СПОСОБЫ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ МАЛЯРИИ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/02 A61K39/05 G01N33/53 

Ссылки на относящиеся к данному вопросу заявки

Данная заявка основывается на и использует преимущества первоначальной заявки США №60/420,265, поданной 23 октября 2002 г., (досье поверенного №4012.6001) и первоначальной заявки США №60/447,026, поданной 13 февраля 2003 г., (досье поверенного №4012.6002). Все описание этих предварительных заявок взято за основу и включено сюда в виде ссылки.

Введение

Малярия является одной из самых больших проблем общественного здравоохранения в тропиках и субтропиках. Каждый год от 300 до 500 миллионов людей заражаются инфекциями с плазмодиями, и до 2,7 миллионов умирают от малярии в развивающемся мире (110). Plasmodium falciparum являются видами плазмодий, ответственными за большинство смертей, вызванных малярией.

Цикл жизни Р.falciparum протекает в четырех отдельных стадиях, три из которых происходят в теле человека. См. общую информацию в 115. На первой стадии комар, переносящий инфекционные спорозоиты в своих слюнных железах, получает питание кровью от человека и, осуществляя это, переносит эти спорозоиты в кровяной поток человека. Очутившись в паренхимальных клетках печени, спорозоиты размножаются и образуют мерозоиты. На второй стадии мерозоиты передвигаются по кровяному потоку, инфицируя красные кровяные клетки (ККК). Как только ККК заполняется мерозоитами, она разрывается, высвобождая потомство, которое инфицирует новые ККК. Анемия является обычным симптомом на данной стадии инфекции. Постепенно некоторые из этих ККК создадут мужские и женские гаметоциты (третья стадия). На заключительной стадии неинфицированный комар кусает инфицированного человека, впитывая гаметоциты. В комаре оплодотворение женского гаметоцита постепенно приводит к производству инфицированных спорозоитов, тем самым завершая цикл.

Когда такой патоген как Р.falciparum проникает в тело человека, тело откликается активацией иммунной системы. Сначала происходит обобщенный отклик, за которым следует патогенно-специфический отклик. Патогенно-специфический отклик нацелен на антигены, уникальные для проникающего патогена. Два основных вида патогенно-специфического отклика являются клеточным и гуморальным. Т клетки CD8⁺ и CD4⁺ участвуют в клеточном иммунном отклике. В частности, Т клетки CD8⁺ производят такие цитокины как гамма-интерферон (IFN-γ), который имеет разнообразные стимулирующие воздействия на другие компоненты иммунной системы, такие как макрофаги. Особый класс Т клеток CD⁸⁺ цитотоксические Т лимфоциты (ЦТЛ), специально убивают инфицированные клетки, которые осуществляют экспрессию патогенных антигенов на их поверхности. В отличие от этого Т клетки CD4⁺ или Т клетки-помощники способствуют развитию ЦТЛ и вызывают деление В клеток и, в конечном итоге, производят антитела. Т клетки-помощники могут быть подразделены на два подвида Т клетки: Т_н1 и Т_н2 CD4⁺, которые идентифицируются в соответствии с профилем цитокинов, которые они производят. Вторая группа патогенно-специфического иммунного отклика состоит из гуморального отклика, в котором В клетки воспроизводятся, дифференцируются и постепенно производят антитела, которые связываются непосредственно с патогенами. Антитела особенно полезны для нанесения покрытия на патоген, не связанный с какой-либо клеткой-хозяином. Фагоциты, такие как макрофаги, затем поглощают покрытые антителом патогены.

В контексте малярийной инфекции различные виды патогенно-специфического отклика являются наиболее эффективными на определенных стадиях цикла жизни Р.falciparum. Когда инфицированные спорозоиты перемещаются в печень и поступают в клетки печени, спорозоиты становятся внутриклеточными патогенами, проводя мало времени за пределами инфицированных клеток. На данной стадии Т клетки CD8⁺ и Т клетки CD4⁺ являются наиболее важными, так как эти Т клетки и их цитокиновые продукты, такие как IFN-γ, в основном отвечают за уничтожение инфицированных клеток-хозяев. Значительные данные из малярийной программы Военно-морского медицинского исследовательского центра (NMRC) и других лабораторий указывают, что устранение внутриклеточных печеночных паразитов при мышиной малярии зависит от отклика Т клеток CD8⁺, направленного против пептидов, выделяемых паразитами печеночной стадии (45). Истощение Т клеток CD8⁺ снижает защиту от вызова паразитов (27, 31, 90, 93, 108), и адаптивная передача Т клеток CD8⁺ не подвергавшимся действию инфекции животным обеспечивает защиту (56, 85, 87, 109).

Вакцины ДНК вызывают опосредованные клетками иммунные отклики, включая отклики антиген-специфических цитотоксических Т лимфоцитов (ЦТЛ) CD8⁺ и отклики Т клеток CD4⁺ со смещением Тh1, которые являются основными механизмами защиты от внутриклеточных патогенов и опухолей (6, 11, 45, 63, 104, 106). Однако до сих пор вакцины ДНК показывали себя недостаточно оптимально для индуцирования защитного иммунного отклика в человеке.

В отличие от этого, когда малярийная инфекция достигает второй стадии и заражает ККК, инфицированные мерозоиты не только воспроизводятся внутри ККК, они свободно циркулируют в кровяном потоке. Антитела являются наиболее эффективными при лечении этой стадии инфекции по двум причинам. Во-первых, ЦТЛ нужны инфицированные клетки-хозяева для создания антигенов на специальном белке, называемом главный комплекс гистосовместимости - I (MHC-I). ККК не осуществляют экспрессию MHC-I, тем самым снижая эффективность ЦТЛ. Во-вторых, как обсуждалось ранее, антитела являются посредниками в фагоцитозе патогенов, не связанном с клетками-хозяевами. Таким образом, на второй стадии инфекции, как В клетки, так и Т клетки CD4⁺, которые стимулируют В клетки, являются важными для победы над инфекцией.

Сложность иммунного отклика человека на Р.falciparum, а также многоэтапный цикл жизни паразитов с зависящей от каждого этапа экспрессией белков, вносят вклад в трудность разработки вакцины против Р.falciparum. Тем не менее, необходимость в вакцине от малярии сохраняется.

Стадия спорозоитов Р.falciparum была идентифицирована как потенциальная мишень для вакцины от малярии. Основной поверхностный белок спорозоита известен как белок циркумспорозоит (белок CS). Был клонирован белок из штамма 7G8, он был выделен и секвентирован (21). Он характеризуется тем, что имеет центральную иммунодоминантную зону повтора, включающую тетрапептид Asn-Ala-Asn-Pro, повторяющийся 37 раз, но перемежающийся с четырьмя более мелкими повторами Asn-Val-Asp-Рrо. В других штаммах число больших и малых повторов колеблется. Так же, как и их относительная позиция. Эта центральная часть примыкает к N и С-терминальной части, состоящей из неповторяющихся последовательностей аминокислот, обозначаемых как бесповторная часть белка CS.

Основанная на ДНК вакцина, содержащая плазмид, который производит экспрессию гена циркуспорозоита Р.falciparum (PƒCSP) была разработана компанией Викал Инк., Сан Дьего, Калифорния, и Военно-морским медицинским исследовательским центром (47). Вакцина состояла из «оголенной» (депротеинизированной) ДНК в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при концентрации 2500 мкг на 1 мл. Плазмид содержал ген нормальной длины, кодирующий весь ген PƒCSP, с экспрессией, контролируемой промотером/геном-усилителем гена CMV IE, гена CMV IE нетранслированной области 5' и транскрипционным терминатором гена гормона бычьего роста (64). Чтобы усилить экспрессию и секрецию антигена в клетках млекопитающих, последовательность, кодирующая пептид, лидер из белка активатора плазминогена человеческой ткани (hTPA) добавлялся к 5' концу кодирующей последовательности. Таким образом, две открытые рамки считывания последовательности, содержащиеся в PƒCSP, кодируют белок сопротивляемости канамицину и hTPA лидер/слитый белок PƒCSP (40). Плазмид PƒCSP не содержит известных вирусных или онкогенных белковых кодирующих последовательностей. Плазмид содержит 6261 базовых пар нуклеотидов и имеет молекулярный вес 4,07×10⁶ gmu¹ (¹gmu - грамм-молекулярная единица), предположив, что средняя базовая пара ДНК составляет 650 gmu.

