СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЛОМКОСТИ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и биологии в области генетики и может быть использовано для точного определения уровня ломкости хромосом человека.

Известен способ оценки уровня поломок хромосом (А.А.Прокофьева-Бельговская, Н.П.Бочков, К.Н.Гринбер и др. Основы цитогенетики человека. М.: Медицина. 1969. - 544 с.).

Однако в данном способе не предусматривается применение такого комплекса исследуемых параметров хромосом и такой статистической обработки всех полученных результатов с вычислением индекса генетической поврежденности (ИГП).

Целью изобретения является повышение точности определения уровня генетической поврежденности хромосом человека.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования генетической поврежденности хромосом у людей в течение трех дней подряд троекратно из локтевой вены берется кровь для культивирования лимфоцитов и приготовления препаратов метафазных хромосом с последующим анализом хромосомных препаратов для изучения уровня хромосомных аберраций с последующим вычислением ИГП.

Полученное значение является общим уровнем ломкости хромосом у каждого конкретного человека.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени, методов возможно определение общего уровня поврежденности хромосом у каждого конкретного человека с последующим вычислением ИГП, по значению которого можно точно судить об уровне поврежденности наследственного материала у того или иного индивида.

Способ осуществляется следующим образом. Постановка культуры лимфоцитов и приготовление препаратов метафазных хромосом проводится по описанной ниже схеме.

Используется гепарин фирмы "Ricter" (Венгрия), фитогемагглютинин фирмы "Difko-P" (США), среда 199, сыворотка крупного рогатого скота, колхицин, хлорид калия, метанол, ледяная уксусная кислота, серная кислота концентрированная, дихромат калия, нитрат серебра, раствор желатина, цитрат натрия, хлорид натрия, гидроортофосфат натрия, дигидроортофосфат калия, краситель Гимза фирмы "Merck" (США). Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводили по общепринятой методике [Методические рекомендации. / ЦИУВ. - М.: Медицина, 1989. - 113 с.; Бочков Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами. / Н.П.Бочков, B.C.Журков, Н.П.Кулешов. // Докл. АН СССР. - 1974. - Т.218. - №2. - С.463-465]. Кровь забирали из локтевой вены (10 мл) и заполняли ею стерильные пенициллиновые флаконы, в которых находился раствор гепарина (0,1 мл на 1 мл крови). Гепарин использовали в разведении бидистилированной водой 1:20. Кровь культивировали в стерильных пенициллиновых флаконах с питательной средой при 37°С в течение 72 часов. Питательная среда состояла из среды 199 (6,0 мл) и сыворотки крупного рогатого скота (1,5 мл). В качестве стимулятора пролиферативной активности использовали фитогемагглютинин. За 2 часа до начала фиксации в культуру лимфоцитов добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Фиксацию проводили на 72 часу культивирования. После центрифугирования и отсасывания надосадочной жидкости клетки инкубировали с предварительно подогретым до 37°С 0,75 М раствором хлорида калия в течение 20 минут при 37°С. После гипотонизации проводили центрифугирование и отбор надосадочной жидкости. Клетки фиксировали в фиксаторе Карнуа (метанол + уксусная кислота) в соотношении 3:1 в течение трех и более часов. За это время производили три смены фиксатора. После полного обесцвечивания суспензии клеток ее раскапывали на обезжиренные предметные стекла, смоченные дистиллированной холодной водой. Препараты высушивали на воздухе и шифровали.

Посадку, культивирование лимфоцитов крови и приготовление препаратов проводили строго стандартно во всех случаях. После приготовления препараты выдерживали при комнатной температуре для окраски нитратом серебра 7-14 дней, а для рутинного окрашивания для изучения уровня хромосомных аберраций - 2-3 дня.

Для проведения исследований на мутагенез хромосомные препараты окрашивали с помощью красителя Романовского-Гимзы на воде в соотношении 1:50, без предварительной обработки. Время окрашивания в наших исследованиях 10 мин. Метафазные пластинки должны быть хорошо окрашены, без наложений друг на друга хромосом. На метафазных пластинках не должно быть «подложки» - остатков ядерной оболочки, что говорит о недостаточном времени культивирования.

