СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yfeH Российский патент 2008 года по МПК C12N1/21 C12P13/04 C12R1/19 

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой экспрессия гена yfeH ослаблена.

Описание предшествующего уровня техники

Обычно L-аминокислоты получают в промышленности методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природы или их мутантов. В большинстве случаев микроорганизмы модифицируют, чтобы увеличить производственный выход L-аминокислот.

К настоящему времени описано множество технологий увеличения производственного выхода L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов с помощью рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие технологии повышения производственного выхода подразумевают усиление активности ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот, и/или десенсибилизацию регуляции целевых ферментов конечной L-аминокислотой по типу обратной связи (см., например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4,346,170 и 5,661,012, а также 6,040,160).

Другой путь увеличения производственного выхода L-аминокислот подразумевает ослабление экспрессии гена или нескольких генов, участвующих в разрушении целевой L-аминокислоты, генов, выводящих предшественники целевой аминокислоты из пути биосинтеза этой L-аминокислоты, генов, участвующих в распределении потоков углерода, азота, фосфата, генов, кодирующих токсины и т.д.

Ген yfeH в клетках Escherichia coli кодирует белок yfeH, предположительно являющийся цитохромоксидазой. В настоящее время отсутствуют сообщения об инактивации гена yfeH для целей получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются усиление продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием этих штаммов.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что инактивация гена yfeH может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Целью настоящего изобретение является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, при этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена yfeH в этой бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом экспрессия гена yfeH ослаблена путем инактивации гена yfeH.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, и

- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты, при этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена yfeH в этой бактерии ослаблена.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» в качестве применяемого здесь термина также означает бактерию, способную продуцировать и вызывать накопление любой L-аминокислоты в питательной среде в больших количествах по сравнению с диким типом или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Предпочтительными, в частности, являются L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnologylnformation) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, но не ограничивается только ею, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. {Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были заново классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol, 43,162-173 (1993)).

Термин «бактерия, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии экспрессия гена yfeH ослаблена», означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит меньшее количество белка yfeH по сравнению с немодифицированной бактерией или что модифицированная бактерия становится неспособной синтезировать белок yfeH.

Термин "инактивация гена yfeH" означают, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Возможно также, что модифицированный участок ДНК неспособен нормально экспрессировать ген в результате делеции части гена, сдвига рамки считывания гена, введения missense/nonsense мутации(й) или модификации прилегающей к гену области в результате включения последовательностей, контролирующих экспрессию гена, таких как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.

Ген yfeH кодирует белок yfeH, предположительно являющийся цитохромоксидазой (синоним - В2410). Ген yfeH (gi: 49175990; номера нуклеотидов с 2,524,968 по 2,525,966 в последовательности с инвентарньм номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; SEQ ID NO: 1) располагается между генами yfeR и UgA на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена yfeH и аминокислотная последовательность кодируемого им белка yfeH приведена в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно.

Поскольку в последовательностях ДНК разных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae могут существовать некоторые различия, нуклеотидная последовательность гена yfeH, подлежащего инактивации, не ограничивается последовательностью гена, приведенной в SEQ ID No:1, но также может включать последовательности генов, гомологичных последовательности, приведенной в SEQ ID No:. Поэтому вариант белка, кодируемого геном yfeH, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительней не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, кодируемой геном yfeH и приведенной в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO.2, при условии, что активность белка yfeH как цитохромоксидазы до инактивации сохраняется.

Кроме того, ген yfeH может быть представлен вариантом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок yfeH таким, каким он был до инактивации. "Жесткие условия" включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды - не образуются. Например, демонстрацией жестких условий может служить однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная отмывка при концентрации солей 1 × SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1 × SSC, 0.1% SDS, при температуре 60°С. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от условий гибридизации и обычно варьирует в диапазоне от 100 п.о. до 1 тыс. п.о.