Плазмид ДНК PƒCSP был сконструирован, используя сегменты клонированной ДНК, которые были получены из очищенных плазмидов, используя стандартные приемы молекулярной генетики. Плазмид был получен в бактериальной (E.coli) клеточной структуре с канамициновой селекционной средой. После ферментации бактериальных клеток плазмид ДНК был очищен.

Предклинические иммуногенетические исследования вакцины ДНК PƒCSP были произведены в военно-медицинском исследовательском центре перед началом клинических испытаний. Специфически плазмид PƒCSP был постепенно трансфецирован в культурные клетки млекопитающих, после чего экспрессия антигена была оценена с помощью иммуно-блот анализа. Данный плазмид также тестировался на его способность индуцировать антиген-специфическое антитело и отклики ЦТЛ в мышах и не человекоподобных приматах (40, 105). Исследования на мышиной модели продемонстрировали индуцирование антиген-специфических ЦТЛ и отклики антител после иммунизации плазмидом ДНК (30). Исследования далее установили, что внутримышечный (IM) путь иммунизации был оптимальным для индуцирования иммунного отклика Тh1 у CD8⁺, как отмечалось в других системах (30). В дополнение, последующие исследования показали, что все шесть макак-резус, иммунизированных по внутримышечному пути с помощью плазмида PƒCSP, либо отдельно, либо в комбинации с до четырех других плазмидов, кодирующих другие белки Р.falciparum предэритроцидной стадии печени, имели детектируемые антиген-специфические отклики ЦТЛ и/или антитела (106).

Перед использованием в клинических испытаниях были проведены обширные предклинические исследования безопасности. Эти исследования включали: 1) изучение распределения в ткани мыши плазмида ДНК, введенного либо внутривенно (IV), либо внутримышечно (IM); 2) исследования безопасности дозы повторения на мышах и кроликах; и 3) исследование интеграции плазмида ДНК на мышах (67, 75). Эти исследование обобщены ниже.

Исследования распределения плазмида: Паркер и др. оценили распределение плазмида в различных тканях мыши (57). Мыши внутривенно или внутримышечно вводилась единственная доза плазмида PƒCSP, которая была в 25 раз выше наибольшей дозы в мг/кг, рекомендованной для человека. Производился сбор тканей и использовалась полимеразно-цепьевая реакция для оценки присутствия плазмида ДНК в следующие временные отрезки: 1 час, 2 дня и 4 недели после приема после внутривенного введения и через 2 дня, 4 недели и 8 недель после внутримышечного введения. Плазмид ДНК был обнаружен распределенным по всем тканям через 1 час после внутримышечного введения. Через 2 дня после внутримышечного введения плазмид обнаруживался только в костном мозге, крови и точке введения, с наивысшими уровнями в точке введения. Плазмид ДНК детектировался только в точке введения после 1 недели после внутримышечного введения. После внутривенного введения плазмид ДНК PƒCSP обнаруживался распределенным в низких уровнях по всем тканям, за исключением половых желез (гонад) и мозга. Через четыре недели после внутривенного введения плазмид ДНК обнаруживался только в легком животного.

Изучение безопасности дозы повтора: Паркер и др. также рассмотрели безопасность введения повторных доз вакцины на мышах и кроликах (75). В исследовании безопасности дозы повтора на мышах животные получали 8 повторных внутримышечных вливания плазмида ДНК PƒCSP в течение 28-дневного периода при дозах в 1,0 мкг, 10 мкг и 100 мкг (кумулятивная доза эквивалентна 5-500 раз предлагаемой дозы для человека на основе мг/кг). Не было свидетельства ненормальной гематологии, анормальной гистопатологии или индуцирования антинуклеиновых антител или антител в двухцепочечной ДНК. При исследовании безопасности повторных доз на кроликах животные получали шесть еженедельных инъекций плазмида внутримышечно при дозах 150 мкг и 450 мкг. Вновь, как и в исследованиях на мышах, не было свидетельства анормальной гематологии или сывороточной химии, аномальной гистопатологии или индуцирования атинуклеиновых антител или антител в двухцепочечной ДНК. Таким образом, исследования Паркера показали, что плазмид PƒCSP хорошо распределяется по тканям хозяина, что плазмид сохранялся в некоторых из этих тканях в течение длительных периодов, и что плазмид безопасен для использования на человеке, как показано отсутствием отрицательной реакции при его использовании на добровольце.

Интеграционные исследования: Мартин и др. произвели оценку, интегрирует ли плазмид PƒCSP в хромосомной ДНК хозяина (67). Отдельная доза плазмида ДНК была введена каждой мыши, и ткани анализировались спустя 30 и 60 дней после приема с помощью анализа полимеразно-цепьевой реакции до чувствительности 1-10 копий на микрограмм ДНК. В целом эти исследования не представили свидетельства интеграции плазмида и дали основания полагать, что если и существует какая-либо интеграция плазмида ДНК в геномном ДНК, то она происходит на очень низком уровне, в несколько тысяч раз ниже, чем ожидается от спонтанной мутации.

Как только исследователи уточнили безопасность вакцины PƒCSP, Центр военно-морских исследований провел клинические испытания фазы I. При первом испытании здоровый взрослый, не подвергнутый воздействию малярии, доброволец принимал вакцину ДНК PƒCSP между 1997 и 1998 гг. (33, 62, 105, 106). Было привлечено в целом 20 добровольцев и 5 добровольцев было приписано к каждой из четырех групп доз: 20 мкг, 100 мк, 500 мкг и 2500 мкг, при этом 3 дозы давались с интервалом в один месяц. Как описывается Ли и др., все дозы были хорошо переносимыми, без эпизодов сильного или серьезного неблагоприятного влияния (62). Было четыре умеренно неблагоприятных события; все были не связаны с приемом вакцины. Наиболее общей жалобой была боль и болезненность в месте введения. Это явление было слабым и продолжалось мене 48 часов и не требовало лечения. Ни у одного из добровольцев не было никаких значительных биохимических аномалий сыворотки (крови).

Ни у одного из 20 субъектов не было индуцирования антител анти-двухцепочечного ДНК или увеличения титров AHA (антинуклеарного антитела) по сравнению с базовым уровнем. Ванг и др. показали, что ни у одного из добровольцев не развились антитела к PƒCSP в соответствии с оценкой непрямым флуоресцентным тестированием антител (IFAT) относительно высушенных на воздухе спорозоитов и связанным с ферментами иммуносорбентным анализом (ELISA) в отношении рекомбинантных и синтетических пептидов. Однако у 11 из 20 добровольцев имелась специфическая для антигена, генетически ограниченная активность ЦТЛ. В частности отклики ЦТЛ зависели от Т клетки CD8⁺, были специфичны по отношению к пептидам и генетически ограничены по главному комплексу гистосовместимости человека, так как имело место мало или отсутствовало распознавание аутологичных мишеней, которые были инкубированы с контрольным пептидом, или несогласованных мишеней класса I по главному комплексу гистосовместимости человека, которые были инкубированы вместе с специфическим пептидом. В дополнение, индуцированные ДНК ЦТЛ были генетически ограничены множественными аллелями главного комплекса гистосовместимости человека (105, 107). Позитивность ЦТЛ была связана с дозой. У оставшихся 9 добровольцев ЦТЛ не были детектированы при любых анализах после каждой иммунизации.

Во втором клиническом испытании, начатом в апреле 1999 года, 14 здоровых взрослых добровольцев были иммунизированы через 0, 4 и 8 недель вакциной ДНК PƒCSP по трем различным путям: обычной иглой внутримышечно (IM), устройством Biojector^R IM и Biojector^R IM (70% дозы) плюс подкожно (ID) (30% дозы). Biojector^R IM является устройством для безыгольного впрыскивания. С учетом небольшого размера исследования разнообразие главного комплекса гистосовместимости человека ограничивалось наиболее обычным классом, классом 1, главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) данного подтипа в данной популяции, HLA 2 А2, чтобы дать возможность проведения межгрупповых сравнений генетически ограниченного отклика ЦТЛ. Десять из добровольцев, которые участвовали в данном исследовании, впоследствии участвовали в дополнительном испытании, в котором использовались способы изобретения. Это испытание и его результат описаны ниже в разделе «Примеры».

В целом, вакцина была безопасной и хорошо переносимой. Добровольцы не испытывали каких-либо тяжелых или серьезных побочных эффектов (АЕ), связанных с вакциной. Никто из добровольцев не испытывал серьезных лабораторных аномалий, связанных с приемом вакцины PƒCSP любым из трех путей (33).

