СПОСОБ ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ФОТОСИНТЕЗА ФОТОАВТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ, УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ И ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ КАМЕРА Российский патент 2009 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано в технологиях исследования окружающей среды, в частности в лимнологии и океанологии при изучении и оценке состояния водной среды для измерения концентрации водорослей и их фотосинтеза, а также в любой другой области науки, технике и охраны окружающей среды, где необходимо проводить непрерывный анализ водной среды с использованием флуориметров.

Известно, что при действии различных экологических факторов и антропогенных загрязнений на наземные и водные экосистемы в первую очередь изменяются концентрация и фотосинтетическая активность клеток фотосинтезирующих организмов. Их изменения приводят к изменениям во всех остальных звеньях экосистемы. В связи с этим функционирование фотосинтетического аппарата (ФСА) оказывается наиболее значимым для определения состояния растения. Так, регистрация фотосинтетических характеристик фитопланктона является способом оценки состояния водной среды в целом.

Принятая в настоящее время модель первичных реакций фотосинтеза включает две фотосистемы ФС1 и ФС2. ФС2 окисляет воду с выделением кислорода и протонов и восстанавливает первичный и вторичный хинонные акцепторы Qa и Qb. ФС1 переносит электрон от пула пластохинона (PQ) к конечному акцептору электрона CO₂.

Реакционный центр ФС2 (РЦ) состоит из специальной молекулы хлорофилла Р680, которая в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для хинонного акцептора Qa. Энергия кванта света, поглощенного в ФС2, может быть превращена в энергию разделенных зарядов Р680⁺Qa^-, которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза, либо потеряна путем излучения кванта флуоресценции или рассеяния в тепло. Эти три процесса характеризуются константами скорости K_ph, K_f и K_d соответственно.

Исходное состояние, в котором Р680 восстановлен, а Qa окислен, называется открытым. Состояние, образующееся сразу после разделения зарядов в первичной паре Р680⁺Qa^-, называется закрытым состоянием РЦ. В этом состоянии новая порция возбуждения не может быть использована таким центром до тех пор, пока он не вернется в исходное открытое состояние в результате восстановления Р680⁺ от вторичных доноров и окисления первичного акцептора вторичными акцепторами электрона.

При открытом состоянии РЦ эффективность использования энергии возбуждения в фотосинтезе высока, вероятность потери энергии минимальна, квантовый выход флуоресценции, равный отношению K_f/(K_ph+K_f+K_d), минимален и составляет около 2%. В случае постоянной интенсивности возбуждающего света, не вызывающей закрытия РЦ, интенсивность флуоресценции соответствует величине F₀. Низкий выход флуоресценции хлорофилла за счет использования энергии света в первичных реакциях фотосинтеза обусловлен фотохимическим тушением флуоресценции хлорофилла. При закрытых РЦ фотохимическое разделение зарядов становится невозможным, квантовый выход флуоресценции возрастает до K_f/(K_f+K_d), что соответствует значению интенсивности F_m и составляет около 5%. Разность между максимальным и минимальным значениями интенсивности флуоресценции (F_v=F_m-F₀ - переменная флуоресценция) пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых реакционных центрах ФС2. Отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции F_v/F_m (относительная переменная флуоресценция) равно эффективности использования энергии света РЦ, т.е. позволяет определить эффективность утилизации света в ходе фотосинтеза. Эта безразмерная энергетическая характеристика фотосинтеза, аналогичная коэффициенту полезного действия, является универсальной и не зависит от видовой специфики организма.

При воздействии возбуждающего света на растение, адаптированное к темноте, наблюдается изменение интенсивности флуоресценции хлорофилла во времени (характерная индукционная кривая флуоресценции), имеющее насколько фаз. Сначала интенсивность флуоресценции быстро возрастает до уровня, который соответствует квантовому выходу флуоресценции при открытых РЦ (F₀). Затем, при достаточно высокой интенсивности действующего света, выход флуоресценции может достигать F_m. Дальнейшие фазы индукции флуоресценции хлорофилла в конечном счете приводят к снижению выхода флуоресценции. Это явление обусловлено возрастанием фотохимического тушения при ускорении транспорта электронов и соответствующим уменьшением степени восстановленности хинонных акцепторов ФС2, а также развитием процессов нефотохимического тушения, которые обусловлены рядом процессов, связанных с образованием градиента протонов на фотосинтетической мембране.

Таким образом, измерение разных параметров флуоресценции хлорофилла дает возможность получать информацию о состоянии фотосинтетического аппарата объекта.

Так, измерение следующих параметров флуоресценции:

- F₀ - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла в отсутствие постоянной подсветки после длительной адаптации пробы в темноте при возбуждении тестирующим светом, не приводящим к закрытию РЦ и не приводящим к изменению состояния фотосинтетического аппарата,

- F_m - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла в отсутствие постоянной подсветки после длительной адаптации пробы в темноте при возбуждении светом, приводящим к полному закрытию РЦ, и достижении стационарного уровня,

- F_t - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла при длительной постоянной подсветке,

- F'_m - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла при длительной постоянной подсветке объекта и его возбуждении светом, приводящим к полному закрытию РЦ фотосинтетического аппарата

позволяет вычислить такие показатели состояния фотосинтезирующих организмов как:

1) максимальный квантовый выход разделения зарядов в ФС2 как отношение F_v/F_m=(F_m-F₀)/F_m. Этот параметр пропорционален доле активных РЦ ФС2 в темноте и соответствует потенциальной эффективности процессов фотосинтеза,

2) фотохимическое тушение на фоновом свету - qP=(F'_m-F_t)/(F'_m-F₀'),

3) нефотохимическое тушение на фоновом свету - NPQ=(F_m/F'_m)-1,

4) квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС2 как отношение Y=(F_m'-F_t)/F_m', отражающей параметры нециклического транспорта электронов при фотосинтезе,

5) абсолютное значение F₀ как показатель обилия фитопланктона в воде,

6) скорость переноса электронов от Qa к Qb, а также размер световой антенны и пула хинонов, которые можно вычислить по кинетике роста интенсивности флуоресценции хлорофилла от F₀ к F_m и другие.

Флуоресцентные методы оценки физиологического состояния растительных организмов являются наиболее объективными, неразрушающими и позволяют в течение короткого времени получать данные о состоянии ФСА объектов в естественной среде обитания в реальном времени.

Известен однолучевой метод регистрации флуоресценции (Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // М.: Итоги науки и техники, ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1990. Т.40. С.49-100) путем освещения объекта постоянным светом через коротковолновый (обычно синий) фильтр с последующей регистрацией индукционных изменений интенсивности флуоресценции через скрещенный красный фильтр, защищающий детектор флуоресценции от возбуждающего света. Поскольку выход флуоресценции невелик, то в качестве детектора используют, как правило, фотоумножитель. Использование одного и того же луча света для возбуждения флуоресценции и запуска процессов фотосинтеза, в ходе которого изменяется состояние фотосинтетического аппарата и квантовый выход флуоресценции, не позволяет однозначно интерпретировать результаты таких измерений.

