СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА Российский патент 2009 года по МПК A61K38/20 A61P1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а именно к лечению повреждений слизистой оболочки (СО) ЖКТ с помощью препаратов интерлейкина-1 (ИЛ-1).

Как правило, лечение поражений слизистой оболочки (СО) пищеварительного тракта осуществляют путем комплексного воздействия. Для стимуляции процессов регенерации СО в комплекс лечебных мероприятий включают солкосерил, метилурацил, алоэ, витамины, аутогемотерапию. При трудно рубцующихся язвах используют гипербарическую оксигенацию, местное введение лекарственных препаратов в область язвенного дефекта через эндоскоп, применяют гелий-неоновый лазер. При наличии прободения или перфорации язвы желудка или двенадцатиперстной кишки, а также при малигнизации язвы выполняется оперативное вмешательство. Проводят устранение повреждающего влияния кислотно-пептического фактора, нормализацию моторно-эвакуаторной функций желудка и двенадцатиперстной кишки, стимуляцию образования слизи, улучшение кровоснабжения слизистой оболочки и другие (Краткая медицинская энциклопедия. / Под ред. акад. Б.В.Петровского, М., «Советская энциклопедия», 1990, стр.437-439). Недостатками комплексных методов являются трудоемкость, длительные сроки лечения, наличие значительного числа противопоказаний и возможность осложнений.

Одним из перспективных направлений является использование для лечения заболеваний ЖКТ цитокинов, в частности, интерлейкина-1 (ИЛ-1), что позволяет проводить монотерапию. В настоящее время установлено, что препараты ИЛ-1 эффективны для профилактики поражения СО ЖКТ индометацином. Препараты ИЛ-1α и ИЛ-1β вводят интраперитонально за 90 мин до введения повреждающего фактора (Wallace J.L. et al., Gastroenterology, 1992, v.102, p.1176).

Недостатком данного способа воздействия является ограниченная область применения и технология введения препарата, отработанная только для использования в эксперименте на животных и не предназначенная для лечения людей.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ лечения больных с язвой желудка путем внутривенного введения препарата на основе ИЛ-1 бета - Беталейкина (Долгушина А.И., Автореферат канд. дисс., г.Челябинск, 2003). Курс лечения состоит из 3 ежедневных внутривенных капельных инфузий в дозе 5 нг/кг массы тела. После применения ИЛ-1 было показано ускорение заживления язвенных дефектов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки. Однако данный способ применения ИЛ-1 имеет ряд недостатков, в частности, относительно невысокая эффективность и наличие нежелательных побочных эффектов, таких, как лихорадочная реакция после инфузий и негативная реакция со стороны системного иммунитета.

Технической задачей, стоявшей перед авторами, является разработка более эффективного способа лечения повреждений СО ЖКТ с использованием препаратов ИЛ-1.

Технический результат достигается введением пациенту перорально препарата ИЛ-1 в виде водного или физиологического раствора, содержащего 5×10^-7 -5×10^-5 мас.% ИЛ-1 в количестве 25-2500 нг на 1 кг массы в течение 1-5 дней в зависимости от особенностей заболевания.

Как показали исследования, использование ИЛ-1 значительно усиливает заживление язвенных поражений СОЖ в различных моделях.

В качестве препарата ИЛ-1 могут использоваться рекомбинантный или природный ИЛ-1, а также ИЛ-1 альфа и ИЛ-1 бета, например, препарат «Беталейкин», который представляет собой фармакопейный препарат рекомбинантного человеческого ИЛ-1β. Использование ИЛ-1 в дозе менее 10^-7 малоэффективно, применение его в дозе более 10^-5 мас.% возможно при использовании в отдельных осложненных патологиях, но, как правило, экономически нецелесообразно. Выбор конкретного интерлейкина-1 и длительность применения определяется, в основном, особенностями заболевания пациента.