Что касается иммунного отклика на вакцину, то ни один из добровольцев не выработал антител к PƒCSP, как это оценивалось непрямым флуоресцентным испытанием антител (IFAT) относительно высушенных на воздухе спорозоитов и связанным с ферментами иммуносорбентным анализом (ELISA) в отношении рекомбинантных и синтетических пептидов (107). Отсутствие специфических для PƒCSP антител было несколько удивительно потому, что как инъекционное устройство Biojector, так и подкожный путь иммунизации, связывались с улучшенным производством антител в моделях на животных (1, 37, 62). Отклик Т клеток измерялся с помощью гамма-интерферона (IFN-γ) в иммуноферментных спот-анализах (ELISPOT). При выполнении этих анализов использовались пептиды, включающие эпитопы белка CSP, кодируемые плазмидом PƒCSP.

Все четыре добровольца в игловой внутримышечной группе реагировали на 7/9 пептидов в 17,6% (26/148) анализов. Все пять добровольцев в внутримышечной группе Biojector реагировали на 9/9 пептидов в 26,5% (49/185) анализов. Четыре из пяти добровольцев в внутримышечной/подкожной группе Biojector реагировали на 7/9 пептидов в 17,3% (32/185) анализов. Восемь из 14 добровольцев имели детектируемый отклик ЦТЛ. Из этих восьми два были в игловой внутримышечной группе (реагировавшей на 4/7 пептидов в целом из 5/126 анализов), три были в внутримышечной группе Biojector (реагировавшей на 6/8 пептидов в целом из 11/168 анализов) и три были в внутримышечной/подкожной группе Biojector (реагировавшей на 6/6 пептидов в целом из 14/162 анализов) (107). В общем, в этом испытании было установлено, что внутримышечный путь прививки Biojector был наиболее эффективным для индуцирования специфического для антигена отклика IFN-γ, а внутримышечный и внутримышечный/подкожный путь Biojector был наиболее эффективен для индуцирования специфического для антигена отклика ЦТЛ.

В сумме, эти два клинических испытания показали, что полинуклеотидная вакцина PƒCSP может выявлять специфический для антигена, генетически ограниченный отклик Т клетки CD8⁺, измеряемый специфической для пептида, генетически ограниченной зависящей от Т клетки CD8⁺ активностью ЦТЛ и производством гамма-интерферона (IFN-γ) (105, 107). Добровольцы из второго клинического испытания при тестировании через год после приема последней дозы полинуклеотидной вакцины PƒCSP не смогли продемонстрировать какого-либо специфического для антигена отклика Т клетки CD8⁺, измеренного выше.

Как обсуждалось выше, в дополнение к откликам Т клеток CD8⁺ антитела против любого пептида белка PƒCSP также играют важную роль в контролировании малярийных инфекций (1, 78, 99). Хотя большинство реципиентов вакцины ДНК PƒCSP развивали специфический для антигена отклик Т клеток CD8⁺, ни один не имел специфических для анти-CSP антител. В отличие от этого исследователи показали, что RTS,S могут вызвать сильные отклики антител на белок циркумспорозоита (CSP) (53, 99, 100). RTS,S также является сильным стимулятором клеточного и гуморального иммунитета типа ТН-1, при этом специфические для RTS,S отклики Т клетки CD4⁺ преобладающе фокусировались на Th2R, иммунодоминантном полиморфном регионе (61).

Прием 2 или 3 доз RTS,S в среднем защищал в среднем 44% из более 60 добровольцев, имеющих провокационную пробу Р.falciparum через 2-3 недели после последней иммунизации (8, 54, 99) и защищал 70% полуиммунных гамбийцев два месяца после последней иммунизации (8). Однако эта защита имеет короткий срок (8, 100). Иммунизация с помощью RTS,S индуцирует антитела против PƒCSP и отклики Т клеток CD4⁺, зависящих от IFN-γ, но не было детектировано зависящих от Т клеток CD8⁺ откликов ЦТЛ или гамма-интерферона (IFN-γ) (61).

Изобретение

Настоящее изобретение обеспечивает новый метод вакцинации, который первоначально вызывает иммунный отклик с помощью примирующей вакцины (здесь и далее «примирование» - первичное введение вакцины), включающей полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один первый малярийный антиген, и затем стимулирует первичный отклик с помощью стимулирующей вакцины, включающей, по крайней мере, один полипептид, по крайней мере, один второй малярийный антиген, имеющий, по крайней мере, один эпитоп общий с, по крайней мере, одним первым малярийным антигеном примирующей вакцины. Эта комбинация обеспечивает три важных улучшения по сравнению с существующей антималярийной стратегией вакцинации.

Во-первых, комбинация двух ксеногенных вакцин активирует оба ответвления иммунной системы, Т клетки CD8⁺ CD4⁺ и антитела. Конкретно, основываясь на результатах клинических испытаний с использованием вакцины PƒCSP, ни одна вакцина сама по себе не вызывала значительный иммунный отклик, который бы вызывал Т клетки CD8⁺, CD4⁺ и антитела на белок циркумспорозоита (CSP). Настоящее изобретение обеспечивает этот результат путем комбинирования двух вакцин, тем самым вызывая все три типа откликов. В частности, вакцина PƒCSP примирует отклик Т клетки CD8⁺, a вакцина RTS,S стимулирует данный отклик Т клетки. Так как вакцина RTS,S также вызывает антитела анти-CSP и Т клетки CD4⁺, получаемый иммунный отклик на CSP включает как отклики Т клеток CD8⁺, так и Т клетки CD4⁺, и антител. Мы называем эту общую стратегию вакцинации при примировании одной вакциной и стимулировании другой вакциной, которая имеет, по крайней мере, один совместный эпитоп с примирующей вакциной, стратегией «примирования/стимуляции».

Второе значительное усовершенствование изобретения по сравнению с текущими стратегиями вакцинации заложено в том факте, что в нем используется белковая вакцина для стимуляции отклика Т клеток CD8⁺ у человека. Способ по данному изобретению стимулирует отклики Т клеток путем использования основанной на белке вакцины, которая до того времени считалась неэффективной для стимуляции отклика Т клеток CD8⁺ (61).

В заключение, третьим значительным усовершенствованием по сравнению с настоящими антималярийными стратегиями вакцинации, обеспечиваемым настоящим изобретением, является то, что оно расширяет иммунный отклик двумя путями. Во-первых, более широкий репертуар Т клеток, производящих IFN-γ (Tc1 и Th1), был вызван примированием ДНК/стимулированием RTS,S, так как примирование ДНК инициировало как зависящий от Т клетки CD4⁺ отклик IFN-γ типа 1 CD8⁺ (Tc1), так и отклики типа 1 CD4⁺ (Th1), в то время как только RTS,S индуцировало только зависящие от Т клеток CD4⁺ отклики IFN-γ Th1. Во вторых, при отдельном приеме вакцина PƒCSP примирует некоторую популяцию Т клеток CD8⁺. Подобным же образом, вакцина RTS,S при отдельном приеме примирует некоторую популяцию Т клеток CD4⁺ и В клеток, которые производят некий ряд антител. Однако при объединении получаемый в результате отклик Т клетки CD8⁺ не только покрывает эпитопы, первоначально примированные вакциной PƒCSP, отклик также покрывает дополнительные эпитопы, которые первоначально не идентифицировались после примирования вакциной PƒCSP. Концепция, что белковая вакцина будет стимулировать установленный отклик Т клетки CD8⁺, а также расширит его, является неожиданной в свете того, что известно в данной области о белке.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам иммунизации человека от малярии, включающим этапы: а) примирования иммунного отклика в человеке путем приема примирующей вакцины, включающей полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один антиген малярии; и б) стимуляции примированного иммунного отклика путем последующего приема стимулирующей вакцины, включающей, по крайней мере, один полипептид, который включает, по крайней мере, один антиген малярии, имеющий, по крайней мере, один общий эпитоп с антигеном малярии или антигенами примирующей вакцины, что вызывает как клеточный иммунный отклик, так и гуморальный иммунный отклик на малярию.