Известен двулучевой способ регистрации флуоресценции (Лядский В.В., Горбунов М.А., Венедиктов П.С. Импульсный флуорометр для исследования первичных фотохимических процессов зеленых растений // Науч. докл. высшей школы. Биол. науки. 1987. Т.11. С.31-36), в котором изменение состояния ФСА осуществляют постоянным световым потоком, а возбуждение флуоресценции с целью зондирования изменений ФСА производят слабым модулированным светом и по изменениям квантового выхода флуоресценции оценивают состояние ФСА.

Для регистрации модулированного сигнала флуоресценции в этом методе используют резонансный усилитель, который не пропускает постоянный сигнал флуоресценции, возбуждаемый действующим светом.

Такой метод имеет довольно узкий динамический диапазон интенсивностей измеряющего и действующего света. Так, повышение насыщающих интенсивностей действующего света требует достаточно интенсивный зондирующий свет, чтобы переменный сигнал флуоресценции, был выше шумов постоянного сигнала флуоресценции, индуцированного постоянным действующим светом. Однако в этом случае зондирующий свет может индуцировать ощутимый поток электронов, что приведет к ошибке в определении величины F₀. Кроме того, известный способ предполагает использование ингибиторов (диурона), что значительно усложняет измерения, и практически не реализуем в погружном или проточном варианте.

Известен также способ регистрации флуоресценции путем модуляции зондирующего света (флуорометр с импульсной амплитудной модуляцией) (Ounis A., Evain S., Flexas J., Tosti S., Moya I. Adaptation of a PAM-fluorometers for remote sensing of chlorophyll fluorescence // Photosynth. Res. 2001. V.68. №2. P.113-120), в котором в качестве источника измеряющего света используют светодиод, генерирующий очень короткие (1 мкс) импульсы красного (650 нм) света с высокой скважностью (интервал между импульсами составляет около 1000 мкс). Импульсный сигнал флуоресценции детектируется фотодиодом и усиливается импульсным усилителем с синхронным детектором. Этот метод позволяет увеличить отношение интенсивностей действующего и зондирующего света до 10⁶ и надежно регистрировать уровень флуоресценции F₀ в широком диапазоне интенсивности действующего света. В то же время известный способ предполагает в качестве действующего использовать постоянный свет, который вызывает многократное срабатывание фотосинтетических реакционных центров (multiple turnover). Это затрудняет интерпретацию данных, поскольку в стационарном состоянии на выход флуоресценции влияет большое число факторов, вклад каждого из которых трудно определить, что в конечном счете приводит к возможности неоднозначной оценки результатов.

Известен также способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоатвотрофных организмов измерения параметров флуоресценции хлорофилла (Патент США №4942303, МПК G01N 21/64, опубл. 1990 г.), основанный на методе «накачки и зондирования» (pump-and-probe method), при котором образец освещают последовательно тремя вспышками света: «слабая зондирующая - мощная насыщающая - слабая зондирующая». Мощная вспышка накачки вызывает однократное срабатывание (single turnover) фотосинтетических РЦ, а слабая зондирующая вспышка, подаваемая через разное время после накачки, служит для определения кинетики изменения квантового выхода флуоресценции хлорофилла в процессе перехода РЦ из закрытого в открытое состояние.

Измерение выхода флуоресценции до и после насыщающей вспышки в присутствии постоянного действующего света известной интенсивности дает возможность измерить скорость фотосинтеза. Метод накачки и зондирования позволяет несколько расширить круг определяемых параметров ФСА. В то же время для измерения поперечного сечения поглощения и скорости потока электронов от ФС2 к ФС1 последовательность вспышек «зондирования - накачки - зондирования» требуется повторять 30 раз, при этом интенсивность вспышки накачки изменяют от нуля до насыщающего уровня или время задержки между накачкой и второй зондирующей вспышкой изменяют от 80 мкс до 300 мс. Осуществление таких двух экспериментальных протоколов требует от 5 минут до 10 минут работы флуорометра для проведения соответствующих измерений. Это ограничивает область применения известного способа, например, при получении вертикального профиля флуоресценции фитопланктона в океане, где эти протоколы часто необходимо проводить через каждый метр водного столба, указанное время становится недопустимо большим. Необходимость поддерживать интенсивность зондирующей вспышки ниже 1% от уровня насыщения ФС2 приводит к низкому отношению сигнал/шум, особенно при низкой концентрации хлорофилла, что не позволяет получить необходимую чувствительность измерений.

Известный флуорометр накачки и зондирования предусматривает применение двух отдельных каналов возбуждения (две вспышки), что усложняет конструкцию и увеличивает стоимость флуорометра. При этом полное выполнение экспериментального протокола по известному способу, в особенности при изучении фитопланктона в океане, требует значительного количества электрической энергии. Эти требования ограничивают возможность длительного автономного (на плавающем буе) измерения, при котором для питания флуорометра используют электрические батареи.

В зависимости от поставленной задачи определяют комплекс измеряемых параметров фотосинтетического аппарата и используют тот или иной метод возбуждения и регистрации флуоресценции.

Наиболее близким из известных технических решений к описываемому изобретению является способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов (Патент США №5426306, МКП G01N 21/64, опубл. 1995 г.), включающий световое воздействие на образец пробы анализируемой среды возбуждающими импульсами света с энергией, достаточной для возбуждения флуоресценции хлорофилла в образце, и последующее измерение интенсивности флуоресценции, по которой определяют фотосинтетические параметры исследуемого объекта.

В известном способе в качестве возбуждающих импульсов света используют быстро повторяющиеся вспышки (fast repetition rate, FRR) с регулируемой энергией и высокой частотой для постепенного и увеличивающегося насыщения ФС2 у фитопланктона. Известный способ позволяет быстро получать данные о функциональной величине поперечного сечения поглощения РЦ, переносе энергии между фотосинтетическими единицами ФС2, фотохимическом и нефотохимическом тушении флуоресценции и о кинетике переноса электронов на акцепторной стороне ФС2. Однако возможности известного способа флуорометрического определения состояния и активности ФСА фотосинтезирующих организмов не предполагают многократного измерения интенсивности флуоресценции F₀ на одном образце, что приводит к большим погрешностям измерения этого ключевого показателя. Для определения каждого показателя состояния ФСА в известном способе используют отдельную пробу, что также может вносить значительные ошибки. Известный способ не позволяет определять различные типы тушения, а следовательно, рассчитывать световую кривую электронного транспорта и определение зон оптимального фотосинтеза. Также известным способом невозможно определять устойчивость антиокислительной системы.

При этом известный способ измерения не позволяет определять вклад отдельных видов организмов в продукционные характеристики фитопланктонного сообщества. Кроме того, к известному методу измерения практически невозможно применить методы математического моделирования, т.к. моделировать приходиться каждый импульс отдельно и при серии 100-200 импульсов это крайне затруднено. Поэтому использование математической модели в известном способе для определения (вычисления) констант скоростей реакций переноса электрона в процессе фотосинтеза дает лишь отдаленно приближенные значения или невозможно совсем.

Наиболее близким из известных устройств для определения состояния фотосинтезирующих организмов к описываемому изобретению является устройство, реализующее способ по указанному выше патенту, включающее измерительную камеру, источник измерительного света, выполненный с возможностью возбуждать флуоресценцию образца, устройство измерения флуоресценции образца и блок управления, подключенный к ЭВМ, источнику измерительного света и устройству измерения флуоресценции образца.