Промышленная применимость способа и его эффективность иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение природного препарата ИЛ-1 проводили путем стимуляции клеток человека. Выделение клеток проводили следующим образом (Boyum A., Scand. J. Clin. Invest., 1968, V.21, S.97, P.77-89). К 10 мл свежей венозной крови, взятой на гепарине (20 МЕ/мл) в стерильную пробирку, добавляли 1 мл 10% раствора желатины, перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем проводили центрифугирование в градиенте плотности Histopaque ("Sigma"). Для этого 6 мл полученной лейковзвеси наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали в течение 40 минут при 450 g при +4°С. Образовавшееся в интерфазе "кольцо" мононуклеаров снимали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали 0,9% раствором NaC. Жизнеспособность клеток, которую определяли по методу окрашивания трипановым синим, составляла не менее 95%. Клетки ресуспендировали в концентрации 5×10^-6 клеток /мл в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Для приготовления рабочего раствора продигиозана смешивали 2,4 мл среды RPMI 1640 и 800 мкл 0,005% раствора продигиозана, при этом в 100 мкл полученного раствора содержалось 1,0 мкг продигиозана. В 96-луночный планшет для культивирования клеток ("COSTAR") вносили индуктор по 100 мкл на лунку, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенных клеток. Культивирование проводили при 37°С в 5% СО₂ в течение 24 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты.

В полученном супернатанте определяли содержание биоактивного ИЛ-1 в тесте пролиферации мышиных тимоцитов по следующей методике. Мышей линии СВА забивали методом цервикальной дислокации. В асептических условиях извлекали у них тимусы, которые затем гомогенизировали в среде Игла с использованием игл различного диаметра. Полученную взвесь тимоцитов ресуспендировали в 1 мл среды Игла и подсчитывали в камере Горяева. Средой Игла, содержащей 4% фетальной сыворотки, доводили концентрацию клеток до 10 млн/мл. В лунки 96-луночного планшета для культивирования вносили исследуемые образцы, раствор конканавалина А и по 100 мкл приготовленной ранее взвеси тимоцитов. Одновременно в этом же планшете ставили необходимые контроли:

- контроль клеточной взвеси - к 100 мкл культуральной среды добавляли 100 мкл клеточной взвеси;

- контроль действия субоптимальной дозы конканавалина А: к 50 мкл культуральной среды добавляли 50 мкл рабочего раствора конканавалина А и 100 мкл взвеси тимоцитов;

- контроль действия оптимальной дозы конканавалина А: к 100 мкл рабочего раствора конканавалина А добавляли 100 мкл тимоцитарной взвеси.

Культивирование осуществляли в течение 72 часов в СО₂-инкубаторе. За 18 часов до окончания культивирования во все лунки планшета вносили по 40 мкг 3Н-тимидина в объеме 10 мкл. По окончании культивирования тимоцитарные культуры из всех лунок планшета переносили с помощью харвестера на фильтры, которые затем высушивали. Фильтры помещали в виалы с сцинтилляционной жидкостью и определяли включение 3Н-тимидина тимоцитами каждой культуры, используя для этого сцинтилляционный счетчик (RACKBETA 1217). Данные по каждым трем параллельным культурам усредняли. Для стандартного образца строили график зависимости уровня включения 3Н-тимидина от разведения препарата. Для того чтобы рассчитать активность исследуемого образца, находили среднее значение включения 3Н-тимидина в каждом его разведении и определяли последнее разведение, в котором образец дает усиление пролиферации укладывающееся на график стандарта.

Расчет активности исследуемого образца проводили следующим образом: на графике, построенном для стандартного образца, находили точку, соответствующую минимальному усилению пролиферации, выраженному в импульсах в минуту, которое дает исследуемый образец в каком-либо разведении и которое укладывается на прямую часть графика стандарта, затем, опустив перпендикуляр на ось абсцисс, находили разведение стандарта, вызывающее такое же усиление пролиферации. Таким образом, было получено, что проценты усиления пролиферации стандартного образца и исследуемого образца равны и для расчета активности не являются необходимыми. Содержание ИЛ-1 доводили до нужной концентрации путем разведения в стерильном физиологическом растворе.