Способы ослабления экспрессии гена yfeH подразумевают, например, такое изменение или удаление гена yfeH, которое приводит к снижению или к исчезновению внутриклеточной активности белка, кодируемого геном yfeH, в сравнении с немодифицированным штаммом или диким штаммом. В качестве примера, этот результат может быть достигнут в результате использования рекомбинации для инактивации гена yfeH на хромосоме или для изменения экспрессии регулирующей последовательности, такой как промотор или последовательность Шайн-Дальгарно (SD) (заявка РСТ WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog. 15, 58-64 (1999)). Ослабление экспрессии гена может быть также достигнуто путем введения аминокислотной замены с помощью «missense» мутации в области хромосомы, кодирующей фермент, путем введения стоп-кодона с помощью «nonsense» мутации, путем введения или удаления одного или двух оснований для создания мутации сдвига рамки или с помощью удаления части или области гена, или самого гена целиком (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. Et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)).

Ферментативная активность может быть снижена или полностью отменена путем конструирования гена, кодирующего измененный фермент, или гена, в котором отсутствует кодирующая область, с помощью гомологичной рекомбинации, которая позволяет заменить нормальный ген на хромосоме сконструированным геном, и путем введения транспозона или IS фактора в ген.

Для введения мутации, вызывающей снижение или отмену активности фермента с помощью генной рекомбинации, в качестве примера могут быть использованы следующие методы. Часть последовательности целевого гена модифицируется, приготавливается измененный ген, который не продуцирует нормально функционирующий фермент, проба ДНК, содержащей этот ген, используется для трансформации бактерии из семейства Enterobacteriaceae, и осуществляется рекомбинация мутантного гена с геном на хромосоме, что приводит в конечном итоге к замещению целевого гена на хромосоме на мутантный ген.

Такая замена гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведена методами, использующими линейную ДНК, такими как метод "Red-зависимой интеграции" (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p. 6640-6645 (2000)), а также методами, использующими плазмиду, содержащую чувствительный к температуре репликон (патент США 6,303,383 или патент Японии JP 05-007491A). Кроме того, вхождение сайт-специфической мутации путем замены гена с использованием гомологичной рекомбинации, такой как сформулирована выше, также может быть проведено с использованием плазмиды, потерявшей способность к репликации в клетке хозяина.

Инактивация указанного гена может быть выполнена традиционными методами, такими, как мутагенез с использованием УФ излучения или обработки нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83) и (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), называемого также "Red-зависимая интеграция".

В настоящее время ничего не известно об активности белка yfeH. Присутствие или отсутствие гена yfeH в хромосоме бактерии может быть установлено хорошо известными методами, включая ПЦР, блотинг по Саузерну и подобные им. Дополнительно, уровень экспрессии гена может быть установлен путем измерения количества мРНК, транскрибируемого с гена, с использованием различных хорошо известных методов, включая блотинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и подобные им. Количество белка, кодируемого геном, может быть измерено хорошо известными методами, включая SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом («Вестерн блотингом») и подобные им.

Методами приготовления плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерии - продуценты L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, которая модифицирована таким образом, что в ней ослаблена экспрессия гена yfeH, может быть использована бактерия, способная продуцировать как ароматические, так и неароматические L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена yfeH в бактерии, уже обладающей способностью продукцировать L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой ген yfeH уже инактивирован, способности продуцировать L-аминокислоты.

Бактерии - продуценты L-треонина

Примеры родительских штаммов для выведения бактерии - продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патент США 5,175,107, патент США 5,705,371), Е.coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (патент США 5,631,157), Е.coli NRRL-21593 (патент США 5,939,307), Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5,474,918), Е.coli FERM BP-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5,376,538), Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика (в России), 14, 947-956 (1978)), Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А), и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, с существенно десенсибилизированной регуляцией треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейский патент ЕР 0593792В) согласно настоящему изобретению также может быть использован в качестве родительского штамма для выведения бактерии-продуцента L-треонина. Штамм В-5318 является прототрофным в отношении изолейцина, а регуляторная область треонинового оперона в плазмиде pVIC40 заменена на репрессор лямбда-фага С1, чувствительный к температуре, и PR промотор. Штамм ВКПМ В-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером VKPM В-5318.

