СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и биологии в области генетики человека и может быть использовано для точного определения уровня генетической стабильности хромосом.

В качестве ближайшего аналога заявленного способа можно считать (Амелина И.В. Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей города Курска, автореф. дисс. канд. биол. наук, г.Саранск, 2006).

Отличием заявленного изобретения от известного заключается в том, что дополнительно определяют соотношение показателей ядрышкообразующих районов хромосом (ЯОР) D ЯОР/10 AgЯОР, G ЯОР/10 AgЯОР, D ЯОР/G ЯОР, обрабатывают полученные результаты с помощью системного многофакторного анализа и по значению общего потенциала активности хромосом определяют уровень активности ЯОР: резко повышенный, нормальный, сниженный или резко сниженный.

Техническим результатом является повышение точности определения уровня активности ядрышкообразующих районов хромосом.

Целью изобретения является повышение точности определения уровня активности ЯОР хромосом в клетках.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования активности ЯОР хромосом в клетках из локтевой вены обследуемого берется кровь для культивирования лимфоцитов и приготовления препаратов метафазных хромосом с последующим анализом хромосомных препаратов для изучения активности ЯОР хромосом в клетках с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом.

Полученное значение является общим потенциалом активности ЯОР хромосом в клетках обследуемого.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно определение уровня активности ЯОР хромосом у обследуемых с последующим вычислением общего потенциала активности ЯОР хромосом, по значению которого можно судить об уровне активности белоксинтезирующего аппарата у того или иного индивида.

Постановка культуры лимфоцитов и приготовление препаратов метафазных хромосом.

Используется гепарин фирмы "Riсter" (Венгрия), фитогемагглютинин фирмы "Difko-P" (США), среда 199, сыворотка крупного рогатого скота, колхицин, хлорид калия, метанол, ледяная уксусная кислота, серная кислота концентрированная, дихромат калия, нитрат серебра, раствор желатина, цитрат натрия, хлорид натрия, гидроортофосфат натрия, дигидроортофосфат калия, краситель Гимза фирмы "Merck" (США). Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводили по общепринятой методике [Методические рекомендации / ЦИУВ. - М.: Медицина, 1989. - 113 с. Бочков Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами / Н.П.Бочков, B.C.Журков, Н.П.Кулешов // Докл. АН СССР. - 1974. - Т. 218. - №2. - С.463-465]. Кровь забирали из локтевой вены и заполняли ею стерильные пенициллиновые флаконы, в которых находился раствор гепарина (0,1 мл на 1 мл крови). Гепарин использовали в разведении бидистилированной водой 1:20. Кровь культивировали в стерильных пенициллиновых флаконах с питательной средой при 37°С в течение 72 часов. Питательная среда состояла из среды 199 (6,0 мл) и сыворотки крупного рогатого скота (1,5 мл). В качестве стимулятора пролиферативной активности использовали фитогемагглютинин. За 2 часа до начала фиксации в культуру лимфоцитов добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Фиксацию проводили на 72 часу культивирования. После центрифугирования и отсасывания надосадочной жидкости клетки инкубировали с предварительно подогретым до 37°С 0,75 М раствором хлорида калия в течение 20 минут при 37°С. После гипотонизации проводили центрифугирование и отбор надосадочной жидкости. Клетки фиксировали в фиксаторе Карнуа (метанол + уксусная кислота) в соотношении 3:1 в течение трех и более часов. За это время производили три смены фиксатора. После полного обесцвечивания суспензии клеток, ее раскапывали на обезжиренные предметные стекла, смоченные дистиллированной холодной водой. Препараты высушивали на воздухе и шифровали.

Посадку, культивирование лимфоцитов крови и приготовление препаратов проводили строго стандартно во всех случаях. После приготовления препараты выдерживали при комнатной температуре для окраски нитратом серебра 7-14 дней, а для рутинного окрашивания для изучения уровня хромосомных аберраций - 2-3 дня.

Окраска хромосомных препаратов раствором нитрата серебра - Ag-окрашивание.