В эксперименте использовали самок крыс Wistar весом ок. 150 г. За 24 часа до проведения опыта крыс не кормили, оставляя свободный доступ к воде. Повреждения слизистой вызывали внутрижелудочным введением 1 мл 96° этанола (Wallace J.L., Eur. J. Pharmacol., 1990, v.186, p.279). Через 1 час после поражения внутрижелудочно через зонд вводили 1 мл раствора ИЛ-1 или плацебо в том же объеме. На каждую точку были исследованы по пять животных. Животные были забиты через 3 часа, сутки и трое суток после введения ИЛ-1. Желудки были вынуты, зафиксированы 10% формалином, разрезаны по большой кривизне, приколоты к восковой платформе и сфотографированы цифровой камерой, после чего площадь поражений измеряли с использованием программы Scion Image. Процент поражения высчитывали как отношение пораженных участков к общей площади слизистой желудка. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние ИЛ-1 на площадь поражений СОЖ Срок исследования Концентрация ИЛ-1 бета 5 нг/мл (5×10^-7 %) 50 нг/мл (5×10^-6 %) 500 нг/мл (5×10^-5 %) Плацебо Площадь пораженной СОЖ, % 3 часа 10,8±2,34 12,8+5,5 9,0±1,5 10,4±1,6 24 часа 5,3±1,55 5,2±1,4* 4,9±1,9 14,5±3,3 72 часа 3,8±0,8 3,4±1,8 2,8±1,8 6,8±1,5

Количество наблюдений: n=5 на каждую точку.

Приведенные данные показали, что, начиная со срока 24 часа, применение ИЛ-1 в 1,5-3 раза снижало площадь поражения по сравнению с контрольной группой.

Пример 2. В примере для лечения поражений желудка использовали препарат «Беталейкин». Ампулу препарата, содержавшую 1 мкг рекомбинантного человеческого ИЛ-1β, разводили в 1 мл стерильного физиологического раствора и перемешивали пипетированием. Таким образом, получали раствор с концентрацией ИЛ-1β 100 нг/мл. Раствор использовали сразу же после приготовления.

В экспериментах использовались самки крыс Wistar массой 150-200 г. У крыс индуцировали язву желудка путем введения в полость желудка уксусной кислоты (Tsukimi Y., et al., Gastroenterology Hepatology, 1994, v.9, p.60). На 3 день после операции происходило формирование язвенного дефекта, что было подтверждено гистологическим исследованием, при этом у каждого животного образовывалось по две язвы. На 4 и 5 дни после операции животным опытных групп вводили через зонд в желудок препарат «Беталейкин» в дозе 100 нг/мл в 1 мл раствора. Животные контрольной группы на те же сроки получали 1 мл физ. раствора. На 8 день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и измеряли площадь поверхности язв. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева с использованием раствора Тюрка. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты измерения площадей язв представлены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние препарата «Беталейкин» на площадь язв СОЖ Концентрация ИЛ-1β Площадь язвы, мм² % снижения от контроля 100 нг/мл - 1×10^-8 % (n=8) 18,56±2,00 36,5 Плацебо (контроль) (n=6) 29,25+4,40 0

Как следует из представленных данных, наблюдалось снижение площадей язв более чем на 36% после лечения препаратом «Беталейкин» по сравнению с контролем.

Таблица 3 Количество лейкоцитов крови у крыс, получавших «Беталейкин» Группы животных ИЛ-1β, 100 нг/мл n=3 Плацебо n=3 Количество лейкоцитов, тыс./мм³ 8,50±1,44 10,70±1,20

Результаты подсчетов абсолютного количества лейкоцитов показали отсутствие достоверных различий между контрольной и опытной группами (Таблица 3). Это позволяет судить об отсутствии значительного системного воздействия препарата при его введении в желудок.

Пример 3. 10 мкл субстанции ИЛ-1β (в концентрации 2 мг/мл в ФСБ рН 7,2), содержавшей 20 мкг ИЛ-1β, разводили в 980 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлористого (физиологического раствора), и получали, таким образом, раствор с концентрацией ИЛ-1β 20 мкг/мл. Затем 5 мкл полученного раствора вносили в 995 мкл стерильного физиологического раствора и перемешивали пипетированием. Раствор использовали сразу же после приготовления. Язва желудка индуцировалась так же, как описано в примере 2. На 4, 5 и 6 дни после операции животным опытных групп вводили через зонд в желудок рекомбинантный ИЛ-1β в 1 мл 0,9% стерильного физиологического раствора в концентрации 100 нг/мл.

