Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина Советский патент 1991 года по МПК C12P13/08 C12N15/00 

1

(21)4334022/13

(22)26.11.87

(46) 30.11.91. Бюл. №44

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

(72)В.Г.Дебабов, Ю.И.Козлов, Е.М.Хургес, В.А.Лившиц, Н.И.Жданова, М.М.Гусяти- нер, А.К.Соколов, Т.А.Бачина, Н.К.Янковский, Ю.Д.Цыганков, А.Ю.Чистосердов, Т.Г.Плотникова, И.О.Шакалис. А.В.Беларе- ва, Р.А.Арсатянц, А.Ф.Шолин и Т.М.Позднякова

(53)663.15(088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 974817, кл. С 12 Р 13/08, 1981.

Авторское свидетельство СССР № 1362021, кл. С 12 Р 13/08, 1987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА

(57)Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего

незаменимую аминокислоту L-треонин, который применяется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения, в качестве добавки в корма животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности. Цель изобретения - штамм бактерий Escherichla coll ВКПМ-3996, позволяющий получить высокий выход L-треонина в условиях большого числа генераций бактериальной культуры. Штамм содержит рекомбинантную плазмиду которая в отличие от плазмиды pYN 7 иззестного штамма-продуцента стабильно сохраняется при росте культуры без селективного давления, направленного на поддержание плазмиды. Предлагаемый штамм позволяет получать до 85 г/л L-треонина за 36 ч ферментации в лабораторных условиях. В условиях, аналогичных -промышленной ферментации по числу генераций, продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего незаменимую аминокислоту L-треонин, который применяется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения, в качестве добавки о корма жи- вотных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности.

Цель изобретения - штамм бактерий, позволяющий получить высокий выход Lтреонинавусловияхбольшого числа генераций бактериальной культуры при отсутствии в питательной среде антибиотик1.

Новый штамм бактерий Escherichla col ВНИИгенешка-640 содержит рекомбинантную плазмиду pVIC 40, которая в отличие от плазмиды pYN7 известного штамма-продуцента L-треонина Е.соП ВКПМ В-3420 (лабораторный номер ВНИИ- генетика ТДГ-6)стабильно сохраняется при росте культуры без селективного давления, направленного на поддержание плэзмиды,

о

4Ь W

т.е в отсутствие в питательной среде антибиотика. Это свойство плазмиды pVIC 40 позволяет предлагаемому штамму обеспечивать высокий вывод треонина в условиях большого числа генераций бактериальной культуры, а именно при обогащении питательной среды ростовыми факторами (аминокислотами), а также в условиях промышленного производства.

Предлагаемый штамм позволяет пол- учать до 85 г/л треонина за 36 ч ферментации в лабораторных условиях. В условиях, аналогичных промышленной ферментации по числу генераций (клеточных делений) культуры на средах без антибиотиков, штамм продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации. Накопление подобных аминокислот (аланин, глицин, глутаминовая кислота) составляет не более 3 г/л.

Новый продуцент получен в результате генетической трансформации плазмидой pVIC 40 бесплазмидных клеток известного штамма ВНИИгенетика ТДГ-6 и сохраняет те генетические свойства известного штамма, которые определяются хромосомой кле- ток. Новая гибридная плазмида pVIC40 несет тот же фрагмент хромосомы E.coli, что и плазмида pYN7, кодирующая ген биосинтеза треонина, и сообщает клеткам устойчивость к антибиотику стрептомицину. В отличие от нее новая плазмида сохраняется в клетках при росте в неселективных условиях.

Новая гибридная плазмида pVIC 40 получена путем обработки плазмиды pYN 7, а также векторной плазмиды, являющейся производной известных плазмид pRSF1010 и pBR322, характеризующейся высокой стабильностью в клетках E.coli, рестриктазами Bam H 1 и Pst I с последующей обработкой полинуклеотидлигазой. Смесью после лиги- рования трансформировали клетки бес- плазмидного варианта штамма ВНИИ-генетика ТДГ-6, нуждающегося в треонине, и на минимальном агаре (среда Мд), лишенном треонина, но содержащем стрептомицин (100 мкг/мл), отбирали колонии трансформантов, утративших устойчивость к пенициллину. Из клеток одного такого трансформанта выделена плазмида pViC40 с молекулярной массой 9,7 МД, сообщающая устойчивость к стрептомицину, но не к пенициллину, и несущая фрагмент плазмиды pYN7, детерминирующий ген тре- онинового биосинтеза у E;coli.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-3996 и имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфологичес кие признаки. Грамотрицательные слабо подвижные палочки с закругленными концами, размер 1,5 - 2 мкм в длину.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37°С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агар-Луриа. Через 24 ч роста при 37°С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная минимальная среда Адамса. Через 40 - 48 ч роста при 37°С образует колонии диаметром 0,5 - 1,5 мм. серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью.