Конструкция известного флуорометра позволяет проводить непрерывное измерение фотосинтетических параметров и скорости фотосинтеза как в темноте, так и при естественном освещении. Однако функциональные возможности известного устройства ограничены и не позволяют одновременно измерить необходимое количество параметров, характеризующих ФСА организма, требуемое для расчета и построения световой кривой электронного транспорта или для построения математических моделей ФСА, по которым можно определять признаки и параметры ФСА, не поддающиеся непосредственному измерению. При этом, поскольку малый сигнал флуоресценции в известном устройстве измеряют на фоне интенсивной инсоляции, проведение измерений в открытой камере в поверхностных слоях воды при интенсивном солнечном освещении не представляется возможным.

Кроме того, измерительные камеры во всех известных устройствах для измерения флуоресценции не обеспечивают подавление паразитного сигнала с фотоприемника, обусловленного тем, что значительная доля рассеянного света приходится на возбуждающий свет, попадающий на стенки и другие конструктивные элементы измерительной камеры. В то же время при измерении параметров флуоресценции фитопланктона в природных условиях, характеризующихся предельно низким содержанием клеток фитопланктона, необходима высокая чувствительность устройства.

Все приведенные выше факторы ограничивают возможность применения известных способа и устройства.

Таким образом, технический результат, достигаемый от реализации описываемого изобретения, состоит в повышении объективности и точности флуорометрической оценки активности фотосинтетического аппарата фотоавтотрофных организмов за счет проведения многократных измерений с высоким временным разрешением на одной пробе с одновременным определением вклада индивидуальных видов организмов в продукционные характеристики экосистемы и исследованием обилия фитопланктона и его функционального состояния in situ, а также за счет возможности определения его продукционных характеристик в естественных условиях в режиме реального времени.

Технический результат состоит также в расширении области применения за счет осуществления возможности рассчитывать световые кривые электронного транспорта и применять методы математического моделирования и тем самым определять дополнительные параметры, характеризующие фотосинтетические процессы.

Технический результат, достигаемый от реализации описываемого изобретения, состоит также в расширении функциональных и эксплуатационных возможностей устройства для определения состояния фотосинтезирующих организмов.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, включающем световое воздействие на образец пробы анализируемой среды импульсами возбуждающего света с энергией, достаточной для возбуждения флуоресценции хлорофилла, и последующее измерение интенсивности флуоресценции, по которой определяют фотосинтетические параметры исследуемого объекта, измерения флуоресценции осуществляют на одной пробе анализируемой среды, импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду, а их длительность последовательно изменяют в соответствии с временем переноса электронов на отдельных звеньях электронно-транспортной цепи фотосинтеза, при этом характеристики флуоресценции хлорофилла измеряют как при постоянной фоновой подсветке, имитирующей интенсивность облучения объекта в момент проведения исследований в естественных условиях, так и после адаптации образца в темноте и по совокупности значений интенсивности флуоресценции определяют параметры состояния фотосинтетического аппарата.

При этом для определения интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата, длительность импульсов выбирают 1-5 мкс с интервалом между импульсами 50-100 мс.

Целесообразно оценку относительного размера светособирающего комплекса пигментов фотосинтетических реакционных центров производить посредством подачи на образец импульса света с длительностью 100-200 мкс и измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла не реже, чем через каждые 10 мкс от начала импульса света с последующим вычислением прироста интенсивности флуоресценции хлорофилла за время действия импульса.

Для оценки скорости восстановления компонентов в акцепторной части ФС2 целесообразно производить воздействие на объект последовательностью из трех групп импульсов света одинаковой амплитуды и длительностью в каждой группе соответственно 1-5 мкс, 100-200 мкс и 200-1000 мс при средней плотности мощности не менее 3000 Дж·м^-2·с^-1 и измерять кинетику изменения интенсивности флуоресценции под действием каждого из этих импульсов в отдельности, при этом интенсивность флуоресценции в ответ на длительность импульса 1-5 мкс соответствует величине интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата, по углу наклона начального участка индукционной кривой изменения интенсивности флуоресценции в ответ на импульс возбуждающего света длительностью 100-200 мкс определяют относительный размер светособирающего комплекса, а по углу наклона кривой изменения интенсивности флуоресценции в ответ на действие импульса света длительностью 200-1000 мс определяют относительный размер пула хинонов.

Максимальный уровень флуоресценции хлорофилла можно определить путем подачи на образец импульса света длительностью 200-500 мс при плотности мощности облучения 3000 Вт/м².

Целесообразно измерять кинетики изменения флуоресценции (индукционные кривые) посредством воздействия на образец пробы импульсом света 300-1000 мс и в течение его действия не реже, чем через 1 мс производить измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла.

По результатам измерения кинетик флуоресценции может быть построена математическая модель фотосинтетического аппарата, по которой определяют количественные признаки и константы реакций переноса электронов, не определяемые экспериментально.

Предпочтительно измерения параметров флуоресценции производить на одном образце пробы исследуемой среды путем последовательного переключения режимов возбуждающих импульсов после проведения измерения каждого параметра, при этом длительность облучения в каждом последующем режиме выбирают больше, чем при предыдущем облучении.

Целесообразно описываемый способ использовать для определения фотосинтетических характеристик фитопланктона.

Предпочтительно отобранную пробу одновременно использовать для определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона, а также гетерогенности популяций индивидуальных клеток.

Для определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона и гетерогенности популяций из первоначально отобранной пробы выделяют второй образец анализируемой среды, концентрируют его, например, посредством фильтрации воды через ядерные фильтры, полученный концентрат распределяют в один слой клеток, например, в камере Нажотта, после чего путем визуальной оценки определяют видовой состав клеток фитопланктонных организмов.

Предпочтительно одновременно с оценкой видовой принадлежности популяций измерять на каждой клетке параметры флуоресценции по описанному выше способу и определять ее гетерогенность, при этом распределение клеток в популяции определять по эффективности процессов фотосинтеза, а относительное содержание пигментов в клетках по величине интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата, в отсутствие постоянной подсветки после длительной адаптации пробы в темноте.

Указанный технический результат достигается также тем, что устройство для флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, включающее измерительную камеру, источник света, оптически сопряженный с измерительной камерой и выполненный с возможностью возбуждать флуоресценцию образца, модуль измерения флуоресценции образца и соединенный с ним блок управления, подключенный к ЭВМ, содержит, по крайней мере, один дополнительный источник света, таким образом, чтобы число оптически сопряженных с измерительной камерой источников света было четным, стабилизатор токов источников света, выходы которого подключены к электрическим входам источников света, а вход - к блоку управления, и датчик естественной облученности, связанный через блок управления со стабилизатором токов источников света.

При этом источники света выполнены одинаковыми и каждый из них используют в качестве источника измерительного и/или насыщающего, и/или действующего света.

Модуль измерения флуоресценции образца может быть выполнен в виде подключенного к автономному высоковольтному источнику питания детектора флуоресценции, например фотоумножителя, соединенного через блок обработки сигнала и блок управления со средством регистрации, например с персональным компьютером.