На 8 день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и язвы иссекали для гистологического исследования. После стандартной гистологической проводки изготавливали срезы толщиной 6 мкм, которые окрашивали гематоксилином-эозином. Препараты фотографировали с помощью микроскопа с цифровой камерой («Leica»), после чего периметр язв измеряли с использованием программы Scion Image. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева с использованием раствора Тюрка. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты морфометрических измерений язв представлены в таблице 4.

Таблица 4 Влияние рек. ИЛ-1β на размер язв СОЖ Концентрация рек. ИЛ-1β Ширина язвы, мкм % снижения от контроля 100 нг/мл - 1×10^-7 % (n=5) 3440,0±349,0 29,5 Плацебо (контроль) (n=5) 4880,0±589,0 0

По данным гистологического и морфометрического исследований показана четкая тенденция к снижению периметра язвы (в среднем около 30%) у животных, получавших рекомбинантный ИЛ-1β человека.

Пример 4. Рекомбинантный ИЛ-1α человека разводили в стерильном физиологическом растворе в концентрации 100 нг/мл и перемешивали пипетированием. Раствор использовали сразу же, после приготовления.

Язва желудка индуцировалась так же как описано в примере 2. На 4, 5 и 6 дни после операции животным опытных групп вводили через зонд в желудок приготовленный раствор рек ИЛ-1α в объеме 1 мл. Животные контрольной группы на те же сроки получали 1 мл физ. раствора. На 8 день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и измеряли площадь поверхности язв. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева с использованием раствора Тюрка. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты измерений площадей язв представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние рекомбинантного ИЛ-1α на размер язв СОЖ Концентрация рек. ИЛ-1β Площадь язвы, мм² % снижения от контроля 100 нг/мл - 1×10^-7 % (n=5) 14,88±2,42 24,03 Плацебо (контроль) (n=5) 19,58±1,83 0

По данным таблицы 5 показана четкая тенденция к снижению периметра язвы (в среднем на четверть) у животных, получавших рек. ИЛ-1α.

Таблица 6. Количество лейкоцитов крови у крыс, получавших рек. ИЛ-1α Группы животных ИЛ-1α, 100 нг/мл n=3 Плацебо n=3 Количество лейкоцитов, тыс./мм³ 8,83±1,69 8,83±1,09

Результаты подсчетов абсолютного количества лейкоцитов показали отсутствие различий между контрольной и опытной группами (Таблица 6). Это также позволяет сказать об отсутствии значительного системного воздействия ИЛ-1 при местном использовании.

В ходе проведенных экспериментов было показано, что при введении в желудок раствора ИЛ-1 оказывает выраженное ранозаживляющее действие, стимулирует местный иммунитет слизистой и не имеет негативных побочных эффектов. Местное использование ИЛ-1 позволяет достичь высоких лечебных концентраций препарата непосредственно в очаге поражения и избежать нежелательного системного действия.

Препарат показал эффективность, безвредность и свою перспективность для лечения воспалительных, инфекционных и стрессорных поражений, механических повреждений и ран слизистой оболочки пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки, язв желудка.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии, и касается способа лечения повреждений слизистой оболочки (СО) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Для этого перорально вводят водный или физиологический раствор интерлейкина-1 (ИЛ-1), содержащий 5×10^-7-5×10^-5 мас.% ИЛ-1. Способ обеспечивает достижение высоких лечебных концентраций препарата непосредственно в очаге поражения, стимуляцию местного иммунитета при отсутствии побочных эффектов. 5 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Способ лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта с помощью препаратов интерлейкина-1, отличающийся тем, что препарат интерлейкина-1 вводят перорально в виде водного раствора, содержащего
5×10^-7-5×10^-5 мас.% ИЛ-1.

2. Способ, отличающийся тем, что препарат интерлейкина-1 вводят в дозе 25-2500 нг/кг веса в течении 1-5 дней.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве препарата интерлейкина-1 используют природный интерлейкин-1.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве препарата интерлейкина-1 используют препарат «Беталейкин».

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве препарата интерлейкина-1 используют рекомбинантный интерлейкин-1 бета.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве препарата используют рекомбинантный интерлейкин-1 альфа.