Желательно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких генов, перечисленных ниже:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I,

устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена asd, кодирующего аспартат-(3-полуальдегиддегидрогеназу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок; и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу);

Ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I Escherichia coli был расшифрован (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентраным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме штамма Е.coli К-12. Ген thrB, который кодирует гомосеринкиназу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме штамма Е.coli К-12. Ген thrC, который кодирует треонинсинтазу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ на хромосоме штамма Е.coli К-12. Все три гена функционируют как отдельный оперон треонина. Для усиления экспрессии треонинового оперона из него желательно удалить область аттенуатора, который влияет на транскрипцию (заявки РСТ WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, который кодирует аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, а также гены thrB и thrC могут быть получены в составе одного оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая присутствует в штамме-продуценте треонина Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18-й минуте хромосомы Е.coli рядом с gInHPQ опероном, который кодирует компоненты системы глутаминового транспорта. Ген rhtA идентичен ORF1 (rev.ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541, gi:440181 в базе данных GenBank) и расположен между генами рехВ и ompX. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был обозначен как ген rhtA (rht: устойчивость к гомосерину и треонину). Также было показано, что мутация rhtA13 является заменой нуклеотидного остатка G на нуклеотидный остаток А в позиции 1 относительно стартового кодона ATG (ABSTRACTS of the 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Ген asd Е.coli уже описан (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 161313 07 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5:185) с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Ген aspC E. coli тоже уже описан (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi:16128895 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР. Гены aspC от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Бактерии - продуценты L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично отменяется, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются только ими, оксализин, лизингидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (АЕС), γ-метиллизин, α-хлорокапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обычными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4,346,170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах снижена чувствительность аспартокиназы к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии - продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был выведен путем придания штамму W3110, производному от штамма Escherichia coli К-12, устойчивости к АЕС. Полученный штамм был назван Escherichia coli A J 13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер PERM BP-5252 (смотри патент США 5,827,698).

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий - продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, включают, но не ограничиваются только ими, дигидродипиколинатсинтазу (DapA), аспартокиназу (LysC), дигидродипиколинатредуктазу (DapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (LysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатполуальдегиддегидрогеназу (asd) и аспартазу (AspA) (Европейский патент ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, участвующего в эффективном использовании энергии (суо) (Европейский патент ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (PntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий - продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, имеющие сниженную или элиминированную активность фермента, который катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и пируват-малаткарбоксилазу/малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерии - продуценты L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацеталтрансферазы (патент США 6,218,168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белки, участвующие в процессе секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5,972,663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571A2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307A1) и подобные им.

Бактерии - продуценты L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий - продуцентов L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; штамм Е.coli H-9068 (JP8-70879A2) и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, участвующих в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерии - продуценты L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий-продуцентов L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, РФ 2003677); Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, РФ 2119536); Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4,388,405); Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Е.coli Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6,344,347); Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент ЕР1085087); Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6,258,554), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-гистидина согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина, усилена. Примеры ферментов биосинтеза L-гистидина включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (HisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (HisI), фосфорибозил-АТФ-пирофосфогидролазу (HisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (HisA), амидотрансферазу (HisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (HisC), гистидинолфосфатазу (HisB), гистидинолдегидрогеназу (HisD) и так далее.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI) угнетаются L-гистидином, и поэтому способность продуцировать L-гистидин может быть также эффективно усилена путем введения мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в фермент фосфорибозилтрансферазу (HisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).

Отдельные примеры штаммов, обладающих способностью продуцировать L-гистидин, включают штаммы Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, несущий ДНК, кодирующую ферменты биосинтеза L-гистидина (патент Японии JP 56-005099 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ-7270, патент РФ 2119536), и так далее.

Бактерии - продуценты L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как Е.coli VL334thrC⁺(Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину и имеет мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4,278,765). Аллель гена thrC дикого штамма переносили методом основной трансдукции с использованием бактериофага Р1, растущего на клетках штамма дикого типа Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотрофный по L-изолейцину VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961). Этот штамм способен продуцировать L-глутаминовую кислоту,

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобисфосфатальдолазу, фосфофруктокиназу и глюкозофосфатизомеразу.

Примеры штаммов, модифицированных так, что экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы усилена/ы, включают штаммы, описанные в Европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А, и ЕР952221А.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы со сниженной или элиминированной активностью фермента, который катализирует синтез компонента, другой чем L-глутаминовая кислота, но ответвляющийся от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, ацетогидроксикислуюсинтазу, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, дефицитные по активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеющие сниженную активность фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно они включают нижеследующие штаммы:

E.coli W3110sucA::Kmr

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

Е.coli W3110sucA::Kmr является штаммом, полученным путем разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (в дальнейшем именуемого как ген "sucA)» в штамме Е.coli W3110. Этот штамм полностью дефицитен по α-кетоглутаратдегидрогеназе.