При этом блок обработки сигнала может содержать, по крайней мере, один усилитель, связанный через синхронный детектор с аналого-цифровым преобразователем, выход которого подключен к блоку управления.

Целесообразно блок обработки сигнала выполнить в виде четырех последовательно соединенных операционных усилителей, выход каждого из которых через соответствующий синхронный детектор подключен к аналого-цифровому преобразователю, связанному с блоком управления.

В предпочтительном варианте устройство для флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов может содержать насос, коллектор, первый выход которого подсоединен к измерительной камере, а второй - к системе концентрирования второго образца пробы среды, дополнительную измерительную камеру для измерения параметров флуоресценции индивидуальных клеток, в качестве которой целесообразно использовать камеру Нажотта, микрофлуорометрическую приставку, состоящую из люминесцентного микроскопа с флуорометрической насадкой, и светодиодный источник света, подключенный через стабилизатор тока источника света к блоку управления.

При этом флуорометрическая насадка может быть выполнена в виде модуля измерения флуоресценции образца.

Указанный технический результат достигается также тем, что измерительная камера для измерения флуоресценции, включающая корпус, источник света и детектор флуоресценции, размещенные в окнах корпуса, а также входной и выходной патрубки, выполненные с возможностью соответственно подачи в камеру и вывода из нее образца пробы исследуемой среды, содержит, по крайней мере, один дополнительный источник света, расположенный диаметрально противоположно первому с возможностью поглощать свет от противоположно расположенного источника.

Предпочтительно, чтобы измерительная камера содержала четное число источников света больше двух, которые расположены попарно диаметрально противоположно друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса, при этом каждый источник света выполнен с возможностью поглощать свет от противоположно расположенного источника.

При этом детектор флуоресценции может быть выполнен в виде фотоумножителя, ось оптической системы которого совпадает с осью корпуса.

Изобретение поясняется чертежами, где представлены:

на фиг.1 - схема модели первичных реакций фотосинтеза;

на фиг.2 - временная диаграмма измерения флуоресценции;

на фиг.3 - блок-схема устройства для измерения параметров флуоресценции фитопланктона;

на фиг.4 - схема измерительной камеры;

на фиг.5 - внешний вид бортового флуометра как вариант реализации описываемого изобретения.

Установлено, что при воздействии на образец длительным импульсом света происходит последовательный запуск реакций фотосинтеза с разными скоростями протекания и различными продуктами этих реакций (фиг.1). При этом происходит изменение выхода флуоресценции хлорофилла, обусловленное протеканием этих реакций.

Таким образом, путем воздействия на исследуемый образец импульсами различной длительности, каждый из которых соответствует времени переноса электронов на определенной стадии в электронно-транспортной цепи фотосинтеза, можно получать ответную флуоресценцию с параметрами, характеризующими реакции, протекающие именно на этой стадии фотосинтеза. Так, характерное время одной из первых реакций - восстановление Qa составляет около 100 мкс, таким образом, при длительности импульса значительно менее 100 мкс практически не происходит запуска реакций фотосинтеза, а потому при подаче импульса света в 1-5 мкс уровень флуоресценции соответствует исходному уровню флуоресценции хлорофилла, когда все РЦ находятся в «открытом» состоянии. При длительности импульса света 100-200 мкс происходит процесс восстановления Qa. При этом Qa практически не окисляется, т.к. последующие процессы переноса электрона по электронно-транспортной цепи происходят со значительно меньшими скоростями. Это позволяет измерить относительный размер светособирающего комплекса по углу наклона начального участка изменений интенсивности флуоресценции. Чем больше угол наклона, тем больше относительный размер светособирающей антенны.

В ответ на действие возбуждающего света длительеностью 200-1000 мс происходит полное восстановление Qa и Qb и следующего за ними пула хинонов. При этом окисление пула хинонов в дальнейших реакциях имеет значительно меньшую скорость. В этих условиях можно измерить относительную величину пула хинонов по углу наклона кривой изменения интенсивности флуоресценции.

Таким образом, при воздействии на образец импульсами света, возбуждающего флуоресценцию хлорофилла, одинаковой амплитуды, но разной длительности достигается возможность измерить на одном образце ряд показателей функционального состояния фотосинтетического аппарата объектов.

При этом измерения параметров флуоресценции хлорофилла объекта проводят как на фоне действующего света, равного по величине естественному свету в месте отбора пробы (или на фоне выбранного значения интенсивности облучения), когда реакции фотосинтеза запущены и имеют равновесный характер, так и после адаптации образца в темноте.

Создание в зоне измерений освещения, воспроизводящего интенсивность естественного освещения в месте забора пробы, позволяет определять различные типы тушения, а следовательно, рассчитывать световую кривую электронного транспорта и определять зоны оптимального фотосинтеза.

При увеличении длительности импульса свыше 1000 мс происходит запуск множества реакций фотосинтеза, что затрудняет интерпретацию полученных данных и прямое однозначное измерение параметров без адаптации образца в темноте в течение порядка 10 минут становится невозможным. Чем длительнее импульс, тем больше должно быть время темновой адаптации после него.

После адаптации в темноте электронно-транспортная цепь фотосинтеза полностью разгружена от электронов и отключены механизмы, регулирующие первичные процессы фотосинтеза. При включении света запускают как световые, так и темновые реакции, регулирующие фотосинтетические процессы. Чем короче импульс света, тем меньше время, через которое можно подавать следующий импульс без изменения фотосинтетического аппарата. Поэтому сначала подают короткие импульсы и измеряют F₀, а затем более длительные импульсы для измерения остальных параметров, что экономит время каждого цикла измерений. Для достоверного статистического анализа полученных данных осуществляют подачу нескольких импульсов (группы) одинаковой длительности.

Данные, полученные при измерениях одиночными импульсами на одной пробе фитопланктона, дают возможность построения достаточно точной математической модели процессов фотосинтеза, по которой производят расчет соотношения констант скоростей реакций, протекающих в фотосинтетическом аппарате планктонных водорослей, но не измеряемых прямыми методами.

Описываемый способ определения состояния фотосинтезирующих организмов показан на конкретном примере исследования характеристик флуоресценции хлорофилла клеток фитопланктона. Такой выбор обоснован тем, что на долю фитопланктона приходится почти половина фотосинтетической биологической продукции Земли.

Забор пробы воды, содержащей клетки фитопланктона, осуществляют любым известным способом, в зависимости от задач и условий проведения исследований.

Пробу воды разделяют на два образца, один из которых помещают в измерительную камеру, где создана освещенность, имитирующая интенсивность облучения объекта в данный момент в естественных условиях, а другой образец концентрируют и помещают в отдельный блок для исследования отдельных клеток среды и определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона.

Предварительно выбирают наиболее информативные для предполагаемых исследований флуоресцентные показатели, после чего разрабатывают протокол измерения и его аппаратурную реализацию, настроенную на условия возбуждения флуоресценции для корректного измерения флуоресцентных показателей функционального состояния ФСА объекта.