В одном примере осуществления данного изобретения примирующая вакцина кодирует тот же полипептид, который присутствует в стимулирующей вакцине. В других примерах осуществления изобретения либо примирующая вакцина кодирует часть малярийного антигена, присутствующего в стимулирующей вакцине, либо полипептид, присутствующий в стимулирующей вакцине, является частью малярийного антигена, кодируемого примирующей вакциной. В другом примере осуществления изобретения вакцины совместно используют, по крайней мере, один эпитоп малярийной Т клетки. В еще одном примере осуществления изобретения вакцины совместно используют, по крайней мере, один малярийный эпитоп Т клетки CD8⁺. В альтернативном примере осуществления изобретения две вакцины совместно используют несколько малярийных эпитопов.

Любой патоген, который вызывает малярию, может быть использован в способе изобретения. В одном примере изобретения патогеном является Р.falciparum. В других примерах осуществления данного изобретения, например, патогеном может быть P.vivax, Р.ovale или P.malariae. Подобным же образом, способ по данному изобретению может использоваться с любым антигеном малярии, выраженным на любой стадии цикла жизни патогена. В одном примере осуществления изобретения примирующая вакцина кодирует, а стимулирующая вакцина включает один или более антигенов, выраженных во время стадии пред ККК патогена, включая печеночную стадию. В еще одном примере осуществления изобретения полинуклеотид примирующей вакцины кодирует, по крайней мере, одну часть циркумспорозоитного белка, а стимулирующая вакцина включает, по крайней мере, одну часть циркумспорозоитного белка, который выражен во время печеночной стадии инфекции. В еще одном примере осуществления изобретения полинуклеотид примирующей вакцины кодирует практически весь циркумспорозоитный белок, а стимулирующая вакцина включает часть циркумспорозоитного (CS) протеина. Минимальная часть белка CS включает, по крайней мере, один эпитоп или несколько эпитопов. В одном специфическом примере осуществления изобретения примирующая вакцина включает PƒCSP, а стимулирующая вакцина включает RTS,S. В другом примере осуществления изобретения примирующая вакцина является вакциной PƒCSP, a стимулирующая вакцина является вакциной RTS,S.

Изобретение далее обеспечивает фармацевтический набор, включающий описанные здесь примирующую и стимулирующую вакцину.

Изобретение далее обеспечивает использование описанных здесь примирующей вакцины и стимулирующей вакцины в подготовке вакцины для профилактики или снижения тяжести малярии.

Таким образом, изобретение обеспечивает использование полинуклеотида, кодирующего, по крайней мере, один антиген малярии, в частности белок CS или его фрагмент в качестве примирующей вакцины и полипетида, включающего, по крайней мере, один малярийный антиген, в частности белок CS или его фрагмент, в качестве стимулирующей вакцины при приготовлении примирующей и стимулирующей вакцины против малярии. В одном конкретном примере осуществления изобретения один полинуклеотид имеет форму плазмида ДНК, предпочтительно осуществляющего экспрессию белка CS полной длины или его фрагмента. Полинуклеотид, кодирующий белок CS или фрагмент, может находиться под контролем ксеногенного промотера, известного в данной области техники. В одном примере осуществления изобретения промотер является промотером HCMV, дополнительно включающим Эксон 1. В одном конкретном примере осуществления изобретения полипептид стимулирующей вакцины является гибридным белком, включающим карбокси-терминальную часть белка CS, например, по крайней мере, 160 аминокислот из карбокси-терминальной части, дополнительно исключая 12 аминокислот из карбокси-терминала. Любой или оба из примирующего и стимулирующего состава могут включать дополнительные малярийные антигены или другие антигены.

В примере осуществления изобретения в соответствии с данным аспектом изобретения примирующая вакцина включает полинуклеотид, кодирующий белок CS полной длины, присутствующий в плазмиде ДНК под контролем ксеногенного промотера, а стимулирующая вакцина включает RTS,S в комбинации с индуцирующим Тh1 адъювантом, в частности адъювантом, который включает QS21, 3D-MPL и масло в водяной эмульсии. Примирующая и стимулирующая вакцины могут быть обеспечены в форме фармацевтического набора.

Изобретение обеспечивает частичную, усиленную или полную защиту человека, который ранее не подвергался воздействию вызывающего малярию патогена или подвергался ему, но не является полностью защищенным. Изобретение может также использоваться для снижения шанса выработки малярийной инфекции, снижения шанса заболевания при инфицировании, снижения тяжести симптомов болезни, таких как лихорадка, когда человек инфицируется, снижения концентрации паразитов в инфицированном человеке или снижения смертности от малярии, когда человек подвержен воздействию малярийных паразитов. В регионах, в которых малярия является эндемичной, даже частичная защита приносит пользу. Например, стратегия лечения вакциной, которая приводит к защите около 30% населения, может иметь значительное воздействие на сообщество.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показан отклик ЦТЛ для каждого положительного субъекта и каждого положительного пептида сразу же после примирования ДНК (фиг.1а), непосредственно перед стимулированием RTS,S (фиг.1b) и затем после стимулирования RTS,S (фиг.1с). Черные полосы представляют образцы, содержащие тестовый пептид и соответствующее представление главного комплекса гистосовместимости. Заштрихованные полоски представляют собой образцы, содержащие контрольный пептид и соответствующее представление главного комплекса гистосовместимости. Полосатые полоски представляют собой образцы, содержащие тестовый пептид без соответствующего представления главного комплекса гистосовместимости (МНС). Свежие мононуклеары периферической крови, взятые после примирования ДНК (а), перед стимулированием (б) или спустя 2 недели после первой (число добровольцев 6=V6) или второй (V2, 3, 8 и 9) дозы RTS,S (с), стимулировались in vitro с помощью ALVAC, производящего экспрессию PƒCSP в течение 7 дней, и были проанализированы в отношении согласованных мишеней класса HLA I (МНС + пептид) или несогласованных мишеней (не-МНС + пептид), инкубированных с экспериментальными 8-10 аминокислотами, выведенными из пептида PƒCSP или контрольного пептида (HLA-A*0201 - ограниченный ген капсидных белков ВИЧ) (МНС + контроль) в 5-часовом анализе выхода хрома. Отклики считались положительными, только если разница процента лизиса клеток мишеней, вытесненных с экспериментальными и контрольными пептидами, была ≥10%

для, по крайней мере, 2 эффекторных клеток в отношении соотношения клеток мишеней (Е:Т). Представлен процент лизиса для каждого пептида с его одновременно оцениваемыми контрольными образцами при едином соотношении Е:Т (20:1 или 40:1).

На фиг.2 характеризуются Т клетки, участвующие в откликах IFN-γ in vitro при индукции и эффекторных фазах соответственно. Иммуноферментные спот-анализы (ELISPOT) проводились с замерзшими мононуклеарами периферической крови от добровольцев, иммунизированных 3 дозами PƒCSP только ДНК (V1 и V5) или 2 дозами только RTS,S (V19, V21 и М22), обработанных либо контрольными Dynabeads или обедненными Т клетками CD4⁺ или CD8⁺ непосредственно перед культивированием с пептидами (a) Flu M A2, b) TT-DR, с) PƒCSP DR.363 или d) PƒCSP DR.316. Параллельно, уровни экспрессии IFN-γ мРНК (матричной-информационной РНК) (е) измерялись полимеразной реакцией синтеза цепи (PCR) в селективно обогащенных популяциях Т клеток (CD4⁺/CD45RA⁺, CD4⁺+CD45RA^-, CD8⁺/CD45RA⁺ и CD8⁺/CD45RA^-) от того же добровольца в том же исследовании немедленно после 36-часового культивирования с такими же наборами пептидов, протестированных в анализах ELISPOT.

На фиг.3 показаны уровни экспрессии IFN-γ мРНК в поднаборах Т клетки, измеренных с помощью полимеразно-цепьевой реакции IFN-γ. Исследовались замороженные клетки от двух добровольцев (V1 и V5), полученные после 3 доз ДНК PƒCSP (только ДНК) и после того, как индивидуумы были простимулированы двумя дозами вакцины RTS,S (ДНК/РТS,S). Клетки инкубировались пептидом DR.363 PƒCSP в течение 36 часов, селективно обогащались и оценивались на экспрессию IFN-γ мРНК. После иммунизации ДНК экспрессия IFN-γ мРНК была умеренно (в 5-10) раз позитивно отрегулирована в клетках CD4⁺ в поднаборе CD45RA^- у добровольца V1 и в поднаборе CD45RA⁺ у добровольца V5, но не в Т клетках CD8⁺. Стимулирование RTS,S было связано со значительным (80-100 кратным) увеличением уровней экспрессии IFN-γ мРНК в позитивно отрегулированном поднаборе CD4⁺ у обоих добровольцев, но не в Т клетках CD8⁺.

