РАНОЗАЖИВЛЯЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2001 года по МПК A61K38/02 A61K38/20 A61K38/44 A61P31/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам и композициям для лечения хирургических ран, ожогов, повреждений, эрозий, трофических язв, пролежней и т.п., особенно осложненных гнойно-воспалительными процессами.

Известно большое количество препаратов в различных формах, капсулах для перорального применения (трибенозид винизоль эскузан), растворов для пропитки тампонов и салфеток (олазоль, эстерицид, каролитин, облепиховое масло), мазей (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 1982, т.2, с. 46-52, 60, 474, 475, 417, 471; Покрышкин А.В. Олазоль - новое ранозаживляющее средство, Э-И Минмедпром, 1982, 36).

Недостатком препаратов для внутреннего применения является наличие побочных эффектов, недостаточная эффективность, что вынуждает использовать их, как правило, в комплексной терапии.

Известен также препарат солкосерил (Лекарственные средства. Каталог, Фирма Алкалоид, Скопье, Югославия), представляющий собой взвесь экстракта крови крупного рогатого скота, состав которой не раскрывается, в масляной основе. Солкосерил в мазевой форме рекомендован при появлении свежих грануляций на поверхности язвы при облитерирующих заболеваниях артерий, трофических язвах, ожогах и т.п.

Недостатком препарата является невысокая эффективность, при тяжелых заболеваниях препарат заменяют на антибиотики, так как добавление антибиотиков в солкосериловые мази и желе не рекомендуется.

Известны мазевые ранозаживляющие композиции на различных жировых основах - жирах, ланолине, восках, вазелине, солидоле и др. (Коган Г.Я. Технология лекарственных форм, Медгиз, 1992, с. 209-244). Как правило, мази содержат активное начало и жировую основу. Так, бороментоловая мазь включает 0,3% ментола, 5% борной кислоты и 54,5% вазелина, мазь Поставского - в качестве активного начала - 17,3% стрептоцида, 7,5% альбуцида, а в качестве мазевой основы - 25% бентонита и 50% воды (Справочник фармацевта, М., Медицина, 1973, с.63).

Недостатком указанных мазей является невысокая эффективность для лечения гнойных ран.

Наиболее близкими аналогами к заявляемому по составу и достигаемому эффекту являются препараты, применяемые в виде геля, например водные растворы интерлейкина-1 с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ), применяются путем пропитки ими салфеток (акц. заявка PCT 89/05653, 1989, кл. A 61 K 37/02).

Недостатком этих препаратов является большой расход дорогих медикаментов, ограниченность применения для патологий, требующих длительного лечения и осложненных обширными гнойными выделениями.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, являлось создание ранозаживляющего препарата, обладающего повышенной эффективностью. Эта задача решается использованием в качестве активного начала смеси интерлейкина-1 и супероксиддисмутазы (СОД) при следующем соотношении ингредиентов:
интерлейкин-1 - 0.01-10 нг/мл
супероксиддисмутаза - 0.03-0.3 мас.%
водосодержащая основа - остальное
В качестве основы композиция содержит воду или водосодержащие растворы, например физраствор или раствор полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 400-1500 Д и т.п..

Использование меньших доз ИЛ-1 не позволяет получить лечебный эффект, при использовании меньших доз СОД повышаются сроки лечения ран из-за невозможности полной компенсации повреждающего действия атомарного кислорода. Введение более высоких концентраций ИЛ-1 и СОД возможно, но не целесообразно по экономическим соображениям.

Методика получения композиции состоит из двух этапов. На первом этапе получают композицию на основе воды или физраствора. Для этого готовят раствор СОД в физиологическом растворе с заданной расчетной концентрацией действующего начала, например, а затем к нему добавляется в нужных количествах концентрированный раствор субстанции рекомбинантного ИЛ-1 человека до достижения требуемых концентраций. В связи с относительно невысокой стабильностью водных растворов СОД и ИЛ-1 композицию делают не более чем за сутки до использования или дальнейшей переработки или вводят в нее стабилизирующие добавки, например человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) до 1%. При необходимости на следующем этапе к полученному по вышеописанной методике раствору добавляют водорастворимый полимер или его водный раствор.

Особенностями новой композиции является создание условий для сочетания возможности регуляции воспалительной реакции с помощью интерлейкина-1 (ИЛ-1) и обеспечения защитных функций ткани с помощью СОД. ИЛ-1 при этом стимулирует функции лейкоцитов, эндотелия и системы свертывания крови, вызывает активацию нейтрофильных гранулоцитов, необходимую для проявления их защитных противоинфекционных функций в полном объеме, вызывает их активацию, усиливая хемотаксис, дегрануляцию и продукцию супероксиданиона, стимулирует функциональную активность Т- и В-лимфоцитов, пролиферацию фибробластов и метаболизм соединительной ткани.