На образец воздействуют импульсами возбуждающего света с изменяемой по выбранному алгоритму длительностью и производят измерения флуоресценции хлорофилла клеток фитопланктона, возникающей в ответ на воздействие света. При всех режимах воздействия светом на образец импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду.

Ниже приведен пример алгоритма измерений одновременно на одной пробе для определения рассмотренной выше совокупности параметров флуоресценции при использовании импульсов трех длительностей.

Предварительно в измерительной камере создают постоянную подсветку, эквивалентную по количеству квантов естественному фоновому облучению в точке отбора пробы, или интенсивность облучения задается оператором, исходя из средних типичных значений естественной облученности в месте забора пробы, на все время проведения первой стадии измерений в трех нижеследующих режимах (фиг.2).

1. Режим определения интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата.

Длительность импульсов света составляет от 1-5 мкс, интервал между импульсами - 50-100 мс при средней плотности мощности облучения не более 0,4 Вт·м^-2. В данном режиме определяют среднее значение интенсивности флуоресценции хлорофилла F_t.

Количество измерений выбирают исходя из необходимости достижения заданного значения ошибки среднего либо автоматически, либо по расчетам оператора.

При средней плотности мощности облучения не более 0,4 Дж·м^-2·с^-1 закрываются не более 1% РЦ на импульс и следующий импульс возможно подавать уже через 10-100 мс, т.к. за это время все закрытые коротким импульсом РЦ вернутся в открытое состояние.

После завершения режима 1 включают режим 2.

2. Режим определения прироста интенсивности флуоресценции хлорофилла за время действия импульса для оценки относительного размера светособирающего комплекса пигментов фотосинтетических реакционных центров.

Для проведения этих измерений на образец подают импульс света с длительностью 100-200 мкс, производят измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла через каждые 10 мкс и вычисляют средний прирост интенсивности флуоресценции хлорофилла за время действия импульса как производную интенсивности по времени.

Количество измерений выбирают исходя из необходимости достижения заданного значения ошибки среднего автоматически или по расчетам оператора.

После завершения режима 2 включают режим 3.

3. Режим определения кинетики и стационарного уровня интенсивности флуоресценции хлорофилла при полном насыщении светом фотосинтетического аппарата клеток фитопланктона создают импульсом света длительностью 200-1000 мс и средней плотностью мощности 3000 Дж·м^-2·с^-1. Измерение флуоресценции хлорофилла производят каждые 10 мкс от начала импульса света. При этом скорость прироста интенсивности флуоресценции обратно пропорциональна размерам пула хинонов.

При всех режимах измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду. Различные значения средних плотностей мощности возбуждающего флуоресценцию хлорофилла света получают за счет разной длительности импульсов.

4. Затем отключают постоянную фоновую подсветку, имитирующую интенсивность света для пробы в естественных условиях. После адаптации в темноте того же образца пробы воды проводят измерения флуоресценции хлорофилла в режимах 1, 2 и 3, но без постоянной фоновой подсветки.

По результатам измерений с постоянной подсветкой и без нее определяют параметры флуоресценции:

- F₀ - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла в ответ на импульсы возбуждающего света длительностью 1-5 мкс в отсутствие постоянной фоновой подсветки и после адаптации объекта в темноте,

- F_m - значение максимального уровня интенсивности флуоресценции хлорофилла в ответ на импульс возбуждающего света длительностью 200-1000 мс в отсутствие постоянной фоновой подсветки и после адаптации объекта в темноте,

- F_t - значение интенсивности флуоресценции хлорофилла при постоянной фоновой подсветке в ответ на импульсы длительностью 1-5 мкс,

- F'_m - значение максимального уровня интенсивности флуоресценции хлорофилла в ответ на импульс возбуждающего света длительностью 200-1000 мс при постоянной фоновой подсветке.

Из этих параметров по приведенным ранее формулам:

1) максимальный квантовый выход разделения зарядов в ФС2 как отношение F_v/F_m=(F_m-F₀)/F_m. Этот параметр пропорционален доле активных РЦ ФС2 в темноте;

2) фотохимическое тушение при фоновом облучении - qP=(F'_m-F_t)/(F'_m-F₀ ^');

3) нефотохимическое тушение при фоновом облучении - NPQ=(F_m/F'_m)-1;

4) квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС2 при фоновом облучении как отношение Y=(F_m'-F_t)/F_m', отражающей нециклический транспорт электронов при фотосинтезе;

5) абсолютное значение F₀ как показатель обилия фитопланктона в воде;

6) скорость переноса электронов от Qa к Qb, относительный размер светособирающего антенного комплекса и относительная величина пула хинонов, которые можно вычислить по кинетике роста интенсивности флуоресценции хлорофилла от F₀ к F_m.

Полученные в измерениях данные вводят в математическую модель процессов фотосинтеза и производят расчет других параметров, не измеряемых прямыми методами.

Для определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона второй образец пробы уплотняют посредством фильтрации воды через ядерные фильтры, полученный концентрат распределяют в один слой клеток в камере Нажотта объемом 70 мкл, после чего визуально определяют видовой состав клеток фитопланктонных организмов. На каждой клетке определенного вида фитопланктона, находящейся в камере, измеряют параметры флуоресценции по способу, который применяют для измерений флуоресценции первого образца, после чего определяют распределение видов водорослей по эффективности процессов фотосинтеза и относительному содержанию пигментов в клетках (по величине F₀). Таким образом, вначале определяют в поле зрения микроскопа видовую принадлежность исследуемой клетки, а затем измеряют ее флуоресцентные характеристики. Такие измерения проводят на нескольких десятках индивидуальных клеток каждого из массовых видов фитопланктона и по результатам измерений определяют видовой состав и численность клеток каждой популяции фитопланктонных водорослей, а также распределение клеток каждого вида водорослей по относительному содержанию фотосинтетических пигментов и эффективности первичных процессов фотосинтеза.

Для измерений используют микрофлуорометрическую приставку, состоящую из люминесцентного микроскопа с флуорометрической насадкой, и светодиодный источник света, подключенный к системе подачи возбуждающих флуоресценцию импульсов света.

Измерения на индивидуальных клетках позволяют определить гетерогенность популяций одиночных клеток микроводорослей.

Совокупность показателей интенсивности флуоресценции значений F₀, F_m, F_t, F'_m и кинетики перехода от F₀ к F_m суммарного образца пробы фитопланктона и отдельных клеток позволяет по известным зависимостям и на основании математической модели определять на одной пробе состояние фотосинтетического аппарата фитопланктонного сообщества в целом и индивидуальных видов водорослей, входящих в его состав.

Устройство, реализующее настоящее изобретение, выполнено следующим образом.

Измерительная камера 1 оптически сопряжена с источниками света 2 и детектором флуоресценции 3, выход которого через блок обработки сигнала 4 связан с блоком управления 5, соединенным с блоком регистрации и обработки данных 6, например ЭВМ, в частности персональный компьютер. При этом входы источников света 2 подключены к выходам стабилизатора токов 7 источников света, соединенного входом с выходом блока управления 5, в качестве которого может быть использован микропроцессор. Датчик 8 действующего света подсоединен ко входу блока управления 5 и может быть выполнен, например, в виде фотодиода с системой корректирующих светофильтров.