С целью выявления транскрипционно активных ЯОР хромосом использовали метод, предложенный Howell W.M. [Howell W.M. Chromosome core structure revealed by silver staining // Chromosome. - 1979. - Vol.73. - P.61-66]. На препараты метафазных хромосом наносили по 50 мкл бидистиллированной воды, 150 мкл 50% раствора нитрата серебра и 100 мкл 2% раствора желатина. Тщательно перемешивали и помещали в термостат на 8-10 мин при температуре 56,7 С°. После завершения окраски смывали раствор серебра под проточной водой и высушивали на воздухе. Препараты помещали в нагретый до 56,7 С° раствор 2×SSC (0,03 М раствор Na₃C₆H₅O₇·5,5 Н₂O и 0,3 М раствор NaCl в соотношении 1:1) и выдерживали при 56,7 С° в течение 10 мин. Обезвоживали в 70% и 96% этиловом спитре. Препараты высушивали на воздухе и окрашивали раствором красителя Романовского-Гимзы (250 мкл красителя растворяли в 5 мл буферного раствора (хлорид натрия + цитрат натрия).

Оценка хромосомных препаратов на количество активных ЯОР проводилась следующим образом.

Количество активных ЯОР хромосом определяли с помощью светового микроскопа "Биолам" (увеличение окуляра 10, увеличение объектива 90). Сумма размеров 10 AgЯОР (ЯОР 10 акроцентрических хромосом) характеризует количество транскрипционно активных ЯОР в клетке и служит основой для сравнения индивидуальных геномов по этому признаку (Ag-полиморфизм).

Число окрашенных ЯОР подсчитывали в каждой анализируемой метафазной пластинке. Если данная акроцентрическая хромосома содержала в коротком плече зерна серебра, то такой ЯОР оценивался как транскрипционно активный, если он был неокрашен, то расценивался как неактивный.

Для исключения возможности недоокраски ЯОР серебром для анализа отбирали метафазные пластинки с полной (завершенной) окраской. На хромосомах, окрашенных серебром не полностью, в ЯОР появляется гомогенное, слабо окрашенное пятно вместо хорошо контурированных спутничных нитей, в то время как проксимальная часть короткого плеча и длинные плечи хромосом оставались неизменными. В полностью окрашенных серебром ЯОР таких слабо окрашенных пятен нет.

Для оценки окрашенных серебром хромосом всех просматриваемых метафазных пластинок использовали следующие показатели: D ЯОР (ЯОР D-акроцентрических хромосом), G ЯОР (ЯОР G-акроцентрических хромосом), 10AgЯОР, D ЯОР/10 AgЯОР, G ЯОР/10 AgЯОР, D ЯОР/G ЯОР характеризуют транскрипционную активность 10 AgЯОР данного индивида.

Оценка транскрипционной активности ЯОР акроцентрических хромосом проводится у каждого индивида по приведенным выше показателям в 200 метафазных пластинках с расчетом среднего арифметического каждого показателя. Нормативные показатели получали на группе здоровых лиц численностью не менее 20 человек с расчетом по каждому показателю среднего арифметического значения.

Для определения весомости всех полученных параметров и вычисления общего потенциала активности ядрышкообразующих районов хромосом (ОПАЯОР) обследованных применяется системный многофакторный анализ, позволяющий перевести исследуемые многомерные количественные характеристики 10 AgЯОР в сопоставимые относительные величины (Углова М.В., Углов Б.А., Архипов В.В., Горшкова Т.В., Петунина Н.А., Оль Т.Д., Прохуровская М.А., Шубин С.И. Применение методов морфометрии и статистического анализа в морфологических исследованиях. Куйбышев, 1982. - 47 с.). Метод дает возможность выразить все параметры 10 AgЯОР хромосом единым интегральным показателем. Расчет производился по формулам:

- исследуемый параметр, - нормативный параметр, - относительная разность.

Pi - весовой коэффициент (коэффициент влияния), а - постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), σ_j - среднеквадратическое отклонение значения в относительных единицах.

S_i ² - дисперсия исследуемого параметра X_i, n_i - количество наблюдений при определении X_i, S₀ ² - дисперсия нормативного параметра Х₀, n₀ - количество наблюдений при определении Х₀.

- величина, интегрально характеризующая исследуемый процесс в заданный срок (в относительных единицах).

Обработкой полученных результатов системным многофакторным анализом с определением общего потенциала активности ЯОР хромосом позволяет адекватно оценивать уровень образования белковой основы для рибосом у обследуемых. Так, при значении от 0,051 до 0,070 уровень активности ЯОР хромосом можно оценить как нормальный и не требующий никаких корректирующих вмешательств, при значении от 0,040 до 0,050 активность ЯОР хромосом несколько снижена, а при от 0,071 до 0,080 - повышена и требует динамического наблюдения и коррекции образа жизни; при уровне от 0,039 и ниже активность ЯОР резко снижена, а при 0,081 и выше - резко повышена, что угрожает по развитию различных заболеваний и требует безотлагательного назначения корректирующего лечения.