Продуцирование супероксиданиона имеет решающее значение в борьбе с внедрившимися микроорганизмами, однако, приводит в случае гиперактивации лейкоцитов к нежелательным последствиям, связанным с повреждением собственных тканей свободными формами кислорода.

Использование СОД позволяет нейтрализовать образующиеся при этом супероксидные радикалы. Однако для эффективной работы системы в целом требовалось создать композицию, которая обеспечивала бы устойчивое сосуществование обоих компонентов активного начала при одновременной возможности их проникновения в рану через поверхностные слои выделений.

В ходе исследований было установлено, что в патентуемом диапазоне концентраций ИЛ-1 и СОД уже через сутки образуют в водных растворах в заметных количествах относительно устойчивый комплекс, который несколько снижает эффективность СОД и ИЛ-1 по сравнению с индивидуальным введением ингредиентов. Однако указанное понижение активности компенсируется положительным воздействием препарата на ранозаживляющие процессы в целом.

В основной массе комплекс либо распадается на компоненты при введении в организм, либо позволяет входящим в него компонентам в достаточной степени осуществлять необходимые регуляторные функции. При этом реакционная среда влияет на абсолютную активность СОД, но не на общий ход событий. Для повышения активности и стабильности комплекса целесообразно наличие в водном растворе добавок водорастворимых полимеров типа ПЭО.

Пример 1. Приготовление препаратов ИЛ-1 и СОД
Для приготовления препаратов к 100 мл раствора СОД в физиологическом растворе с концентрацией действующего начала 100 ед/мл добавляли в нужных количествах концентрированный раствор субстанции рекомбинантного ИЛ-1 человека до достижения требуемых концентраций. Полученные препараты подвергали стерилизующей фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и использовали для тестирования на присутствие ферментативной активности СОД и биологической активности ИЛ-1 в культурах клеток. Растворы готовили не позднее, чем за 1 сутки до постановки биологических экспериментов. Характеристика используемых растворов приведена в таблице 1 (препараты 5 и 9 содержали дополнительно 0.3 и 1.0% ЧСА).

Влияние препаратов ИЛ-1 и СОД на пролиферацию лимфоцитов тимуса мышей проводили в тесте индукции бластной трансформации лимфоцитов в варианте микрометода в 96-ти луночных микропланшетах. Для получения лимфоцитов тимуса мышей линии СВА забивали методом цервикальной дислокации. В асептических условиях извлекали у них тимусы, которые затем гомогенизировали в среде Игла с использованием игл различного диаметра. Полученную взвесь тимоцитов ресуспендировали в 1 мл среды Игла и подсчитывали в камере Горяева. Средой Игла, содержащей 4% фетальной сыворотки, доводили концентрацию клеток до 10 млн/мл. В лунки 96-луночного планшета для культивирования вносили исследуемые разведения препаратов ИЛ-1 и СОД и по 100 мкл приготовленной ранее взвеси тимоцитов. В культуры вносили также препарат конканавалина A в дозе 0,1 мкг/мл в качестве индуктора пролиферации. Культивирование продолжайтесь в течение 72 часов в CO2-инкубаторе. За 18 часов до окончания культивирования во все лунки планшета вносили по 40 μБк ³H-тимидина в объеме 10 мкл. По окончании культивирования тимоцитарные культуры из всех лунок планшета переносили с помощью харвестера на фильтры, которые затем высушивали. Фильтры помещали в виалы с сцинтилляционной жидкостью и определяли включение ³H-тимидина тимоцитами каждой культуры, используя для этого сцинтилляционный счетчик (RACKBETA 1217). Данные по каждым трем параллельным культурам усредняли и получали данные зависимости уровня включения ³H-тимидина от разведений препаратов.

В исследованиях использовали донорскую кровь, получаемую путем венопункции, в качестве стабилизатора крови использовали гепарин в концентрации 20 ед/мл. Хемилюминесценцию, усиленную люминолом, оценивали в цельной крови на люминометре фирмы LKB модель 1251. Определение производили следующим образом: в кювету для хемилюминесценции наливали по 0,1 мл цельной крови, добавляли 0.6 мл забуференного физиологического раствора (pH 7.2), 0,1 мл исследуемого препарата, 0,2 мл раствора люминола в концентрации 10^-5 М. В случае если измеряли индуцированную хемилюминесценцию, в кювету добавляли индуктор в объеме 0,1 мл. В качестве индуктора использовании форболмиристат ацетат (ФМА), являющимся наиболее сильным активатором окислительно-восстановительных процессов в фагоцитирующих клетках. Хемилюминесценцию измеряли в программе "Lumina" в течение 30 минут по двум параметрам: светосумме в мв/мин и максимуме хемилюминесценции в мв.