Другие примеры бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты включают штаммы, которые принадлежат к роду Escherichia и обладают устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты. Эти штаммы могут быть также лишены активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы и включают, к примеру, штаммы Е.coli AJ13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5,908,768), FFRM Р-12379, который к тому же имеет низкую способность расщеплять L-глутаминовую кислоту (патент США 5,393,671); AJ13138 (FERM ВР-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.

Примеры бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты включают мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены, как описано выше. Такие штаммы включают штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419). Штамм Pantoea ananatis AJ13356 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 19 февраля, 1998 года и получил инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 11 января 1999 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 лишен активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы в результате разрушения субъединицы aKGDH-El гена sucA. При получении вышеописанный штамм был идентифицирован как штамм Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако в последнее время на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S pRNA он был переклассифицирован как принадлежащий к виду Pantoea ananatis. Хотя штамм AJ13356 был депонирован в вышеупомянутый депозитарий как штамм Enterobacter agglomerans, в целях данной спецификации они описываются как штаммы Pantoea ananatis.

Бактерии - продуценты L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются только ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Е.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКПМ В-8197); Е.coli HW1089 (АТСС 55371) несущий ген pheA34 (патент США 5,354,672); Е.coli MWEC101-b (KR8903681); Е.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4,407,952). Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы штаммы Е.coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] названный AJ 12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент EP 488424 B1). Кроме того могут использоваться бактерии - продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с усиленной активностью белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1 соответственно).

Бактерии - продуценты L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенными фермента триптофанил-тРНК-синтетаза, кодируемого мутантным геном trpS (патент США 5,756,345); штамм E. coli SV164 (pGH5) с аллелем serA, кодирующим фосфоглицератдегидрогеназу со снятым ингибированием серином по типу обратной связи и аллелем trpE, кодирующим антранилатсинтазу со снятым ингибированием триптофаном по принципу обратной связи (патент США 6,180,373); штаммы E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные фермента триптофаназы (патент США 4,371,614); штамм E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность продуцировать фосфоенолпируват (заявка РСТ W09708333, патент США 6,319,696) и подобные им могут быть использованы.

Ранее было установлено, что ген yddG, кодирующий белок мембраны, который не участвует в пути биосинтеза никакой L-аминокислоты, придает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аминокислотным аналогам, при условии, если аллель дикого штамма этого гена амплифицировать на мультикопийном векторе в микроорганизме. Помимо этого ген yddG может усилить продукцию L-фенилаланина или L-триптофана при условии, если ввести дополнительные копии в клетки соответствующих штаммов-продуцентов (заявка РСТ WO 03044192). Поэтому желательно, чтобы бактерия - продуцент L-триптофана была в дальнейшем модифицирована таким образом, чтобы иметь усиленную экспрессию открытой рамки считывания yddG.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилены одна или более активностей ферментов, выбранных из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. Ферменты антранилатсинтаза и фосфоглицератдегидрогеназа оба подвержены ингибированию по типу обратной связи со стороны L-триптофана и L-серина, поэтому в эти ферменты можно вводить мутацию, десенсибилизирующую ингибирование по типу обратной связи. Отдельные примеры штаммов, имеющих такую мутацию, включают штамм Е.coli SV164, который несет десенсибилизированную антранилатсинтазу и штамм-трансформант, полученный путем введения в штамм Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), который содержит мутантный ген serA, кодирующий фермент фосфоглицератдегидрогеназу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых введен опреон триптофана, который содержит ген, кодирующий фермент антранилатсинтазу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи (патентные заявки Японии JP 57-71397 А и JP 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность продуцировать L-триптофан может быть придана путем усиления экспрессии гена, кодирующего триптофансинтазу в составе оперонов триптофана trpBA. Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц, α и β, которые кодируются генами trpA и trpB соответственно. Дополнительно способность продуцировать L-триптофан может быть улучшена путем усиления экспрессии оперона изоцитратлиазомалатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Бактерии - продуценты L-пролина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-пролина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), который лишен гена ilvA и способен продуцировать L-пролин (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть усовершенствована путем усиления экспрессии одного или более генов, участвующих в биосинтезе L-пролина. Примеры таких генов для бактерий - продуцентов L-пролина, которые являются предпочтительными, включают ген proB, кодирующий фермент глютаматкиназу, для которого регуляция L-пролином по типу обратной связи десенсибилизирована (патент Германии DE Patent 3127361). Дополнительно бактерия согласно настоящему изобретению может быть усовершенствована путем усиления экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, экспортирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примером таких генов могут служить гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (Европейская патентная заявка ЕР1239041 А2).