На фиг.4 показан сдвиг от индуцированной ДНК схемы отклика IFN-γ на пептид DR.316 (только CD8⁺ Тс1) после первой дозы RTS,S к смеси двух схем (СD8⁺ Тс1 и CD4⁺ Th1) после приема второй дозы вакцины RTS,S. В анализе ELISPOT ex vivo, проведенном с клетками от добровольца V2, (а) отклики IFN-γ были значительно снижены с помощью элиминации Т клеток CD4⁴⁺ и CD8⁺ перед культивированием после первой дозы RTS,S (признак откликов IFN-γ, индуцированных ДНК). После второй дозы вакцины RTS,S только истощение Т клеток CD4⁺ значительно снизило активность. Параллельно в эффекторной фазе с помощью полимеразно-цепьевой реакции (b) в реальном масштабе времени экспрессия IFN-γ мРНК была позитивно отрегулирована в клетках CD8⁺,но не в Т клетках CD4⁺ после первой дозы RTS,S и была позитивно отрегулирована как в Т клетках CD4⁺, так и CD8⁺ после второй дозы RTS,S. «2wkp1» относится к 2 неделям после первой дозы и «2wkp2» относится к двум неделям после второй дозы.

На фиг.5 показаны титры антитела IFAT добровольцев, примированных ДНК/стимулированных RTS,S. Титры антител представляли среднегеометрическое значение +/- SE (95% уверенных интервалов) в примированных ДНК (+) и непримированных (-) добровольцах с (+) и без (-) антител к HBsAg перед первой дозой RTS,S. Анализы антител выполнялись после 1-ой и 2-ой иммунизации RTS,S. He было значительных отличий в титрах между любыми из групп, за исключением 2 недель после первой дозы, когда добровольцы ДHK-/HBsAg+ имели значительно большие титры, чем при ДНК+/ HBsAg+(P<0,02).

Детальное описание изобретения

Как было продемонстрировано, многовидовой иммунный отклик на малярийную инфекцию примируется иммунизацией человеческих субъектов примирующей вакциной, включающей полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один антиген малярии, и затем стимулируется иммунизацией стимулирующей вакциной, включающей, по крайней мере, один полипептид, который включает, по крайней мере, один малярийный антиген, имеющий, по крайней мере, один общий эпитоп с антигеном или антигенами малярии примирующей вакцины. Удивительно, настоящий способ иммунизации стимулирует и расширяет примированный отклик, используя полипептидную вакцину.

«Вакцина» - это состав из материи, включающий молекулу таким образом, что при введении субъекту она индуцирует иммунный отклик. Вакцины могут содержать молекулы полинуклеотида, молекулы полипептида и молекулы карбогидрата, а также их производные и комбинации, такие как гликопротеины, липопротеины, карбогидрат-протеиновые конъюгаты, слияния между двумя или более полипептидами или полинуклеотидами, и тому подобное. Вакцина далее может включать растворитель, адъювант, носитель или их комбинации, как это легко могут понять специалисты в данной области.

Может использоваться любой способ или путь прививки либо отдельно, либо в комбинации для доставки полинуклеотидной вакцины или протеиновой вакцины человеческому субъекту. Пути приема включают внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный или относящийся к слизистой оболочке. Средства доставки могут быть разными. Можно, например, делать инъекцию человеку внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутрикожным путем. Можно также делать прививку человеку по слизистому пути. Альтернативно, доставка может быть по безыгловому средству, такому как использование безыгловой «генной пушки», например, Biojector® или другого средства введения или биолостическую доставку. Полинуклеотид может быть доставлен в бактерии, содержащей ДНК вакцины PƒCSP, или вирусах, включающих ДНК вакцины PƒCSP.

Примеры приемлемых вирусных векторов включают вирусные векторы герпес симплекс, вакциновые или альфа-вирусные векторы и ретровирусы, включая лентивирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы. В оном примере осуществления изобретения эти вирусы представляют собой векторы репликационно дефективного вируса. Методы переноса генов с использованием этих вирусов известны специалистам в данной области. Например, ретровирусные векторы могут быть использованы для стабильной интеграции полинуклеотида по изобретению в геном хозяина, хотя подобная рекомбинация и не может быть рекомендована. Репликационно дефективные аденовирусные векторы в отличие от этого остаются эписомными и, следовательно, допускают переходную экспрессию.

В специфическом примере осуществления изобретения аденовирус, использованный в живом векторе, является репликационно дефективным аденовирусом человека или обезьяны. Обычно эти вирусы включают делецию Е1 и могут быть выращены на клеточных линиях, которые трансформируются с геном Е1. Приемлемыми обезьяньими аденовирусами являются, например, вирусы, выделенные из шимпанзе. Примеры вирусов, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают С68 (также известные как Pan 9) (патент США №6083716, включенный здесь в виде ссылки) и Pan 5, 6 и Pan 7 (WO 03/046124, включенный здесь в виде ссылки). Таким образом, этими векторами можно манипулировать и включать ксеногенный ген по данному изобретению таким образом, что может быть осуществлена экспрессия генного продукта. Использование технологии приготовления лекарственного средства и изготовление подобных рекомбинантных аденовирусных векторов детально описано в WO 03/046142, который включен здесь в виде ссылки.

Вакцина может состоять из отдельных компонентов. При использовании здесь «отдельные компоненты» относятся к ситуации, в которой термин «вакцина» фактически включает две дискретные вакцины, которые отдельно вводятся субъекту. В этом смысле вакцина, включающая отдельные компоненты, может рассматриваться как набор или пакет, включающий отдельные компоненты вакцины. Например, в контексте данного изобретения пакет может включать компонент полинуклеотидной вакцины и компонент полипептидной вакцины.

Вакцина «индуцирует» иммунный отклик, когда антиген или антигены, присутствующие в вакцине, вызывает рост иммунного отклика у иммунизированного субъекта на данный антиген или антигены. Вакцинированный субъект будет генерировать иммунный отклик, о чем свидетельствует активизация иммунной системы, что включает производство вакцинных антиген-специфических Т клеток, вакцинных антиген-специфических В клеток, вакцинных антиген-специфических антител и цитокинов. Получаемый в результате иммунный отклик может быть измерен несколькими способами, включая анализы ELISPOT, ELISA, анализы выхода хрома, межклеточным цитокинным окрашиванием, анализом с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) и окрашиванием тетрамера главным комплексом гистосовместимости (МНС) (для идентификации пептидно-специфических клеток). Опытный исследователь может также использовать эти способы для измерения первичного иммунного отклика или вторичного иммунного отклика.

«Антиген» является веществом, способным генерировать иммунный отклик в субъекте, подвергнутом воздействию антигена. Антигены обычно являются полипептидами и являются центром иммунного отклика хозяина. «Эпитоп» или «антигенный детерминант» является той частью антигена, к которой конкретно привязываются Т клетки и антитела. Антиген может включать множественные эпитопы.

Примирующая вакцина, используемая в способе по данному изобретению, включает полинуклеотид, кодирующий малярийный антиген, как это рассматривается ниже. Примирующая вакцина может быть только ДНК или ДНК, которая находится под контролем постороннего промотора внутри бактерии или вируса. Полинуклеотид примирующей вакцины присутствует в приемлемом доставочном векторе, подобном плазмиду, или другом векторе, таком как бактериальный или вирусный вектор.

Полинуклеотид может быть под контролем приемлемого промотора, подобного промотору, полученному из гена HCMV IE. Примирующая вакцина вводится в количестве, эффективном для примирования иммунного отклика на малярийный антиген. При использовании здесь «примирование» иммунного отклика происходит, когда антиген представляется Т клеткам или В клеткам. В результате, примированные клетки откликаются на тот же антиген вновь как клетки памяти во втором, последующем иммунном отклике. Таким образом, примирование генерирует как первичный иммунный отклик, так и устанавливает иммунологическую память. Специалист в данной области оценит, что первичный иммунный отклик представляет собой адаптивный иммунный отклик после первоначального воздействия антигена в определенном контексте, таком как патоген, или в вакцине. Однако будет также оценено, что изобретение не ограничивается использованием примирующей вакцины в контексте иммунологически не подвергнутых иммунологическому воздействию индивидуумов. Скорее примирование может также происходить в индивидуумах, которые были подвергнуты воздействию антигена, но не получали примирующей вакцины.