Готовые препараты изучали под микроскопом, при этом у одного человека в нашем исследовании наблюдали по 100 метафазных пластинок три дня подряд. Результаты заносили в протокол, где указывался тип повреждения хромосомы, ее группа и координаты метафазной пластинки. По всем оцениваемым показателям уровня хромосомных аберраций (количество клеток с хромосомными аберрациями (ККХА), количество хромосомных аберраций (КХА) (на 100 кл.), общее количество фрагментов хромосом (ОКФХ), количество обменов (КО), количество одиночных фрагментов (КОФ), количество парных фрагментов (КПФ), количество хромосомных обменов (КХО), количество хроматидных обменов (КХТО)) у одного человека три дня подряд вычисляли среднеарифметические значения (М) с последующим расчетом индекса генетической поврежденности.

Расчет данного индекса производится по формуле:

В норме ИПГ составляет от 3,30 до 3,36. В случае, если его значения составляют от 3,37 до 3,40, то человек входит в группу риска по развитию нестабильности хромосом и возникновению различных заболеваний. Необходимо ежемесячное обследование этих пациентов на предмет уровня хромосомных аббераций с нормализацией образа жизни. При значении ИГП 3,41 и выше у больных имеет место нестабильность генетического аппарата, требующая проведения антиоксидантной терапии и применения средств, усиливающих репарацию ДНК (витамин B₅).

Внедрение данного способа оценки ИГП хромосом у больных в практику лечебных учреждений, центров планирования семьи и медикогенетических консультаций позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Своевременное и адекватное назначение корректирующего подхода для оптимизации ИГП в каждом конкретном случае способно улучшить состояние генетического аппарата и обеспечить получение более здорового потомства от женщин, собирающихся забеременеть.

Пример 1. Жительница К. г.Курска 32 года, практически здорова, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У женщины троекратно в течение трех дней была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня хромосомных аберраций и расчетом ИГП.

У обследуемой были найдены следующие средние значения оцениваемых показателей: количество клеток с хромосомными аберрациями 1,08, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,10, общее количество фрагментов хромосом 1,22, количество обменов 0,110, количество одиночных фрагментов 0,56, количество парных фрагментов 0,44, количество хромосомных обменов 0,070, количество хроматидных обменов 0,059. На основе полученных результатов был рассчитан ИГП=3,30.

В качестве нормативных значений взяты результаты обследования тщательно отобранных здоровых людей (n=28) (количество клеток с хромосомными аберрациями 1,07±0,08, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,11±0,09, общее количество фрагментов хромосом 1,22±0,08, количество обменов 0,12±0,03, количество одиночных фрагментов 0,56±0,06, количество парных фрагментов 0,43±0,05, количество хромосомных обменов 0,07±0,02, количество хроматидных обменов 0,05±0,03) при возможности колебаний ИГП от 3,30 до 3,36, составляющем в среднем 3,33. В целом уровень ломкости хромосом у обследуемой был оценен как нормальный (ИГП=3,30).

Обследуемой было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Больная М. г.Курска 44 года, страдающая язвенной болезнью желудка, обследована во время лечения в стационаре по поводу обострения язвенной болезни. У женщины была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня хромосомных аберраций и расчетом ИГП.

У обследуемой были найдены следующие средние значения оцениваемых показателей: количество клеток с хромосомными аберрациями 1,09, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,14, общее количество фрагментов хромосом 1,26, количество обменов 0,114, количество одиночных фрагментов 0,57, количество парных фрагментов 0,46, количество хромосомных обменов 0,087, количество хроматидных обменов 0,049. На основе полученных результатов был рассчитан ИГП=3,38.