Внедрение данного способа оценки потенциала активности ЯОР хромосом у людей в практику лечебных учреждений, центров планирования семьи и медикогенетических консультаций позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Своевременное и адекватное назначение корректирующего подхода для нормализации в каждом конкретном случае способно оптимизировать генетические процессы и обеспечить получение более здорового потомства от женщин, собирающихся забеременеть.

Пример 1. Жительница г. Курска, 34 года, практически здорова, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=10,2 у.е., G ЯОР=8,3 у.е., 10AgЯОР=18,5 у.е., D ЯОР/10 AgЯОР=0,55, G ЯОР/10 AgOP=0,44, D ЯОР/G ЯОР=1,23 и расчетом общего потенциала активности ЯОР хромосом.

У больной было найдено нормативное значение и даны рекомендации и дальше вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Житель Курской области, 43 года, страдающий язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в течение 8 лет, обследован во время профилактического осмотра по месту жительства. У больного была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=9,9 у.е., G ЯОР=5,4 у.е., 10AgЯOP=15,3 y.e., D ЯОР/10AgЯОР=0,65, G ЯОР/10AgЯОР=0,35, D ЯОР/G ЯОР=1,83 и расчетом общего потенциала активности ЯОР хромосом

Больному была рекомендована диета, богатая витамином В₅, морепродуктами и прием антиоксиданта - токоферола ацетата 0,2 г по 1 капсуле 12 раз в день на 2 месяца, что позволило нормализовать =0,061 через 4 месяца.

Пример 3. Жительница г. Курска, 68 лет, прооперирована ¹/₂ года назад по поводу рака желудка II ст., обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=15,8 у.е., G ЯОР=9,6 у.е., 10AgЯОР=25,4 у.е., D ЯОР/10 AgЯОР=0,62, G ЯОР/10 AgЯОР=0,37, D ЯОР/G ЯОР=1,64 и расчетом общего потенциала активности ЯОР хромосом, составившего =0,086.

Больной была рекомендована диета, богатая молочными продуктами. Через 2 мес. у больной нормализовались оцениваемые показатели с нормализацией =0,063. Больной было предложено соблюдать в дальнейшем данные ей рекомендации.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для точного определения уровня генетической стабильности хромосом. Для осуществления способа из локтевой вены обследуемого берут кровь для культивирования лимфоцитов и приготовления препаратов метафазных хромосом с последующим анализом хромосомных препаратов для изучения активности ЯОР в клетках с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом. Рассчитывают значение общего потенциала активности хромосом - по значению которого определяют уровень образования белковой основы для рибосом у обследуемых и соответственно делают вывод о наличии или отсутствии отклонения от нормы и необходимости корректирующих мероприятий. Использование изобретения позволяет повысить точность определения уровня активности ЯОР в клетках, что в свою очередь дает возможность своевременного и адекватного назначения корректирующего подхода для нормализации в каждом конкретном случае.

Способ оценки активности ядрышкообразующих районов хромосом в клетках путем взятия крови, постановки культуры лимфоцитов, приготовления препаратов метафазных хромосом, окраски хромосомных препаратов с нитратом серебра и проведения анализа хромосомных препаратов в метафазных пластинках на предмет уровня активности ЯОР по показателям D ЯОР, G ЯОР, 10 AgЯОР, отличающийся тем, что анализ хромосомных препаратов проводят в 200 метафазных пластинках и дополнительно определяют соотношение показателей D ЯОР/10 AgЯОР, G ЯОР/10 AgЯОР, D ЯОР/G ЯОР, при этом проводят расчет среднего арифметического каждого показателя обработкой результатов исследования с помощью системного многофакторного анализа, переводящего каждый из определяемых показателей в сопоставимые относительные величины, на основании которых с учетом весового коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратического отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего потенциала активности ЯОР хромосом - по значению которого определяют уровень образования белковой основы для рибосом у обследуемых: при значении 0,051 до 0,070 уровень активности ЯОР хромосом можно оценить как нормальный и не требующий никаких корректирующих вмешательств, при значении 0,040 до 0,50 активность ЯОР хромосом несколько снижена, а при от 0,071 до 0,080 повышена и требует динамического наблюдения и коррекции образа жизни; при уровне от 0,039 и ниже - активность ЯОР хромосом резко снижена, а при 0,081 и выше - резко повышена, что угрожает по развитию различных заболеваний и требует безотлагательного назначения корректирующего лечения.