Блок обработки сигнала 4 может содержать, по крайней мере, один усилитель 9, подключенный через синхронный детектор 10 к аналого-цифровому преобразователю 11.

В предпочтительном варианте блок обработки сигнала 4 состоит из нескольких последовательно соединенных операционных усилителей 9, выход каждого из которых через синхронный детектор 10 связан с аналого-цифровым преобразователем (АЦП) 11, подключенным выходом к входу блока управления 5, подсоединенного к персональному компьютеру 6.

Стабилизатор токов 7 для источников света 2 предназначен для преобразования управляющего напряжения, поступающего с блока управления 5, в ток, обеспечивающий необходимую интенсивность излучения источников света 2 в соответствии с заданным алгоритмом. Стабилизатор токов 7 выполнен в виде нескольких независимых каналов, число которых соответствует количеству источников света 2 и выход каждого из которых подключен к электрическому входу соответствующего источника света 2. Каждый канал стабилизатора 7 может быть выполнен, например, в виде последовательно соединенных полевого транзистора и балластного сопротивления, подключенных к управляющему выходу блока управления 5.

Детектор флуоресценции 3 может быть выполнен в виде фотоумножителя, подключенного к автономному высоковольтному источнику питания 12, например модулю MHV 12-1,5 фирмы TRACO. В качестве фотоумножителя 3 может быть использован, например, фотоэлектронный умножитель ФЭУ-79 с граничным светофильтром КС 18, позволяющий регистрировать излучение с длиной волны 680 нм и более.

ЭВМ и блок управления имеют автономные источники питания постоянного тока или питаются от многоканального преобразователя напряжения (не показано).

Источники света 2 и фотоумножитель 3 содержат соответствующие оптические системы.

В качестве источников света 2 могут быть использованы светодиоды, каждый из которых способен выполнять функции измерительного света и/или насыщающего света, и/или постоянной подсветки, например мощные светодиоды L400CWO12K, Т4 Round (фирмы Ledtronics, Inc.) с длиной волны в максимуме излучения 612 нм.

Источники света 2 в четном количестве равномерно расположены в окнах измерительной камеры 1 вокруг ее оси в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса камеры. При этом источники света 2 размещены попарно диаметрально противоположно относительно друг друга и каждый из них выполнен с возможностью поглощать свет от противоположного источника.

В корпусе 13 измерительной камеры 1 (фиг.4) выполнены окна 14, в которых размещены оптические системы источников света 2. Каждая оптическая система включает сферическую линзу 15, светофильтр 16 и длиннофокусную линзу 17, при этом источник света 2 закреплен на теплоотводе 18, сопряженном в области окна 14 с корпусом 13. В окне 19 расположена оптическая система фотоумножителя 3. Окна 14 для источников света 2 расположены вокруг оси корпуса 13 с возможностью размещения источников света 2 попарно навстречу друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса 13. Фокусировку линзы 17 осуществляют таким образом, чтобы диаметр светового пятна на противоположном иллюминаторе не превышал диаметра этого иллюминатора. Окно 19 для фотоумножителя 3 расположено соосно с оптической системой фотоумножителя 3, ось которой совпадает с осью корпуса 13.

Блоки устройства для измерения параметров флуоресценции первого образца пробы скомпонованы в прочном герметичном корпусе с электронно-оптической системой измерения, который в совокупности с блоком питания представляет собой либо бортовой флуорометр, показанный на фиг.5, либо погружной зонд-флуорометр.

Устройство подсоединено к насосу для отбора проб, соединенному с коллектором (не показаны), распределяющим пробу на два образца, один из которых подают в измерительную камеру 1, а второй - в систему концентрирования пробы.

Блок измерения параметров флуоресценции хлорофилла индивидуальных клеток фитопланктона включает систему концентрирования, камеру Нажотта, размещенную на столе люминесцентного микроскопа типа ЛЮМАМ-И3 с флуорометрической насадкой типа ФМЭЛ 1-А, модифицированного светодиодным источником света, стабилизатором токов, блок управления и ЭВМ. Для регистрации и измерения флуоресценции клеток используют описанный выше модуль регистрации флуоресценции.

Устройство работает следующим образом.

Отобранная насосом проба исследуемой среды поступает в коллектор, где пробу воды, содержащую фитопланктон, разделяют на два образца, один из которых подают в рабочий объем измерительной камеры 1, а второй - в систему концентрирования блока измерения параметров флуоресценции хлорофилла индивидуальных клеток фитопланктона, после чего второй образец помещают в камеру Нажотта.

Предварительно посредством датчика 8 измеряют интенсивность естественного света, действующего в месте забора пробы (естественную подводную облученность), и подают на блок управления 5. С блока управления 5 по измерениям естественной облученности через стабилизатор токов 7 на источники света 2 подают сигнал, соответствующий интенсивности действующего света, и тем самым в измерительной камере 1 создают освещенность, соответствующую естественной подводной облученности.

Интенсивность естественного света измеряют по количеству квантов света на единицу поверхности в секунду в области 400-700 нм, соответствующей области фотосинтетически активной радиации (ФАР). Испускание флуоресценции водорослей происходит в диапазоне длин волн от 680 нм до 740 нм. Таким образом, в составе естественного света присутствует область, характерная для флуоресценции хлорофилла, что при невысоком выходе флуоресценции (приблизительно 2%) не позволяет напрямую под действием естественного света измерять интенсивность флуоресценции при малых (характерных для естественной среды) концентрациях водорослей. Поэтому в описываемом устройстве фоновую подсветку, имитирующую естественное облучение, производят в области 400-600 нм, но равным по количеству квантов естественному облучению.

Блок управления 5 задает в измерительной камере 1 (при условии возможности измерения сигнала флуоресценции) интенсивность облучения, эквивалентную по количеству фотонов условиям естественного облучения в месте отбора пробы.

На образец пробы фитопланктона, помещенный в измерительную камеру 1, в которой создана облученность, соответствующая облученности среды в месте и во время забора пробы, производят облучение образца импульсами света в соответствии с выбранной временной диаграммой (фиг.2).

Благодаря четному количеству источников света и за счет размещения источников света попарно, один напротив другого, оптическая система каждого источника света является «ловушкой» света для противоположного источника света. Такое расположение источников света исключает возможность многократного рассеяния на стенках измерительной камеры, что уменьшает паразитную засветку детектора флуоресценции (фотоумножителя) возбуждающим светом.

Поступающий от источника 2 свет посредством сферической линзы 15 собирается в параллельный пучок, который проходит через светофильтр 16 и фокусируется длиннофокусной линзой 17 в слабосходящийся пучок с возможностью попадания его совместно с рассеянным на образце светом в противоположную оптическую систему (фиг.4).

Световой сигнал флуоресценции образца через оптическую систему, включающую светофильтр, выделяющий спектральную область флуоресценции хлорофилла, регистрируется фотоумножителем 3. Выходной сигнал фотоумножителя 3, содержащий информацию о величине флуоресценции хлорофилла, через блок обработки сигнала 4 подают на устройство регистрирации и обработки данных 6, в данном случае - персональный компьютер.