«Эффективная» примирующая доза может колебаться между 0,01 мкг и 50 мг ДНК. Альтернативно, доза может быть между 1 мкг и 10 мг ДНК или 2,5 и 5 мг ДНК. Полинуклеотидная вакцина может вводиться один раз перед приемом стимулирующей полипептидной вакцины. В другом примере осуществления изобретения примирующая вакцина может приниматься несколько раз. «Эффективное» количество прививок может колебаться между 1 и 5 дозами. Альтернативно, число доз может быть между 1 и 3 дозами или 1 и 2 дозами перед приемом стимулирующей вакцины.

«Полинуклеотид» обычно относится к любому полирибонуклеотиду (рибонуклеиновая кислота, РНК) или дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), которые могут быть немодифицированными или модифицированными РНК или ДНК. Полинуклеотиды включают, без ограничения, однонитевые или двухнитевые ДНК, ДНК, которая является смесью однонитевых и двухнитевых зон, однонитевых и двухнитевых РНК, РНК, которая является смесью однонитевых и двухнитевых зон. Полинуклеотиды также включают гибридные молекулы, включающие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми, или более типично, двухнитевыми, или смесью однонитевых и двухнитевых зон. В дополнение, «полинуклеотид» относится к трехнитевым зонам, включающим РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотиды также включают ДНК или РНК, содержащие одну или более модифицированных баз, и ДНК или РНК с основами, модифицированными для стабильности или по другим причинам. «Модифицированные» базы включают, например, тритилированные базы и необычные базы, такие как инозин. В ДНК и РНК можно сделать разнообразные модификации; таким образом, «полинуклеотид» включает химически, ферментно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, которые обычно находятся в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. Олигонуклеотиды являются относительно короткими полинуклеотидами.

«Фрагмент» последовательности полинуклеотидов относится к полинуклеотидной последовательности, которая короче, чем эталонная последовательность, но которая сохраняет биологическую функцию или активность, которые признаются такими же, как и у эталонного полинуклеотида. Фрагмент кодирует, по крайней мере, один эпитоп эталонного полипептида, кодируемого эталонной последовательностью полинуклеотида. При использовании здесь термин «практически вся» при использовании для описания полинуклеотида или полипептида, относится к молекуле, которая, за исключением незначительных делеций баз нуклеотида или остатков аминокислот, кодирует или представляет целый полинуклеотид или полипептид полной длины.

Стимулирующая вакцина, используемая в способе по данному изобретению, может включать слитый белок, включающий, по крайней мере, один полипептид малярийного антигена, рассматриваемый ниже. Используемые в данной вакцине полипептиды могут быть изолированы из природного источника, произведенного в качестве рекомбинантного белка в постороннем организме, подобном бактерии, или синтезированы химическими средствами. Стимулирующая вакцина может далее включать дополнительные немалярийные полипептиды для усиления иммуногенетичности малярийного полипептида. Например, можно использовать часть или весь поверхностный антиген вируса гепатита В. Примирующая вакцина и стимулирующая вакцина совместно имеют, по крайней мере, один общий малярийный эпитоп.

Приемлемый слитый белок для использования в стимулирующей вакцине по данному изобретению может включать гибридный белок, включающий практически всю С-терминальную часть белка CS, четыре или более тандемных повторов иммунодоминантной области, и поверхностный антиген из вируса гепатита В (HbsAg). Гибридный белок включает последовательность, которая содержит, по крайней мере, 160 аминокислот, которые практически гомологична к С-терминальной части белка CS. В одном примере осуществления изобретения белок CS может быть лишен последних 12 аминокислот от С-терминала. Приемлемый гибридный белок включает, например, часть белка CS P.falciparum практически соответствующего аминокислотам 210-398 Р.falciparum 7G8, слитого в рамку через линейный линкер (связывающий агент) к N-терминалу HbsAg. Линкер может включать часть preS2 от HbsAg.

Другой пример осуществления данного изобретения является гибридной частицей, обозначенной как RTS,S, которая описана в патенте США 5,928,902 и в международной заявке на патент WO 93/10152, которые включены здесь в качестве ссылки. Данный гибрид состоит из: 1) остатка метионина, кодируемого нуклеотидами 1059 по 1061, полученными из Saccharomyces cerevisiae TDH3 генной последовательности (71); трех аминокислот Met Ala Pro, полученных из нуклеотидной последовательности (1062 по 1070), созданной процедурой клонирования, используемой для конструирования гибридного гена; 3) фрагмента 189 аминокислот, кодируемых нуклеотидами 1071 по 1637, представляющих аминокислоты с 210 по 398 белка циркумспорозоита (CSP) штамма Plasmodium falciparum 7G8 (21); 4) аминокислоты (Arg), кодируемой нуклеотидами 1638 по 1640, созданных процедурой клонирования, используемой для конструирования гибридного гена; 5) четыре аминокислоты Pro Val Thr Asn, кодируемых нуклеотидами 1641 по 1652, и представляющими четыре карбокси-терминальных остатка вируса гепатита В (серотип adw) белка preS2 (103) и 6) фрагмента 226 аминокислот, кодируемых нуклеотидами 1653 по 2330, и определяющими S белок вируса гепатита В (серотип adw).

Стимулирующая вакцина вводится в количестве, эффективном для «стимулирования» примированного иммунного отклика на малярийный антиген. При использовании здесь «стимулирование» иммунного отклика означает индуцирование вторичного иммунного отклика в субъекте, который был примирован (т.е. уже подвергнут влиянию) под первоначальным воздействием антигена. Вторичный иммунный отклик характеризуется активизацией и расширением специфических Т клеток памяти и В клеток. Таким образом, стимулирование специфического иммунного отклика усиливает примированный иммунный отклик путем индуцирования иммунных клеток к пролиферации и дифференциации после последующего воздействия данного антигена. Как обсуждалось ранее, белок CS полной длины вакцины PƒCSP содержит 9 эпитопов Т клеток, в то время как RTS,S содержит 5 эпитопов Т клеток (61). Четыре из эпитопов RTS,S присутствуют в вакцине PƒCSP. Например, при введении примирующая вакцина примирует антималярийные Т клетки CD8⁺. Стимулирующая вакцина может достичь один или более из следующих эффектов: индуцирует Т клетки CD4⁺ индуцирует антималярийные антитела, стимулирует активность Т клеток CD8⁺, примированных примирующей вакциной, и индуцирует дополнительные Т клетки CD8⁺ первоначально не идентифицированные в первоначально примированном иммунном отклике. Стимулирующая вакцина может также индуцировать Т клетки CD4⁺ и индуцировать антималярийные антитела. Стимулирование иммунного отклика также известно в данной области как «вспоминание» иммунного отклика.

«Эффективная» доза стимулирования может колебаться между 1 мкг и 100 мкг или между 10 мкг и 75 мкг или между 40 мкг и 60 мкг. В другом примере осуществления изобретения стимулирующая доза может быть 50 мкг. В еще одном примере осуществления изобретения стимулирующая доза может быть 25 мкг. Стимулирующая вакцина может вводиться один раз или многократно. «Эффективное» количество стимулирующих доз может колебаться между 1 и 5 дозами стимулирующей вакцины. Альтернативно, число доз может быть между 1 и 3 дозами или между 1 и 2 дозами для субъекта человека. В другом примере осуществления изобретения как вакцина ДНК, так и белковая вакцина, могут использоваться для стимуляции первичного иммунного отклика.

«Полипептид» относится к любому полипептиду, включающему две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. «Полипептид» относится как к коротким цепочкам, обычно называемыми пептидами, олигопептидами или олигомерами, так и к более длинным цепочкам, обычно называемым белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличающиеся от обычно кодируемых кодоном.

Полипептиды включают последовательности аминокислот, модифицированные либо природными процессами, такими как пост-трансляционная обработка, или методами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Подобные модификации хорошо описаны в базовых текстах и в более детальных монографиях, а также в объемной исследовательской литературе. Модификации могут возникнуть в любом месте в полипептиде, включая основу полипептида, боковые цепочки аминокислот и амино или карбоксильные терминалы. Подобные модификации могут присутствовать в той же или отличающейся степени в нескольких сайтах в данном полипептиде. Также данный полипептид может содержать много типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными в результате убиквитинирования, и они могут быть циклическими, с разветвлением и без. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут возникнуть из пост-трансляционных природных процессов или могут быть выполнены синтетическими методами. Модификации включают ацетиляцию, ациляцию, ADP-рибосиляцию, амидирование, биотинилирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение доли протогема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, формирование дисульфидной связи, деметилирование, формирование ковалентных перекрестных связей, формирование цистина, формирование пироглютамина, формилирование (введение радикала), гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование GPI домена, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, протеолитическую обработку, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфацию, добавление аминокислот, усредненное пересылкой ДНК в белки, такие как аргинилирование и убиквитинирование (79, 82, 94, 113).