Генерацию супероксидрадикала оценивали по активности процесса восстановления солей тетразолия. Тест проводили с нейтрофильной фракцией лейкоцитов. Выделение нейтрофилов осуществляли по стандартной методике, описанной Boyum, используя градиент фиколл-верографина (уд. плотность 1078), с последующим гипотоническим шоком. Реакцию проводили в 96-луночных платах (Costar) в следующей последовательности: 0,1 мл клеточной взвеси нейтрофилов в концентрации 2•10 в 0,1% растворе тетразолия нитро-синего в забуференном физиологическом растворе (pH 7,2) наслаивали в платы, затем добавляли по 0,1 мл исследуемого препарата в соответствующих концентрациях, помещали в термостат на 1 час, после чего удаляли надосадочную жидкость, монослой клеток высушивали, фиксировали метанолом. Элюцию гранул формазана, образовавшихся в результате реакции, проводили смесью щелочи и диметилсульфоксида. Результат реакции учитывали на приборе Мультискан (фирма BioRad) при длине волны 595 нм. Результат реакции оценивали в единицах экстинции. Если действие препарата изучали на фоне индуктора, то в качестве индуктора использовали опсонизированный зимозан.

Результаты проведенных исследований по влиянию комбинированного препарата на пролиферацию тимоцитов приведены в таблице 2.

Согласно приведенным данным в составе комплексных препаратов происходит изменение биологической активности ИЛ-1, а именно снижение его способности активировать клетки, участвующие в воспалительной реакции, что свидетельствует о взаимодействии ингредиентов между собой.

Окислительно-восстановительный потенциал клеток оценивали параллельно в двух тестах: хемилюминесценции цельной крови с люминолом, позволяющей определять окислительный взрыв суммарно, учитывая весь спектр кислородных радикалов, генерируемых активированными фагоцитами, и в тесте восстановления тетразолия нитросинего, дающего возможность измерить уровень продукции только супероксиданиона.

Исследование влияния комбинированного препарата на генерацию супероксидрадикала было проведено в 3-х опытах. При этом оценивали влияние препарата как на спонтанный уровень реакции, так и на клетки, активированные опсонизированным зимозаном. Результаты реакции представлены в таблице 3.

Как следует из результатов экспериментов, представленных в таблице 3, комбинированная форма препарата, включающая интерлейкин-1 и СОД в концентрации 0,3%, оказывают ингибирующий эффект на спонтанную и стимулированную зимозаном продукцию супероксидрадикала. Препарат, содержащий физиологическую концентрацию СОД - 0,03%, не оказывал влияния на генерацию кислородных радикалов.

Было также исследовано влияние комбинированных препаратов на люминолзависимую хемилюминесценцию цельной крови. Препараты были исследованы в тех же самых концентрациях, что и в предыдущих экспериментах.

Как следует из таблицы 4, комбинированный препарат также оказывал ингибирующее влияние на хемилюминесценцию цельной крови. Причем, как и в предыдущей серии экспериментов, наиболее выраженный ингибирующий эффект проявлялся при добавлении препаратов, содержащих 0,3% супероксиддисмутазы. Супероксиддисмутаза без добавления интерлейкина-1 в этих же концентрациях не вызывала снижения продукции кислородных радикалов.

В результате проведенных экспериментов было показано, что заявляемый препарат вызывал подавление продукции кислородных радикалов, выявляемых двумя тестами: хемилюминесценцией и восстановлением солей тетразолия, что делает его потенциально перспективным для лечения острых воспалительных процессов.

Пример 2 Получение и свойства препарата на основе ПЭО.

50 г ПЭО со средней молекулярной массой 400 Д и 50 г ПЭО со средней молекулярной массой 1500 Д тщательно перемешивали и к части полученной массы добавляли 0,5 мл препарата N 6, изготовленного по методике примера 1, до содержания СОД - 3%, ИЛ-1 - 1 нг/мл, а также для контроля вместо препарата N 6 растворы, содержащие отдельно эквивалентные количества ИЛ-1 или СОД.

Полученные препараты исследовании на их воздействие на течение экспериментального ожога у крыс. При проведении опытов использовали белых беспородных крыс-самцов массой 200-220 г. Под наркозом смесью калипсола и дроперидола (70 и 1 мг/кг веса соответственно) моделировании ожоги кожи горячей водой. Для этого у животных на спине срезали шерсть ножницами и выбривали остатки волос с помощью бритвы. Ожоги вызывали прикладыванием пробирки с горячей водой (t^o = 100^oC) на 15 секунд. На спине у крыс наносили 4 участка ожога диаметром 1 см. На каждый из них наносили изучаемые препараты: на контрольный участок - полиэтиленоксидную (ПЭО) основу, на опытные: - ПЭО-основу с интерлейкином-1-бета, ПЭО-основу с супероксиддисмутазой (СОД) и ПЭО-основу со смесью интерлейкина-1-бета и супероксиддисмутазы.