Концентрация фитопланктона в природной среде варьирует в достаточно широких пределах от 0,01 мкг/л до 100 мкг/л. Таким образом, заранее не известна его концентрация и величина электрического сигнала, получаемого на выходе фотоумножителя 3. При низкой концентрации фитопланктона электрический сигнал небольшой величины снимается с усилителя 9 и синхронного детектора 10, обладающих максимальным коэффициентом усиления. При увеличении концентрации и соответственно электрического сигнала сигнал на усилителе 9 становится выше максимального значения для этого усилителя и не может быть объективно им измерен. Поэтому предпочтительно блок обработки выходного сигнала выполнить в виде цепочки усилителей 9-9³ с известными коэффициентами усиления. При этом коэффициент усиления усилителей 9 выбирают порядка 4 исходя из того, что F_m может в 4 раза превышает F₀, что позволяет измерить сигнал флуоресценции за один импульс без подстройки усилительного тракта. Так, при низкой концентрации фитопланктона электрический сигнал небольшой величины снимается с усилителя 9³ и синхронного детектора 10³, обладающих максимальным коэффициентом усиления. При увеличении концентрации и соответственно электрического сигнала сигнал на усилителе 9³ становится выше максимального значения для этого усилителя и не может быть им измерен. В каскадной схеме сигнал снимают с усилителя 9² с синхронным детектором 10², при дальнейшем возрастании флуоресценции сигнал снимают с усилителя 9¹ с синхронным детектором 10¹ и с усилителя 9 с синхронным детектором 10. Выходные сигналы синхронных детекторов 10 посредством аналого-цифрового преобразователя (АЦП) 11 переводят в цифровую форму. Блок управления 5 (микропроцессор) выбирает для измерения величины сигнала флуоресценции ближайший к последнему каскаду усилителей ненасыщенный канал.

Таким образом, за один цикл измерений (один импульс) измеряют любую концентрацию путем выбора «незашкаленного» усилителя и с учетом соответствующего коэффициента усиления. Такое построение схемы обработки сигнала позволяет расширить динамический диапазон измерений, выполнить измерения в начальный период освещения на ранних стадиях индукционного процесса и дает возможность работать во всех диапазонах концентраций фитопланктона, которые встречаются в естественной среде.

Управление циклом измерений осуществляют микропроцессорным блоком управления 5, с выхода которого сигнал, содержащий информацию об интенсивности флуоресценции хлорофилла, поступает на персональный компьютер 6. По результатам измерения параметров флуоресценции, вводимых в построенную математическую модель работы фотосинтетического аппарата, с использованием специальных программ вычисляют константы скоростей реакций переноса электронов, не определяемые в прямых экспериментах.

Персональный компьютер 6 в соответствии с выбранной программой измерений выдает на устройство управления 5 команды управления измерением, в частности алгоритм работы стабилизатора токов 7 и соответственно источников света 2, а также датчика 13 действующего света (измерителя облученности в месте отбора пробы).

Для определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона второй образец анализируемой среды концентрируют (уплотняют) при помощи фильтрации воды через ядерные фильтры 20. Сконцентрированные водоросли помещают в камеру Нажотта объемом 70 мкл, в которой их распределяют в один слой клеток.

При нижней подсветке, обеспечивающей визуальный контроль препарата в камере Нажотта, каждую из клеток, находящихся в поле зрения, помещают препаратоводителем в фотометрируемую зону диаметром 37,5 мкм. По команде оператора с компьютера запускают цикл, состоящий из измерения флуоресценции в ответ на последовательность импульсов света от светодиода. По результатам измерений вычисляют средние значения F₀ и F_m, характеризующие относительное содержание пигментов в клетках и эффективность процессов фотосинтеза, по которым судят о распределении клеток различных видов водорослей.

В качестве примера приведены исследования флуорометрических характеристик массовых видов водорослей из прибрежной зоны Черного моря.

На основании данных первых дней обследования выбраны массовые виды фитопланктонного сообщества и проведен анализ распределения клеток по показателю эффективности фотосинтеза. В период обследования представители диатомовых Th. nitzsehioides и Rh. fragilissima находились в угнетенном состоянии. Около половины этих клеток обладали очень низким уровнем эффективности фотосинтеза. Исходя из данных, полученных на культурах водорослей и в природных популяциях, при уровне среднего значения (F_m-F₀)/F_m ниже 0,3 прирост численности клеток водорослей прекращается. Поэтому распределение клеток Th. nitzsehioides и Rh. fragilissima по относительной переменной флуоресценции позволяет прогнозировать снижение численности этих видов. Большинство клеток Nitzschia sp. и представителя динофлагелят G. wulffii обладали высокой эффективностью фотосинтеза, что свидетельствует о благоприятных для них условиях и позволяет прогнозировать рост численности этих видов. Через две недели после начала обследования значительно увеличилось относительное содержание клеток G. wulffii. То же, но в несколько меньшей степени, произошло и с клетками Nitzschia sp., тогда как клетки Th. nitzsehioides и Rh. fragilissima стали встречаться эпизодически.

В таблице 1 представлены частоты встречаемости указанных видов микроводорослей, среднее значение интенсивности флуоресценции F₀, соответствующее относительному содержанию фотосинтетических пигментов отдельных клеток, и среднее значение относительной переменной флуоресценции водорослей (F_m-F₀)/F_m, показывающее эффективность первичных процессов фотосинтеза организма. Пробы воды взяты из зоны «свала» (44° 32,8 с.ш. 37° 57,7 в.д.) в сентябре 2002 года; содержание пигментов в пересчете на ХЛ вычислено по значению интенсивности флуоресценции F₀.

Таким образом, использование микрофлуорометрического метода позволяет получить данные для оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата клеток микроводорослей и составить краткосрочный прогноз динамики численности отдельных видов фитопланктона в данном фитоценозе. Высокие чувствительность и быстродействие таких методов позволяют проводить надежные измерения на растительных объектах в природных условиях, в частности при исследовании природного фитопланктона даже в самых низкопродуктивных акваториях океана.

Настоящее изобретение не ограничивается применением для измерения флуоресценции только у фотосинтезирующих организмов, оно может быть также использовано в любых случаях, в которых серия вспышек света позволяет проводить детальное исследование процессов, таких как химические или биологические анализы, основанные на измерении флуоресценции.