«Фрагмент» последовательности полипептида относится к последовательности полипептида, которая короче эталонной последовательности, но которая сохраняет биологическую функцию или активность, которая признается такой же, как и у эталонного полипептида. Подобная активность может включать, например, способность стимулировать иммунный отклик. Фрагмент сохраняет, по крайней мере, один эпитоп эталонного полипептида. «Часть» полипетида относится к поднабору последовательности аминокислот эталонного полипептида. Часть может быть описана ее относительным местоположением в полипептиде, например, С-терминальной части или N-терминальной части.

Изобретение может использоваться с любым малярийным антигеном, подобным показанным в таблице А и Таблице В.

Таблица А
Антигены пред-эритроцитов (RBC) АНТИГЕН ССЫЛКИ CSP 13, 14, 29, 32, 41, 55, 66, 69, 78, 85, 87, 91, 99, 114 SSP2 1, 13, 14, 29, 55, 56, 86, 104, 111, 112 Exp1/Hep-17 15, 16, 27, 28, 29 PfLSA1 29 и 44 PfLSA3 22 Таблица В
Антигены стадии ККК (эритроцитов) АНТИГЕН ССЫЛКИ MSP-1 7, 10, 12, 20, 34, 35, 46, 58, 59, 65, 95, 96 MSP-2 3, 4, 17, 80, 81, 88 MSP-3 72 и 73 MSP-4 50 MSP-5 7 АМА1 5, 18, 19, 24, 25, 101, 102 ЕВА175 зона II 97 и 98 SERA 26, 48, 49, 76,77 RAP2 39, 76, 84, 89

Белок циркумспорозоит или «CSP» является главным поверхностным полипептидом на поверхности малярийных спорозоитов. CSP от штамма 7G8 Plasmodium falciparum (PƒCSP) клонировался, секвенировался, и производилась его экспрессия. Другие CSPs от других малярийных паразитов были также охарактеризованы и включены в Таблицу А.

"RTS,S", при использовании здесь, относится к определенному малярийному антигену и представляет один пример осуществления настоящего изобретения. RTS,S и его производство более полно описаны в патенте США №5,928,902 и международной заявке на патент WO 93/10152, которые оба включены здесь в виде ссылки.

«Расширение» относится к увеличению репертуара откликов Т клеток. В данном случае более широкий репертуар Т клеток, производящих IFN-γ (Tc1 и Th1), индуцировался примированием ДНК/стимулированием RTS,S, так как иммунизация/примирование ДНК инициировали как отклики зависящих от CD4⁺Т клеток CD8⁺ типа 1 (Tcl), так и отклики IFN-γ CD4⁺ типа 1 (Th1), в то время как отдельно RTS,S индуцировало только зависящие от Т клетки CD4⁺отклики IFN-γ Th1. Опытный специалист может детектировать расширенный иммунный отклик путем использования антиген-специфических анализов детектирования. Например, опытный специалист может использовать анализы ELISPOT, МНС тетрамерное окрашивание или анализы ЦТЛ выхода хрома для определения репертуара Т клеток.

«Расширение» также относится к увеличению диапазона эпитопов, на которые будет реагировать иммунный отклик. В дополнение к первоначально примированным иммунным клеткам также индуцируется расширение и активация иммунных клеток, которые либо не были примированы или имеются в таком небольшом количестве, что они не могут быть детектированы. Таким образом, расширенный иммунный отклик не только расширяет первоначально примированный отклик, он также содержит отклики на новые эпитопы, которые не были частью первичного отклика. Опытный специалист может детектировать расширенный иммунный отклик путем использования антиген-специфических анализов детектирования. Например, опытный специалист может использовать анализ ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ) или тетрамерное окрашивание главного комплекса гистосовместимости (МНС) для определения репертуара эпитопов, на которые реагирует первоначальный иммунный отклик, и сравнить этот диапазон с репертуаром эпитопов, на которые реагирует вторичный иммунный отклик. Если вторичный иммунный отклик реагирует на большее количество эпитопов, чем первичный иммунный отклик, вторичный иммунный отклик был расширен.

«Т клетки CD8⁺ представляют собой класс Т лимфоцитов, характеризуемых обладанием поверхностным маркером клетки CD8. Т клетки CD8⁺ являются МНС класса I ограниченными «ЦТЛ» или подавляющими Т клетками.

«Т клетки CD4⁺» представляют собой класс Т лимфоцитов, характеризуемых обладанием поверхностным маркером клетки CD4. Т клетки CD4⁺ являются МНС класса II ограниченными Т лимфоцитами. Имеется два типа Т клеток CD4⁺, называемых «Т клетки помощники» типа 1 или типа 2.

Как обсуждалось выше, иммунный отклик генерируется на антиген через взаимодействие антигена с клетками иммунной системы. Получаемый в результате иммунный отклик может быть широко определен в две крайние категории, являясь гуморальными или вызванными клетками иммунными откликами (традиционно характеризуемыми механизмами защиты антител и клеточных эффекторных механизмов, соответственно). Эти категории откликов назывались откликами типа Тh1 (вызванные клетками отклики) и иммунный отклик типа Th2 (гуморальный отклик). Экстремальный иммунный отклик типа Тh1 может быть охарактеризован генерацией антиген-специфических, ограниченных гаплотипом ЦТЛ, естественным откликом клеток убийц. У мышей отклики типа Тh1 часто характеризуются генерацией антител подтипа IgG2a, в то время как у человека они соответствуют антителам типа IgG1. Иммунные отклики типа Th2 характеризуются генерацией широкого диапазона изотипов иммуноглобулина, включая у мышей IgG1, IgA и IgM.

Движущей силой, лежащей за развитием этих двух типов иммунных откликов, являются цитокины, ряд идентифицированных белковых посредников, которые служат для помощи клеткам иммунной системы и делают последующий иммунный отклик либо откликом Тh1, либо Th2. Таким образом, высокие уровни цитокинов типа Тh1 имеют тенденцию индуцировать управляемый клетками иммунный отклик на данный антиген, в то время как высокие уровни цитокинов типа Th2 имеют тенденцию благоприятствовать индуцированию гуморальных иммунных откликов на антиген. Важно помнить, что различие иммунных откликов Тh1 и Th2 не является абсолютным. В реальности индивидуум будет поддерживать иммунный отклик, который описан как преобладающе Th1 или преобладающе Th2. Однако часто удобно рассматривать семьи цитокинов с точки зрения описанного в клонах мышиных клеток CD4⁺ Мосманном и Коффманом (70). Традиционно отклики типа Th-1 связаны с производством INF-γ и цитокинов IL-2 Т-лимфоцитами. Другие цитокины, часто напрямую связанные с индуцированием иммунных откликов типа Th1, не производятся Т клетками, такими как IL-12. В отличие от этого отклики типа Th2 связаны с секрецией Il-4, IL-5, IL-6, IL-10 и фактора-β некроза опухоли (TNF-β).

Приемлемые адъюванты для использования в изобретении включают алюминиевую соль, подобную гелю гидроокиси алюминия (квасцы) или фосфату алюминия, но могут также быть солью кальция, железа или цинка, или могут быть нерастворимой суспензией ацилированного тирозина или ацилиновых сахаров, катионно или анионно произведенных полисахаридов, полифосфазенов или липосом монтанида.

При приготовлении вакцин для использования в данном изобретении, в контексте плазмида PƒCSP, адъювант может вводиться и не вводиться. В случае RTS,S состав адъюванта может индуцировать предпочтительный отклик Th1. Более того, могут быть индуцированы другие отклики, включая другие гуморальные отклики.