Рост в мясо-пептонном бульоне. Удельная скорость роста при 37°С 1,3 . После 24 ч роста происходит сильное равномерное помутнение, имеется характерный запах.

Физиолого-биологические признаки.

Отношение к источникам углерода: хорошо растет на сахарозе, глюкозе, фруктозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине, манните с образованием кислоты и газа.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммония, солей азотной кислоты, а также азот некоторых органических соединений.

Желатину не разжижает. Рост на молоке хороший с коагуляцией молока.

Индол не образует.

Устойчив к стрептомицину, L-треонину и L-гомосерину,

Стимулятором роста является L-изо- лейцин. При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует.

Факультативный анаэроб.

Растет на мясо-пептонном бульоне при 37°С и ниже. Оптимальная температура 37 - 38°С.

Растет на жидких средах, имеющих рН от 6 до 8. Оптимальное значение рН 7,0.

Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плазмиду pVIC 40 (молекулярная масса 9.7 МД), обеспечивающую устойчивость к стрептомицину и несущую гены треонинового оперона.

Стабильность плазмиды. Штамм E.coli ВКПМ В-3996 характеризуется повышенной способностью к сохранению плазмиды при росте без селективного давления, направленного на поддержание плазмиды.

Оценку стабильности признаков штамма, определяемого плазмидой, проводили у предлагаемого (плазмида pVIC 40) и известного (плазмида pYN 7) штаммов. Клетки обоих штаммов выращивали в присутствии соответствующего антибиотика до ранней стационарной фазы и засевали среду Лурма, лишенную антибиотиков, с исходным титром 5. После 48 ч культивирования полученными клетками вновь засевали такую же среду до исходного титра 50 и вновь инкубировали 48 ч. Каждый пассаж соответствовал 20 генерациям. После указанных пассажей клетки высевали на агаре Луриа и выросшие колонии проверяли на устойчм- вость к стрептомицину и пенициллину (табл.1).

Из данных табл.1 видно, что плазмида pVIG 40 стабильно сохраняется в клетках нового продуцента в неселективных услови- ях. В этих же условиях клетки известного штамма быстро утрачивают плазмиду.

Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществля- ют следующим образом. Культуру штамма E.coll ВКПМ В-3996 выращивают на агари- зованной среде Адамса со стрептомицином и суспензией клеток, выращенных таким же образом, засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Эти среды содержат источник углерода, азота, необходимые минеральные соли, а также питательную добавку в виде гидролизатов белковых субстратов (присутствие этой добавки в фер- ментационной среде не обязательно). Выращивание посевного материала ведут в условиях рН-статирования при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 - 38°С с непрерывным аэрированием и перемешиванием. Приготовлен- ный таким образом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют для засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, а также питательную до- бавку в виде гидролизатов белковых субстратов (при низких дозах засева указанная добавка позволяет сократить продолжительность ферментации, при высоких дозах засева присутствие ее не обязатель- но).

Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системой рН-статиро- вания, при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 38°С с непрерывным аэрированием и пере- мешиванием. В качестве рН-статирующего агента применяют либо аммиачную воду, либо сбалансированную по углероду и азоту сахаро-аммиачную подпитку. Продолжительность ферментации зависит от дозы засева и степени обогащения ферментационной среды ростовыми факторами и может составлять 24 - 60 ч. К концу ферментации накапливается 70 - 85 г/л L-треонина. Удельный расход источника углерода на синтез 1 г L-треонина составляет 2 - 2,3 г. Накопление аминоацетона Б культуралыюй жидкости отсутствует.