Примеры бактерий - продуцентов L-пролина, принадлежащих к роду Escherichfa, включают следующие штаммы Е.coli; NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутантные штаммы, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутантные штаммы, описанные Bloom F.R. и соавт. (The 15th Miami winter symposium, 1983, р.34), и подобные им.

Бактерии - продуценты L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и производные от него штаммы, несущие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358А1), штамм - продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают также штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина, усилена. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглютамилфосфатредуктазу (ArgC), орнитинацетилтрансферазу (ArgJ), N-ацетилглутаматкиназу (ArgB), ацетилорнитинтрансаминазу (ArgD), орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), синтетазу аргининоянтарной кислоты (ArgG), лиазу аргининоянтарной кислоты (ArgH), и карбамоилфосфатсинтетазу.

Бактерии - продуценты L-валина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-валина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, которые модифицированы таким образом, что экспрессия оперона ilvGMEDA усилена (патент США 5,998,178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, необходимую для аттенуации, для того чтобы экспрессия опрерона не снижалась вырабатываемым L-валином. Кроме того, ген ilvA в опероне желательно разрушить для того, чтобы активность треониндезаминазы снизилась.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-валина согласно настоящему изобретению, включают также мутантные штаммы, имеющие мутацию фермента аминоацил-т-РНК-синтетазы (патент США 5,658,766). К примеру, можно использовать штамм Е.coli VL1970, несущий мутацию в гене ileS, который кодирует фермент изолейцин т-РНК синтетазу. Штамм Е.coli VL1970 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 года с инвентарным номером ВКПМВ-4411.

Кроме того, мутантные штаммы, требующие для своего роста присутствия липоевой кислоты и/или отсутствия H⁺-АТФ-азы, могут быть также использованы в качестве родительских штаммов (заявка РСТ WO 96/06926).

Бактерии - продуценты L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-валина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, имеющими мутации устойчивости к 6-диметиламинопурину (патентная заявка Японии JP 5-304969 А), имеющими мутации устойчивости к аналогам изолейцина, таким как тиоизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантными штаммами, имеющими дополнительно устойчивость к DL-этионину и/или гидроксомату аргинина (патентная заявка Японии JP 5-130882 А). Дополнительно, в качестве родительских штаммов могут быть использованы рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, участвующие в биосинтезе L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (патентная заявка Японии JP 2-458 А, патент Франции FR 0356739 и патент США 5,998,178).

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты вкультуральной жидкости и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, например при перемешивании культуральной жидкости на качалке, взбалтывании с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30°С до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды можно доводить аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

На чертеже изображено конструирование плазмиды pUC-yfeH::cat, используемой для трансформации штамма E.coli JC7623.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие неограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование плазмиды pUC-yfeH::cat и трансформация штамма E.coli JC7623

Фрагмент ДНК, содержащей ген yfeH, был получен в результате амплификации соответствующего участка хромосомы штамма E.coli К 12 с использованием праймеров Р1 (SEQ ID NO:3) и Р2 (SEQ ID NO:4). Затем этот фрагмент ДНК очищали путем выделения соответствующей полосы из агарозного геля и клонировали по сайту Smal плазмиды pUC18. В результате была получена плазмида pUC-yfeH.

