Изобретение относится к биотехнологии. Описана фармацевтическая композиция, обладающая тимидинкиназной активностью, содержащая в качестве активного начала выделенный фермент растительную тимидинкиназу или полинуклеотид, кодирующий ее. Раскрыт способ сенсибилизации клетки к пролекарству. Предложен способ фосфорилирования нуклеозидного аналога-монофосфата. Раскрыт способ ингибирования патогенного агента в организме теплокровного животного. Описан способ контроля или модификации роста растения. Предложено средство, включающее нуклеозидный аналог и тимидинкиназу, или ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, или вектор, включающий указанный ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении рака. Описаны новые тимидинкиназы, полученные из сосны или резушки Таля. Данное изобретение позволяет получить новые растительные тимидинкиназы, полезные для превращения нуклеозидных аналогов в токсичные вещества и полезные для превращения нуклеозидных аналогов в монофосфаты и монофосфатов нуклеозидных аналогов в соответствующие дифосфаты. 11 н. и 22 з.п. ф-лы, 9 табл., 2 ил.
1. Фармацевтическая композиция, обладающая тимидинкиназной активностью, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и выделенный полинуклеотид; вектор, включающий указанный полинуклеотид и промотор; линию упаковывающих клеток, способную продуцировать инфекционный вирион, включающий указанный вектор; или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор; причем указанный выделенный полинуклеотид при определении его полной последовательности имеет по меньшей мере 75% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12, или способен гибридизоваться в условиях средней жесткости с указанными последовательностями или их комплементарной цепью.2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный полинуклеотид включает в себя полинуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.3. Фармацевтическая композиция, обладающая тимидинкиназной активностью, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и выделенный фермент растительную тимидинкиназу, где указанный выделенный фермент тимидинкиназа при определении ее полной последовательности имеет по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.4. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанная тимидинкиназа включает в себя один или более чем один из следующих мотивов/областей:
Val lle Gly lle Asp Glu Ala Gln Phe Phe (Мотив I)
Val Ala Gly Leu Asp Gly (Мотив II)
Tyr Met Pro Val Cys Arg (Мотив III)
Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (Lid-область), где A1 выбран из Thr и Val, A2 выбран из Thr и Lys, A3 выбран из Ala и Ser, и А4 выбран из Leu и Val.
5. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанная тимидинкиназа включает в себя все консервативные остатки, идентифицированные в Таблице 1.6. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанная тимидинкиназа включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.7. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанная тимидинкиназа имеет С-концевую делецию примерно 1-60 аминокислотных остатков, предпочтительно 1-50 аминокислотных остатков, более предпочтительно 1-40 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно 1-30 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно 1-26 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно 1-24 аминокислотных остатка.8. Фармацевтическая композиция по п.7, где указанный фермент тимидинкиназа получен из томата и имеет С-концевую делецию 26 аминокислотных остатков (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5).9. Фармацевтическая композиция по п.7, где указанный фермент тимидинкиназа получен из резушки Таля и имеет С-концевую делецию 24 аминокислотных остатка (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11).10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из сосны и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2.11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из томата и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 4.12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из риса и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 7.13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 9.14. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 11.15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 13.16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, где указанная тимидинкиназа по меньшей мере в три (3) раза уменьшает летальную дозу (ЛД100) по меньшей мере одного нуклеозидного аналога при сравнении с действием тимидинкиназы вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK).17. Способ сенсибилизации клетки к пролекарству, включающий стадии(1) трансфекции или трансдукции указанной клетки полинуклеотидной последовательностью, кодирующей фермент растительную тимидинкиназу, который способствует превращению указанного пролекарства в (цитотоксическое) лекарство, и
(2) доставки указанного пролекарства в указанную клетку;
где указанная клетка более чувствительна к указанному (цитотоксическому) лекарству, чем к указанному пролекарству, и где указанная полинуклеотидная последовательность при определении ее полной последовательности имеет по меньшей мере 75% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.
18. Способ по п.17, где пролекарство представляет собой нуклеозидный аналог.19. Способ по п.18, где нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ (3'-азидо-3'-дезокситимидин).20. Способ ингибирования патогенного агента в организме теплокровного животного, включающий введение указанному животному полинуклеотида или вектора, содержащего указанный полинуклеотид, который при определении его полной последовательности имеет по меньшей мере 75% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.21. Способ по п.20, где указанную полинуклеотидную последовательность или указанный вектор вводят in vivo.22. Способ по любому из пп.20-21, где указанный патогенный агент представляет собой вирус, бактерию или паразита.23. Способ по любому из пп.20-21, где указанный патогенный агент представляет собой опухолевую клетку.24. Способ по любому из пп.20-21, где указанный патогенный агент представляет собой аутореактивную иммунную клетку.25. Способ по п.20, дополнительно включающий стадию введения указанному теплокровному животному нуклеозидного аналога.26. Способ по п.25, где указанный нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ (3'-азидо-3'-дезокситимидин).27. Применение фермента растительной тимидинкиназы, имеющей при определении ее полной последовательности по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, для фосфорилирования нуклеозидного аналога-монофосфата.28. Способ фосфорилирования нуклеозидного аналога-монофосфата, включающий стадии, на которых1) нуклеозидный аналог-монофосфат подвергают воздействию фермента растительной тимидинкиназы, имеющей при определении ее полной последовательности по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13; и
2) выделяют нуклеозидный аналог-дифосфат.
29. Способ контроля или модификации роста растения, включающего в себя растительные клетки, содержащие полинуклеотид, кодирующий фермент растительную тимидинкиназу, имеющую при определении ее полной последовательности по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, включающий стадию, на которой растение или растительную клетку подвергают воздействию нуклеозида или нуклеозидного аналога.30. Средство, включающее нуклеозидный аналог и тимидинкиназу, имеющую при определении ее полной последовательности по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, или ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, или вектор, включающий указанный ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении рака.31. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из сосны, имеющий по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.32. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из томата, имеющий по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 4 или 5.33. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из Arabidopsis thaliana, имеющий по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 или 11.Приоритет по пунктам и признакам:
23.05.2002 пп.1, 2, 20-26 в части последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6; пп.3-15, 27, 28 в части последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; пп.31, 33;07.02.2003 пп.1, 2, 20-26 в части последовательности SEQ ID NO: 8; пп.17-19 в части последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6; пп.16, 29 в части последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7;21.05.2003 пп.1, 2, 20-26 в части последовательностей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; пп.3-16, 27, 28, 29 в части последовательностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13; пп.17-19 в части последовательностей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12; пп.30, 32.