Изобретение относится к измерительной технике. В способе, включающем световое воздействие на образец пробы анализируемой среды, импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду и изменяемую длительность, при этом характеристики флуоресценции хлорофилла измеряют при постоянной фоновой подсветке, имитирующей интенсивность облучения объекта в момент проведения исследований в естественных условиях, и после адаптации его в темноте. Устройство включает измерительную камеру, четное количество источников измерительного света, оптически сопряженных с измерительной камерой, модуль измерения флуоресценции образца, блок управления, стабилизатор токов источников света и датчик естественной облученности. Измерительная камера содержит корпус, регистратор флуоресценции и четное число источников света, которые расположены попарно диаметрально противоположно друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса. Технический результат - повышение точности определения. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

1. Способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, включающий отбор пробы анализируемой среды, световое воздействие на образец пробы импульсами возбуждающего света с энергией, достаточной для возбуждения флуоресценции хлорофилла в образце, и последующее измерение интенсивности флуоресценции, отличающийся тем, что импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду и изменяемую длительность и при световом воздействии используют импульсы с различной длительностью для получения флуоресценции с параметрами, характеризующими реакции на определенной стадии фотосинтеза, при этом интенсивность флуоресценции хлорофилла измеряют при постоянной фоновой подсветке в области 400-600 нм, эквивалентной по количеству квантов естественному фоновому облучению в точке отбора пробы исследуемого объекта в момент проведения исследований и после адаптации образца пробы в темноте, и по совокупности измеренных значений интенсивности флуоресценции определяют параметры флуоресценции, по которым судят о состоянии фотосинтетического аппарата, и определяют параметры фотосинтеза исследуемого объекта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют импульсы с длительностью 1-5 мкс и интервалом между импульсами - 50-100 мс для определения интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют импульсы света с длительностью 100-200 мкс, измеряют интенсивность флуоресценции хлорофилла не реже, чем через каждые 10 мкс от начала импульса света, вычисляют прирост интенсивности флуоресценции хлорофилла за время действия импульса и проводят оценку относительного размера светособирающего комплекса пигментов фотосинтетических реакционных центров.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействуют на объект последовательностью из трех групп импульсов света одинаковой амплитуды и длительностью в каждой группе соответственно 1-5 мкс, 100-200 мкс и 200-1000 мс при средней плотности мощности не менее 3000 Дж·м^-2·с^-1, измеряют кинетику изменения интенсивности флуоресценции под действием каждого из этих импульсов в отдельности, при этом определяют интенсивность флуоресценции, полученную в ответ на длительность импульса 1-5 мкс и соответствующую величине интенсивности флуоресценции хлорофилла, при котором импульсы возбуждающего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата, по углу наклона начального участка индукционной кривой изменения интенсивности флуоресценции в ответ на импульс возбуждающего света длительностью 100-200 мкс определяют относительный размер светособирающего комплекса, а по углу наклона кривой изменения интенсивности флуоресценции в ответ на действие импульса света длительностью 200-1000 мс определяют относительный размер пула хинонов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют импульсы света длительностью 200-500 мс при плотности мощности облучения 3000 Дж·м^-2·с^-1 и определяют максимальный уровень флуоресценции хлорофилла.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействуют на образец импульсами света с длительностью 300-1000 мс, в течение его действия не реже, чем через 1 мс производят измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла, по результатам измерений получают кинетики изменения флуоресценции (индукционные кривые) для определения соотношения констант скоростей переноса электронов в цепи фотосинтетического электронного транспорта.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что по результатам измерения параметров флуоресценции дополнительно строят математическую модель фотосинтетического аппарата, по которой судят о количественных признаках и константах реакций переноса электронов, не определяемых экспериментально.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерения параметров флуоресценции производят на одном образце путем последовательного переключения режимов возбуждающего импульса после проведения измерения каждого параметра, при этом среднюю длительность облучения в каждом последующем режиме выбирают выше, чем при предыдущем облучении.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что в качестве фотоавтотрофных организмов используют фитопланктон.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что отобранную пробу одновременно используют для дополнительного определения вклада индивидуальных видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона, а также для определения гетерогенности популяций массовых видов водорослей.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что из первоначально отобранной пробы выделяют второй образец анализируемой среды, который для дополнительного определения вклада массовых видов водорослей в продукционные характеристики фитопланктона концентрируют, например, путем уплотнения при помощи фильтрации воды через ядерные фильтры, полученный концентрат распределяют в один слой, например в камере Нажотта, после чего путем визуальной оценки определяют видовой состав клеток фитопланктонных организмов.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что одновременно с оценкой видовой принадлежности популяций проводят дополнительные измерения параметров флуоресценции на каждой клетке и определяют распределение различных видов водорослей по эффективности процессов фотосинтеза и по относительному содержанию пигментов в клетке.

13. Устройство для флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, включающее измерительную камеру, содержащую источник света, выполненный с возможностью возбуждать флуоресценцию образца, и модуль измерения флуоресценции образца, содержащий детектор флуоресценции, блок управления и устройство регистрации и обработки данных (ЭВМ), отличающееся тем, что измерительная камера содержит, по крайней мере, один дополнительный источник света, таким образом, чтобы число источников света было четным, при этом в устройстве предусмотрен стабилизатор токов источников света, выходы которого подключены к электрическим входам источников света, а вход - к блоку управления, и датчик естественной облученности, связанный через блок управления со стабилизатором токов источников света, при этом детектор флуоресценции соединен через блок обработки сигнала и блок управления с устройством регистрации и обработки данных.

14. Устройство по п.13, отличающееся тем, что источники света выполнены одинаковыми с возможностью излучать измерительный и/или насыщающий, и/или действующий свет.

15. Устройство по п.13, отличающееся тем, что модуль измерения флуоресценции выполнен в виде подключенного к автономному высоковольтному источнику питания детектора флуоресценции, например фотоумножителя, а устройство регистрации и обработки данных, является, например, персональным компьютером.

16. Устройство по п.13, отличающееся тем, что блок обработки сигнала содержит, по крайней мере, один усилитель, связанный через синхронный детектор с аналого-цифровым преобразователем, выход которого подключен к блоку управления.

17. Устройство по п.16, отличающееся тем, что блок обработки сигнала выполнен в виде четырех последовательно соединенных операционных усилителей, выход каждого из которых через соответствующий синхронный детектор подключен к аналого-цифровому преобразователю.

18. Устройство по п.13, отличающееся тем, что оно содержит насос, коллектор, первый выход которого подсоединен к измерительной камере, а второй - к системе концентрирования второго образца пробы среды, дополнительную измерительную камеру для измерения параметров флуоресценции индивидуальных клеток, микрофлуорометрическую приставку, состоящую из люминесцентного микроскопа с флуорометрической насадкой и дополнительный светодиодный источник света, подключенный через дополнительный стабилизатор тока источника света к дополнительному блоку управления.

19. Устройство по п.18, отличающееся тем, что флуорометрическая насадка выполнена в виде модуля измерения флуоресценции по п.15.

20. Устройство по п.18, отличающееся тем, что содержит дополнительную измерительную камеру, в качестве которой используют камеру Нажотта.

21. Измерительная камера, содержащая корпус, источник света и детектор флуоресценции, размещенные в окнах корпуса, а также входной и выходной патрубки, выполненные с возможностью соответственно подачи в камеру и вывода из нее образца пробы исследуемой среды, отличающаяся тем, что она содержит, по крайней мере, один дополнительный источник света, расположенный диаметрально противоположно первому с возможностью поглощать свет от противоположно расположенного источника, при этом источники света и окна для источников света равномерно расположены вокруг оси корпуса.

22. Измерительная камера по п.20, отличающаяся тем, что она содержит четное число источников света, больше двух, которые расположены попарно диаметрально противоположно друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса, при этом каждый источник света выполнен с возможностью поглощать свет от противоположно расположенного источника.

23. Измерительная камера по п.22, отличающаяся тем, что детектор флуоресценции представляет собой фотоумножитель, ось оптической системы которого совпадает с осью корпуса.