Для конструирования неактивной формы гена yfeH плазмиду pUC-yfeH расщепляли с помощью рестриктазы BstXl и обрабатывали с помощью фрагмента Кленова для получения тупых концов. Плазмида pACYC184 использовалась в качестве источника гена cat. Эту плазмиду расщепляли с помощью рестриктазы Eco47III и соответствующий фрагмент размером ˜1.3 тыс. пар оснований выделяли из агарозного геля. Этот фрагмент лигировали по затупленным концам сайта BstXI плазмиды pUC-yfeH, и в результате была получена плазмида pUC-yfeH::cat. Затем плазмиду pUC-yfeH::cat расщепляли с помощью рестриктазы BamHI и использовали для трансформации штамма E.coli JC7623. Штамм JC7623 (генотип thr-1, ara-14, leuB6, Δ(gpt-proA), lacJ1, sbcC201, tsx-33, supE44, galK2, sbcB15, hisG4, rfbDl, xyl-5, mtl-1, argE2, thi-1) получали из ВКПМ (инвентарный номер: ВКПМ-1310). Клоны Cm^R отбирали на LB-среде, содержащей хлорамфеникол в концентрации 30 мкг/мл. Присутствие неактивного гена yfeH подтверждали результатами ПЦР с использованием праймеров Р1 и Р2. Продукт ПЦР, полученный в реакции при использовании в качестве матрицы родительского штамма JC7623, достигал длины ˜1 тыс. пар оснований. Продукт ПЦР, полученный в реакции при использовании в качестве матрицы мутантного штамма JC7623 yfeH::cat, достигал длины ˜2.1 тыс. пар оснований.

Все молекулярно-биологические методики выполнялись в соответствии с протоколами, описанными в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию треонина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat переносили в штамм - продуцент треонина Е.coli VKPM В-3996 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY).

Оба штамма Е.coli, B-3996 и B-3996-yfeH::cat, выращивали в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры штаммы выращивали на роторной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов в пробирках объемом 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона, дополненного 4% глюкозы. Затем в среду для ферментации вносили 0.21 мл (10%) посевного материала. Процесс ферментации проводился в 2 мл минимальной среды для ферментации в пробирках объемом 20×200 мм. Клетки выращивали в течение 65 часов при температуре 32°С с перемешиванием в режиме 250 об/мин.

После культивирования количество накопленного в среде L-треонина определяли методом бумажной хроматографии, используя подвижную фазу следующего состава: бутанол : уксусная кислота : вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовался для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5%-ным водным раствором CaCl, после чего количество L-треонина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации представлены в Таблице 1.

Использовалась среда для ферментации следующего состава (г/л):

Глюкоза80.0(NN₄)₂SO₄22.0NaCl0.8KH₂PO₄2.0MgSO₄ 7H₂O0.8FeSO₄ 7H₂O0.02MnSO₄ 5Н₂О0.02Тиамина гидрохлорид0.0002Дрожжевой экстракт1.0СаСО₃30.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов, рН доводили до 7.0. Антибиотики вносили в среду после ее стерилизации.

Как следует из Таблицы 1, штамм B-3996-yfeH::cat вызывает накопление большего количества L-треонина по сравнению со штаммом B-3996.

Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е.coli AJ 11442-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию лизина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент лизина Е.coli WC196 (pCABD2) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Плазмида pCABD2 включает ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу, имеющую мутацию, которая обуславливает десенсибилизацию регулирования L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III, имеющую мутацию, которая обуславливает десенсибилизацию регулирования L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидрожипиколинатредуктазу и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6,040,160).

Оба штамма, Е.coli, WC 196(pCABD2) и WC196(pCABD2)-yfeH::cat, могут быть выращены в L-среде со стрептомицином (20 мг/л) при температуре 37°С, и 0.3 мл полученной культуры могут быть внесены в 20 мл среды для ферментации, содержащей необходимые компоненты во флаконе объемом 500 мл. Культивирование может быть проведено при температуре 37°С в течение 16-ти часов с использованием возвратного встряхивателя со скоростью взбалтывания 115 об/мин. После культивирования количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде могут быть измерены известным методом (Biotech-analyzer AS210 manufactured by Sakura Seiki Co.). Затем выход L-лизина может быть рассчитан относительно израсходованной глюкозы для каждого из штаммов.

Может быть использована среда для ферментации следующего состава (г/л):

Глюкоза40(NH₄)₂SO₄24К₂HPO₄1.0MgSO₄ 7H₂O1.0FeSO₄ 7Н₂О0.01MnSO₄ 5H₂O0.01Дрожжевой экстракт2.0

рН можно доводить до 7.0 с помощью КОН, и среду можно автоклавировать при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄ 7Н₂O стерилизуют раздельно. Также можно добавить СаСО₃ до конечной концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованный сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов.

Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)-vfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-цистеина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм JM15 (ydeD)- yfeH::cat.

