрометра измеряют амплитудные характеристики возвратно-поступательных движений ядер и цитолеммы с последующим построением векторограмм. Документирование наблюдений обеспечивают видеосъемкой в первые 1-3 минуты исследований и через 10 минут. Составление указанных выше показателей, а также уровней проницаемости витального красителя используют для диагностики заболеваний.

Известно устройство для капиллярного микроэлектрофореза крови: Abramson Н. , 1942 (см. С.С. Харамоненко, А.А. Ракитянская "Электрофорез клеток крови в норме и патологии, Минск, 1974 г., с. 33-38). Устройство включает в себя электроды, на которые поступает постоянный электрический ток. Между электродами располагают капилляр, заполненный раствором с клетками крови.

Недостатком устройства является то, что его конструкция не позволяет использовать термостатирование и требует помещения клеток в трубку-капилляр, стенки которого усиливают сопротивление жидкости при электрофорезе.

Известно устройство для микроэлектрофореза клеток крови: (см. С.С. Харамоненко, А.А. Ракитянская "Электрофорез клеток крови в норме и патологии, Минск, 1974 г., с. 33-38). Устройство, рассматриваемое в качестве прототипа, представлено горизонтальной камерой, помещенной в водяной термостат, обеспечивающий постоянную температуру. Устройство предусматривает микроскопическое исследование 10-15 клеток в постоянном электрическом поле.

Недостатками устройства, взятого в качестве прототипа, являются сложность конструкции исследовательской стеклянной микрокамеры, ограничения в исследовании, связанные с необходимостью больших разведений клеточной взвеси (не более 0,05%), невозможность изучать большое количество клеток, необходимость трехкратного промера их перемещений справа-налево, слева-направо, справа-налево. Исследования считаются верными при одинаковых скоростях движения каждой клетки в каждом из трех указанных отрезков измерений. Затем обобщаются показатели скорости всех изученных клеток, которые и положены в основу диагностики.

Сущность заявляемого нами изобретения состоит в том, что устройство, содержащее камеру с электродами, термостат, источник питания и блок управления, снабжено блоком генератора и блоком коммутатора, при этом выход источника питания соединен со входом блока генератора, выход блока генератора соединен со вторым входом блока коммутатора, второй выход блока управления соединен с третьим входом блока коммутатора и выходы блока коммутатора соединены с электродами камеры.

Преимущества заявляемого устройства состоят в увеличении числа направленных электрических полей. Это позволяет всесторонне анализировать реакции клеток на действие электрических полей, учитывать взаимосвязь биоэлектрических реакций клеток с их цитоскелетом, уровнем проницаемости, позволяет исследовать разные типы клеток. Устройство автоматически с помощью коммутатора переключает поля с одной пары на другую по часовой стрелке круга с интервалами в 1,0-3,0 секунды. Оси электродов отстоят друг от друга под углом в 45^o. Устройство позволяет использовать не только программу 8-векторного анализа, но и программы двувекторного исследования в любой из четырех пар электродов. Автоматическое переключение полярности на каждой паре электродов происходит с частотой 0,3-1,0 Гц. Устройство поясняется чертежом, на котором изображена функциональная электрическая схема (фиг. 4).

Устройство содержит источник питания (поз. 1), выход которого соединен со входами блока генератора (БГ) (поз. 2) и блока коммутации (БК) (поз. 3). Выход блока управления (БУ) (поз. 4) соединен со входом БГ (поз. 2). Выход блока генератора (поз. 2) соединен со вторым выходом БК (поз. 3), второй выход БУ (поз. 4) соединен с третьим входом БК (поз. 3). Выходы БК (поз. 3) соединены с электродами 5 камеры для исследования 6, выполненной из прозрачного материала, количество электродов может быть от 4 до 16. В рассматриваемом устройстве их восемь. Электроды расположены по окружности, формируя секторы, отстоящие друг от друга на 45^o. В центре исследовательской камеры находится свободная от электродов зона для исследования клеток. Кроме этого, устройство содержит термостат, состоящий из датчика температуры, нагревательных элементов и блока управления температурным режимом настройки (не указаны).

Устройство работает следующим образом. Включают термостатное устройство для обеспечения температуры 37^oC в камере (поз. 6), вносят инкубационный раствор с клетками в камеру (поз. 6), включают блок питания (поз. 1). С помощью устройства создают знакопеременные, разновекторные и симметричные электрические поля в камере (поз. 6). Очередность включения пары электродов определяет блок коммутации (поз. 3). Каждая новая пара электродов автоматически включается через 1,0-3,0 секунды, в каждой паре автоматически происходит смена знаков на электродах с частотой 0,3-1,0 Гц. Смена симметричных пар электродов происходит в одном направлении по кругу. В устройстве предусмотрены возможности не только поочередной автоматической знакопеременной активации клеток по окружности камеры, но и автономной активации в пределах любой из 4 пар электродов. Смену режимов исследования обеспечивает блок управления и его переключатели. Под влиянием электрических полей в каждом секторе камеры происходят изменения положений клеток или их цитолеммы, ядер. Полярность, мозаичность распределения электрических зарядов на поверхности клетки, влияние цитоскелета на изменения положений ядер, органоидов, включений, цитолеммы определяют отличия реакций клеток в каждом векторе электрического поля. Эти отличия выявляют при микроскопическом исследовании. Для регистрации информации используют: микроскоп с окулярным микрометром, видеокамеру, персональный компьютер с периферическими выходами. Обобщение, сравнение результатов, полученных с помощью заявленного устройства, используют для диагностических целей.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностических целей в гематологии, онкологии дерматовенерологии, гинекологии, гастроэнтерологии, проктологии, отоларингологии, других отраслях медицины, а также в ветеринарии, биологии. Исследуемые клетки крови или эпителиоциты помещают в инкубационный раствор для прижизненного исследования биоэлектрических свойств, проницаемости. С помощью устройств создают многовекторные, симметричные, знакопеременные электрически поля. Под микроскопом определяют реакции клеток на воздействия электрических полей по возвратно-поступательным движениям клеток или их ядер, цитолеммы. Способ и устройство позволяют снизить время для получения информации и повысить точность исследования. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ микроэлектрофореза клеток крови и эпителиоцитов, включающий помещение исследуемых объектов в инкубационную среду и в электрическое поле, оценку биоэлектрических показателей по изменению положений клеток, а также их оболочек, ядер, отличающийся тем, что исследуемые объекты помещают в знакопеременное многовекторное электрическое поле. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 8-векторное электрическое поле. 3. Устройство для микроэлектрофореза, клеток крови и эпителиоцитов, содержащее камеру с электродами, термостат, источник питания и блок управления, отличающееся тем, что в него дополнительно введены пары электродов и оно снабжено блоком генератора и блоком коммутатора, при этом выход источника питания соединен со входом блока генератора, выход блока генератора соединен со вторым входом блока коммутатора, второй выход блока управления соединен с третьим входом блока коммутатора и выходы блока коммутатора соединены с электродами камеры.