Ожоговые раны накрывали марлевыми салфетками, которые подшивали к коже шелковыми швами. Смену мазевых препаратов осуществляли ежедневно. Импеданс кожи определяли на опытных и контрольных участках кожи на частотах 50,100 и 1000 Гц до ожога, непосредственно после ожога, спустя 1,3, 7 и 10 суток после ожога. Вычисляли коэффициент поляризации как отношение импеданса на низкой частоте (50 Гц) к его значению на высокой (1000 Гц).

Полученные в процессе измерения значения коэффициента поляризации (КП) приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы, воздействие горячей воды привело к гибели поверхностных слоев кожи, что в свою очередь обусловило резкое снижение коэффициента поляризации до 1,784.

В контрольной группе этот показатель в последующем продолжают снижаться (до 1,33±0,17 на 7-е сутки) и оставался самым низким по сравнению с другими точками к завершению опыта (на 10-е сутки составлял 1.59±0.36). По-видимому, это было связано с тем, что полизтиленоксид-1500 обладает выраженными осмотическими свойствами и обезвоживает ткань.

В случае применение интерлейкина-1 КП оставался на низком уровне и только к 10-м суткам поднялся до уровня 1,96±0,11.

В случае применения супероксиддисмутазы (а также смеси интерлейкина-1 + СОД) отмечены наиболее высокие значения КП, особенно в поздние сроки.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что выраженным лечебным эффектом обладают два препарата: СОД и комбинированный препарат СОД+ИЛ-1, что подтверждается величинами коэффициента поляризации кожи крыс. Однако при использовании комбинированного препарата, содержащего СОД+ИЛ-1, на раневой поверхности значительно быстрее формировался многослойный эпителий, чем при использовании препаратов, содержащих только СОД или только ИЛ-1. Это позволяет сделать заключение, что именно комбинированный препарат, содержащий СОД и ИЛ-1 в предлагаемых концентрациях, является наиболее перспективной лекарственной формой.

Применение комплексного препарата в виде ежедневных аппликаций на область ожога существенно улучшала динамику заживления очага поражения по сравнению с контрольной группой животных. Более того комбинированный препарат был значительно эффективнее препаратов ИЛ-1 или СОД, применявшихся для лечения данной формы ожога по отдельности.

Согласно полученным результатам применение комбинированного препарата существенно сокращает сроки отторжения струпа, улучшает эпителизацию и способствует меньшей деструкции тканей и преобладанию репаративных процессов над некротическими по сравнению с контролем и препаратами, содержащими только ИЛ-1 пли СОД.

Пример З. Влияние природы и концентрации отдельных компонентов на эффективность композиции.

По методике примера 2 были получены препараты с различными концентрациями компонентов.

Эффективность препаратов определялась по методике, приведенной в примере 2, согласно изменениям значений поляризации кожи крыс на 10 день после нанесения ожога и применения препаратов.

Полученные результаты приведены в таблице 6.

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам и композициям для лечения хирургических ран, ожогов, повреждений, эрозий, трофических язв, пролежней и т.п., особенно осложненных гнойно-воспалительными процессами. Изобретение заключается в том, что композиция состоит из основы и активного начала, содержащего интерлейкин-1, и дополнительно содержит супероксиддисмутазу. В качестве основы композиция содержит воду, физраствор, водные растворы полиэтиленоксида. Изобретение обеспечивает высокую эффективность и может применяться для лечения широкого круга заболеваний. 5 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Ранозаживляющая композиция, состоящая из основы и активного начала, содержащего интерлейкин-1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит супероксиддисмутазу при следующем соотношении ингредиентов:
Интерлейкин-1 - 0,01-10 нг/мл
Супероксиддисмутаза - 0,03-0,3 мас.%
Основа - Остальное
2. Ранозаживляющая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве основы она содержит водосодержащие растворы. 3. Ранозаживляющая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве водосодержащих растворов она содержит воду. 4. Ранозаживляющая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве водосодержащих растворов она содержит физраствор. 5. Ранозаживляющая композиция по пп.1-4, отличающаяся тем, что в качестве водосодержащих растворов она содержит водные растворы полиэтиленоксида с молекулярной массой 400-1500 Д. 6. Ранозаживляющая композиция по пп.1-4, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит альбумин до 1 мас.%.