Штамм E. coli JM15(ydeD) является производным от штамма Е.coli JM15 (патент США 6,218,168), который можно трансформировать с помощью фрагмента ДНК, несущего ген ydeD, кодирующий белок мембраны и не участвующий в пути биосинтеза никакой L-аминокислоты (патент США 5,972,663).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина описаны подробно в Примере 6 патента США 6,218,168.

Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-лейцина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент L-лейцина Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6,124,121) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм 57-pMW-yfeH::cat.

Оба штамма, Е.coli, 57 и 57-yfeH::cat, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры штаммы могут быть культивированы на возвратной качалке (250 об/мин) при температуре 32°С в течение 18 часов в тестовых пробирках объемом 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой. Затем в среду для ферментации может быть внесен посевной материал в объеме 0.21 мл (10%). Ферментация может проходить в 2 мл минимальной среды для ферментации в тестовых пробирках объемом 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при температуре 32°С со взбалтыванием в режиме 250 об/мин. Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав жидкой фазы:бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Состав среды для ферментации (г/л) (рН 7.2):

Глюкоза60.0(NH₄)₂SO₄25.0К₂HPO₄2.0MgSO₄ 7H₂O1.0Тиамин0.01СаСО₃25.0

Глюкоза и мел стерилизуются раздельно.

Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-гистидина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм Е.coli 80 был описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.

Оба штамма Е.coli, 80 и 80-yfeH::cat, могут культивироваться в L-бульоне в течение 6 часов при температуре 29°С. Затем 0.1 мл полученной культуры могут быть внесены в 2 мл среды для ферментации в пробирки объемом 20×200 мм и культивированы в течение 65 часов при температуре 29°С со взбалтыванием на возвратной качалке в режиме 350 об/мин. После культивирования количество гистидина, которое накопилось в среде, может быть измерено с помощью бумажной хроматографии. Бумага может быть экпонирована с использованием подвижной фазы, состоящей из н-бутанола : уксусной кислоты : воды = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован в качестве визуализирующего реагента.

Состав среды для ферментации (г/л) (рН 6.0);

Глюкоза100.0Мамено0.2 по общему азотуL-пролин1.0(NH₄)₂SO₄25.0KH₂PO₄2.0MgSO₄ 7H₂O1.0FeSO₄ 7H₂O0.01MnSO₄0.01Тиамин0.001Бетаин2.0СаСО₃60.0

Глюкоза, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуются раздельно. Значение рН доводится до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 7. Продукция L-глутамина штаммом Е.coli VL334thrC⁺-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-глутамина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент L-глутамина Е.coli VL334thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) для получения штамма VL334thrC⁺-yfeH::cat.

Оба штамма, VL334thrC⁺и VL334thrC⁺-yfeH::cat, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем петля с клетками может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл со средой для ферментации. Среда для ферментации содержит глюкозу (60 г/л), сульфат аммония (25 г/л), КН₂SO₄ (2 г/л), MgSO₄ (1 г/л), тиамин (0.1 мг/мл), L-изолейцин (70 мкг/мл), и мел (25 г/л). рН должна быть доведена до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют раздельно. Культивирование может быть проведено при температуре 30°С в течение 3 дней со встряхиванием. После культивирования количество выработанной L-глутаминовой кислоты может быть измерено с помощью ТСХ (состав жидкой фазы; бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием компонентов в 50%-лом этаноле с 0.5%-ным CdCl₂.

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-vfeH::cat Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-фенилаланина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент фенилаланина Е.coli AJ 12739 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм Е.coli A J 1273 9 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197.

Оба штамма, AJ12739-yfeH::cat и AJ12739, могут быть выращены при температуре 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, и 0.3 мл полученной культуры могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации в пробирки объемом 20×200 мм и выращены при температуре 37°С в течение 48 часов со встряхиванием на роторной качалке. После культивирования количество фенилаланина, которое накапливается в среде, может быть определено с помощью ТСХ. Могут быть использованы пластинки для ТСХ размером 10×15 см, покрытые силиконовым гелем, содержащим нефлуоресцирующий индикатор (Стоковая Компания Сорбполимер, Краснодар, РФ). Пластинки Sorbfil могут быть проявлены подвижной фазой, содержащей пропан-2-ол : этилацетат : 25% жидкий аммоний : вода=40:40:7:16 (v/v). 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне может быть использован в качестве проявляющего реагента.