Пример 1,Купьтуры штаммов ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 параллельно выращивают на агаризовачной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2%) м антибиотики (500 ад/мл пенициллина для известного штамма и 100 мкг/мл стрептомицина для предлагаемого штамма) Клетки, выращенные в течение 2 сут, суспендируют в физиологическом растворе и 10 мл суспензии с титром 10 исполкзуют для засева 500 мл посевной среды следующего состава, %: сахароза 4; аммоний сернокислый 0,5; калий фосфорнокислый 2-замещенный 0,2; магний сернокислый 7-водный 0,04; железо (II) сернокислое 7-водное 0,002; марганец (II) сернокислый 5-водный 0,002; автолизат дрожжей 0,2; вода остальное.

Посевной материал выращивают в течение 20 ч в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании (0,5 л/мин) и перемешивании со скоростью 1000 об/мин при 37°С. Значение рН автоматически поддерживают в пределах 6,9 + 0.2 аммиачной водой. Выращенным посевным материалом с титром 7 - 8-Ю9 в количестве 50 мл засевают ферментационные среды объемом 500 мл. Состав ферментационной среды такой же, как и состав посевной, но концентрация сахарозы 3% и дополнительно внесен хлористый натрий (0,06%).

Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании 0,5 л/мин воздуха и перемешивании со скоростью 1200 об/мин и при температуре культивирования 37°С. Значение рН поддерживают в пределах 6,9 +Ю,2 путем автоматической подачи сахаро-ам- миачной подпитки, представляющей собой смесь 70%-ного раствора сахарозы с 25%- ной аммиачной водой в соотношении 3,6:1 по объему. Ферментацию проводят в течение 36ч. Результаты проведенного процесса показаны в табл.2.

П р и м е р 2. Культуры штаммов Е. coli ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 выращивают аналогично примеру 1, но полученную клеточную суспензию разводят физиологическим раствором до титра 10 и 1 мл такой суспензии используют для засева 500 мл ферментационной среды, отличающейся от указанной в примере 1 ферментационной среды повышенным до 0.5% содержанием

автолизата дрожжей (моделируется вариант засева производственного ферментера объемом 1000 м3 суспензией клеток, смытых с 1 косяка). Ферментацию проводят в течение 50 ч в условиях, аналогичных указанным в примере 1. Результаты проведенного процесса показаны в табл.3.

ПримерЗ. Культуру штамма ВКПМ В-3996 выращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином, как показано в примере 1, затем клетки суспендируют в физрастворе и полученной суспензией засевают посевную среду, аналогичную приведенной в примере 1, но отличающуюся заменой сахарозы на мелассу (4% по сахару). Выращивание посевного материала ведут по примеру 1. Через 18 ч готовым посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую 4% мелассы (2 % по сахару), 1,5% сернокислого аммония и минеральные соли, перечисленные в ферментационной среде примера 1. Для рН-статирования в ходе ферментации используют мелассно-аммиачную подпитку, представляющую собой смесь 30%-ного по сахару раствора мелассы с 25%-ной аммиачной водой в соотношении 12:1 по объему.

Ферментацию проводят в течение 36 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливается треонин в конДоля клеток известного и предлагаемого штаммов, утративших плазмиды при пассировании в среде Луриа

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах без антибиотиков в лабораторных ферментерах

центрации 44 г/л. Доля клеток, утративших плазмиду, менее 1%.

Сравнение предлагаемого и известного штаммов в условиях небольшого числа клеточных генераций без антибиотика (пример 1) показывает одинаковую продуктивность штаммов (82 - 85 г/л).

Преимущества предлагаемого штамма проявляются в условиях большого числа

клеточных генераций (пример 2), т.е. в условиях, моделирующих производственные в отсутствие антибиотика. В этом случае уровень накопления треонина предлагаемым штаммом в 1,5 раза выше, чем у известного

штамма (79 г/л треонина против 53 г/л). Это объясняется тем, что значительная доля клеток известного штамма на обогащенных средах без антибиотиков утрачивает плазмиду, в то время как потери плазмиды у

предлагаемого штамма в этих условиях не отмечены.

Таким образом, предлагаемый штамм позволяет в производственных условиях увеличивать выход L-треонина и упростить

процесс за счет полного исключения применения антибиотика в процессе выращивания посевного материала.

Формула изобретения Штамм бактерий Escherichia coll ВКПМ

В-3996-продуцент L-треонина.

Таблица 1

Таблица 2

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов

при культивировании на средах без антибиотиков в условиях, моделирующих по

числу генераций производственные условия

Редактор М.Петрова

Техред М.Моргентал

Заказ 4130ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Таблица 3

Корректор v М.Демчик