В качестве нормативных значений взяты результаты обследования тщательно отобранных здоровых людей (n=28) (количество клеток с хромосомными аберрациями 1,07±0,08, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,11±0,09, общее количество фрагментов хромосом 1,22±0,08, количество обменов 0,12±0,03, количество одиночных фрагментов 0,56±0,06, количество парных фрагментов 0,43±0,05, количество хромосомных обменов 0,07±0,02, количество хроматидных обменов 0,05±0,03) с колебаниями ИГП от 3,30 до 3,36 в среднем составляющего 3,33. Величина ИГП у обследуемой, составляющая 3,38, указывала на повышение ломкости хромосом у обследуемой.

Обследуемой была рекомендована диета, богатая витаминами и молочными продуктами.

Пример 3. Житель К. Курской области 56 лет, страдающий раком желудка, обследован во время лечения в Областном онкологическом диспансере. У больного была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня хромосомных аберраций и расчетом ИГП.

У больного были найдены следующие средние значения оцениваемых показателей: количество клеток с хромосомными аберрациями 1,07, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,14, общее количество фрагментов хромосом 1,28, количество обменов 0,13, количество одиночных фрагментов 0,57, количество парных фрагментов 0,44, количество хромосомных обменов 0,06, количество хроматидных обменов 0,048. Полученные результаты позволили рассчитать ИГП=3,43.

В качестве нормативных значений взяты результаты обследования тщательно отобранных здоровых людей (n=28) (количество клеток с хромосомными аберрациями 1,07±0,08, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,11±0,09, общее количество фрагментов хромосом 1,22±0,08, количество обменов 0,12±0,03, количество одиночных фрагментов 0,56±0,06, количество парных фрагментов 0,43±0,05, количество хромосомных обменов 0,07±0,02, количество хроматидных обменов 0,05±0,03). Величина ИГП (3,43) у обследованного указывала на нестабильность хромосом больного и необходимость безотлагательного применения диеты, богатой витаминами, морепродуктами, и поливитаминных препаратов в течение полугода.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к генетике. Предложен способ определения уровня ломкости хромосом человека. У людей в течение трех дней подряд троекратно из локтевой вены берут кровь для культивирования лимфоцитов и приготовления препаратов метафазных хромосом с последующим анализом хромосомных препаратов, при этом изучают уровень хромосомных аберраций с последующим вычислением индекса генетической поврежденности (ИГП). Способ позволяет своевременно выявить повышенный уровень ломкости хромосом и назначить адекватный корректирующий подход для снижения ИГП в каждом конкретном случае.

Способ определения уровня ломкости хромосом человека, отличающийся тем, что после троекратного взятия крови в течение трех дней подряд, культивирования лимфоцитов, приготовления препаратов метафазных хромосом, окраски хромосомных препаратов с помощью красителя Романовского-Гимзы и проведения анализа хромосомных препаратов при наблюдении 100 метафазных пластинок у каждого обследуемого на предмет уровня хромосомных аберраций по показателям - количество клеток с хромосомными аберрациями, количество хромосомных аберраций (на 100 кл.), общее количество фрагментов хромосом, количество обменов, количество одиночных фрагментов, количество парных фрагментов, количество хромосомных обменов, количество хроматидных обменов с вычислением средних арифметических значений всех оцениваемых показателей и определения величины индекса генетической поврежденности по формуле:

где ИГП - индекс генетической поврежденности, М - среднеарифметическая величина оцениваемого показателя - количество клеток с хромосомными аберрациями (ККХА), количество хромосомных аберраций (КХА) (на 100 кл.), общее количество фрагментов хромосом (ОКФХ), количество обменов (КО), количество одиночных фрагментов (КОФ), количество парных фрагментов (КПФ), количество хромосомных обменов (КХО), количество хроматидных обменов (КХТО), по значению которого судят об уровне ломкости хромосом у обследуемого: при значении ИГП от 3,30 до 3,36 уровень ломкости хромосом можно оценить как нормальный; при значении ИГП от 3,37 до 3,40 ломкости хромосом повышен; при уровне ИГП 3,41 и выше регистрируется нестабильность генетического аппарата.