Состав среды для ферментации может быть следующим (г/л):

Глюкоза40.0(NH₄)₂SO₄16.0К₂HPO₄0.1MgSO₄ 7H₂O1.0FeSO₄ 7H₂O0.01MnSO₄ 5H₂O0.01Тиамина HCl0.0002Дрожжевой экстракт2.0Тирозин0.125СаСО₃20.0

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются раздельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов. РН доводится до значения 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)-yfeH::cat Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-триптофана фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм SV164 (pGH5) был подробно описан в патенте США 6,180,373 и в Европейском патенте 0662143.

Оба штамма, SV164(pGH5)-yfeH::cat и SV164(pGH5), могут быть выращены со встряхиванием при температуре 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (20 мг/мл) в качестве маркера плазмиды pGH5. Полученные культуры в объеме 0.3 мл каждая могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации, содержащей тетрациклин (20 мг/мл) в пробирках размером 20×200 мм, и выращены при температуре 37°С в течение 48-и часов на роторной качалке в режиме 250 об/мин. После культивирования количество триптофана, накопленное в среде, может быть определено с помощью ТСХ, как описано в Примере 7. Компоненты среды для ферментации перечислены в Таблице 2 и стерилизуются в отдельных группах (А, В, С, D, Е, F, и Н), как показано в таблице, чтобы избежать нежелательных взаимодействий в процессе стерилизации. рН раствора А доводится до 7.1 с помощью аммиака.

Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-пролина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм 702ilvA был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012.

Оба штамма, 702ilvA и 702ilvA-yfeH::cat, могут быть выращены при температуре 37°С в течение 18-24 часов на чашках с L-агаром. Затем штаммы можно культивировать в тех же условиях, которые описаны в Примере 8.

Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-yfeH::cat

Для проверки влияния инактивации гена yfeH на продукцию L-аргинина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli JC7623 yfeH::cat могут быть перенесены в штамм - продуцент аргинина Е.coli 382 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.

Оба штамма, 382-yfeH::cat и 382, могут быть выращены со встряхиванием при температуре 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. Полученные культуры в объеме 0.3 мл каждая могут быть внесены в 3 мл среды для ферментации в пробирки размером 20×200 мм и культивированы при температуре 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После культивирования количество L-аргинина, которое накопилось в среде, может быть определено с помощью бумажной хроматографии, используя подвижную фазу следующего состава : бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне может быть использован в качестве проявляющего реагента. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано, L-аргинин может быть элюирован 0.5%-ным водным раствором CdCl₂, а количество аргинина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Состав среды для ферментации может быть следующим (г/л):

Глюкоза48.0(NH₄)₂SO₄35.0КН₂PO₄2.0MgSO₄ 7H₂O1.0Тиамина HCl0.0002Дрожжевой экстракт1.0L-изолейцин0.1СаСО₃5.0

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются раздельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов. рН доводится до значения 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Таблица 1ШтаммOD540Количество L-треонина,г/лВ-399621.4±0.224.2±0.5B-3996-yfeH::cat22.2±1.325.4±0.9

Таблица 2РастворыКомпонентКонечная концентрация, г/лАKH₂PO₄1.5 NaCl0.5 (NH₄)₂SO₄1.5 L-Метионин0.05 L-Фенилаланин0.1 L-Тирозин0.1 Мамено (общий азот)0.07ВГлюкоза40.0 MgSO₄×7H₂O0.3СCaCl₂0.011DFeSO₄×7H₂O0.075 Цитрат натрия1.0ЕNa₂MoO₄×2H₂O0.00015 Н₃ВО₃0.0025 CoCl₂×6Н₂O0.00007 CuSO₄×5H₂O0.00025 MnCl₂×4H2O0.0016 ZnSO₄×7H₂O0.0003FТиамина HCl0.005GСаСО₃30.0HПиридоксин0.03

Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет собой способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что ген yfeH у этой бактерии инактивирован. Изобретение позволяет получать L-треонин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген yfeH.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген yfeH инактивирован за счет делеции гена yfeH в хромосоме бактерии.3. Способ получения L-треонина, включающий выращивание бактерии по любому из пп.1 и 2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление L-треонина в культуральной жидкости, и выделение L-треонина из культуральной жидкости.