Некоторые адъюванты вакцины особенно пригодны для стимулирования либо отклика Th1, либо цитокинного отклика типа Th2. Традиционно наилучшие показатели баланса Th1:Th2 иммунного отклика после вакцинации или инфекции включают прямое измерение производства цитокинов Th1 или Th2 Т лимфоцитами in vitro после повторной стимуляции антигеном и/или измерения соотношения IgG1:IgG2a специфических для антигена иммунных откликов. Таким образом, адъювант типа Th1 является адъювантом, который стимулирует изолированные популяции Т клеток для производства высоких уровней цитокинов типа Th1 при повторной стимуляции антигеном in vitro и индуцирует специфические для антигена иммунные отклики, связанные с изотипом типа Th1. Например, иммуностимулянты типа Th1, которые могут быть составлены для производства адъювантов, приемлемых для использования в настоящем изобретении, могут включать липид А монофосфорила, в частности 3-dе-O-ацилированный липид А монофосфорила (3D-MPL). 3D-MPL является хорошо известным адъювантом, производимым компанией Риби Иммунохим (Ribi Immunochem), Монтана. Химически он часто поставляется как смесь 3-dе-O-ацилированный липида А монофосфорила с либо 4, 5 или 6 ацилированными цепочками. Он может быть очищен и подготовлен способами, указанными в патенте Великобритании GB 2122204 В, ссылка которого также раскрывает приготовление липида А дифосфорила и его 3-O-деацилированный вариантов. Были описаны и другие очищенные и синтетические липополисахариды (патент США 6,005,099, 42, 43, ЕР 0729473 B1, EP 0729473 B1, EP 0549074 B1). В одном примере осуществления изобретения 3D-MPL имеет форму состава из макрочастиц, имеющих небольшой размер частиц, менее 0,2 мкм в диаметре, и способ его производства описан в ЕР 0689454.

Сапонины являются другим примером иммуностимулянтов Th1, которые могут быть использованы с изобретением. Сапонины являются хорошо известными адъювантами (60). Например, Quil А (полученный из коры Южно Американского дерева Quillaja Saponaria Molina) и его доли описаны в патенте США 5,057,540, ЕР 0362279 B1 и у Кензила (52). Гемолитические сапонины QS21 и QS17 (очищенные жидкостной хроматографией высокого разрешения доли Quil А) были описаны как потентные системные адъюванты, и способ их производства раскрыт в патенте США 5,057,540 и ЕР 0362279 B1. В этих ссылках также описывается использование QS7 (не-гемолитической фракции Quil-А), которая действует как потентный адъювант для системных вакцин. Использование QS21 далее описано в Кензил и др. (51). Комбинации QS21 и полисорбата или циклоэкстрина хорошо известны (WO 99/10008). Адъювантные системы из макрочастиц, включающие фракции QuilA, такие как QS21 и QS7 описаны в WO 96/33739 и WO 96/11711.

Еще одним примером иммуностимулянта является иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий неметилированные динуклеотиды CpG ("CpG"). CpG является сокращением для цитозин-гуанозин динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. CpG известен в данной области как адъювант при приеме как систематическим, так и слизистым путями (WO 96/02555, ЕР 468520, 23, 68). Исторически наблюдалось, что фракция ДНК бацилл Калмет-герин (BCG) могли оказывать противоопухолевый эффект. В дальнейших исследованиях синтетические олигонуклеотиды, полученные из генной последовательности BCG, были способны индуцировать иммуностимулирующие эффекты (как in vitro, так и in vivo). Авторы этих исследований пришли к заключению, что некоторые палиндромные последовательности, включая центральный мотив CG, осуществляли эту активность. Центральная роль мотива CG в иммуностимуляции была позже раскрыта Криегом (57). Детальный анализ показал, что мотив CG должен быть в контексте определенной последовательности, и что такие последовательности являются обычными в бактериальной ДНК, но редки в ДНК позвоночных. Иммуностимулирующая последовательность часто представляет собой: Пурин, Пурин, С, G, пиримидин, пиримидин; в которой мотив CG не метилированный, но другие неметилированные последовательности CpG известны как иммуностимулирующие и могут быть использованы в настоящем изобретении.

В определенных комбинациях шести нуклеотидов может присутствовать палиндромная последовательность. Некоторые из этих мотивов, либо в качестве повторов одного мотива, либо комбинации различных мотивов, могут присутствовать в одном и том же олигонуклеотиде. Присутствие одного или более из этих иммуностимулирующих последовательностей, содержащих олигонуклеотиды, может активировать различные иммунные поднаборы, включая природные клетки убийцы (которые могут производить интерферон γ и иметь цитолитическую активность) и макрофаги (Вулдридж и др., 1977). Другой неметилированный CpG, содержащий последовательности, не имеющие данной конценсусной последовательности, теперь был показан как иммуностимулирующий. При составлении в вакцину, CpG обычно водится в свободном растворе вместе со свободным антигеном (WO 96/02555, 68) или ковалентно конъюгированный в антиген (WO 98/16247) или сформулированный с носителем, подобным гидроокиси алюминия (поверхностный антиген гепатита) (9, 23).

Иммуностимулянты, подобные описанным выше, могут быть сформулированы вместе с носителями, такими как, например, липосомы, масло в водной эмульсии, или соли металлов, включая алюминиевые соли (такие как гидроокись алюминия). Например, ED-MPL может быть приготовлен с гидроокисью алюминия (ЕР 0689454) или в водяных эмульсиях масла (WO 95/17210); QS21 может преимущественно быть сформулирован с холестеролом, содержащим липосомы (WO 96/33739), масло в водяных эмульсиях (WO 95/17210) или квасцы (WO 98/15287); CpG может быть приготовлен с квасцами (9, 23) или с другими катионными носителями.

Могут также использоваться комбинации иммуностимулянтов, такие как комбинация липида А монофосфорила и производного сапонина (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 98/05355, WO 99/12565; WO 99/11241) или как комбинация QS21 и 3D-MPL, раскрытые в WO 94/00153. Альтернативно, в настоящем изобретении может также использоваться комбинация CpG плюс сапонин, такая как QS21. Таким образом, приемлемые системы адъювантов включают, например, комбинацию липида А монофосфорила, такую как 3D-MPL, вместе с солью алюминия. В другом примере осуществления изобретения объединяется липид А монофосфорила и производная сапонина, подобная комбинации QS21 и 3D-MPL, раскрытой в WO/00153, или менее реактогенная композиция, где QS21 закаливается в холестероле, содержащем липосомы (DQ), как раскрыто в WO 96/33739. Еще один адъювантный состав, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в водяной эмульсии описан в WO 95/17210. В другом примере осуществления изобретения олигонуклеотиды CpG используются отдельно или вместе с солью алюминия. Примеры дополнительных комбинаций адъюванта и/или носителя включают: 3D-MPL + QS21 в DQ; квасцы + 3D-MPL; квасцы + QS21 в DQ + 3D-MPL; квасцы + CpG; 3D-MPL + QS21 в DQ + масло в водяной эмульсии; и CpG.

В другом примере осуществления изобретения 3D-MPL и QS21 объединяются с или без CpG. Соотношение QS21:3D-MPL может быть порядка 1:10 до 10:1; 1:5 до 5:1; или 1:1. В другом примере осуществления изобретения соотношение равно 2,5:1 до 1:1 MPL:QS21. Обычно для приема человеком QS21 и 3D-MPL будут присутствовать в вакцине в диапазоне 1 pig - 2004 г, подобно 1-1004 г или 10~Lg-50~tg на дозу. Обычно масло в воде будет включать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа токоферола и от 0,33 до 3% эмульгатора 80. Соотношение сквален:альфа токоферол равно или меньше чем 1, так как это обеспечивает более стабильную эмульсию. Спан 85 может также присутствовать на уровне 1%. В некоторых случаях может быть связано с преимуществами, что вакцины по настоящему изобретению будут содержать стабилизатор.

Адъюванты для использования с полипептидной стимулирующей вакциной по настоящему изобретению, включающие белок CS или иммуногенную его часть, дополнительно в таком гибридном белке как RTS,S могут включать комбинацию 3D-MPL и QS21 с или без CpG.

Как предшествующее общее описание, так и последующее детальное описание являются примерами и объясняют, а не ограничивают заявленное изобретение. Более того, изобретение не ограничивается определенными описанными примерами осуществления изобретения, так как они, конечно, могут варьироваться. Далее, терминология, используемая для описания определенных примеров осуществления изобретения, не является ограничивающей, так как объем настоящего изобретения не будет ограничен только его формулой.

Что касается диапазонов значений, то изобретение включает каждое из промежуточных значений между верхним и нижним пределами диапазона до, по крайней мере, одной десятой единицы нижнего предела, за исключением случаев, когда в контексте четко указано противоположное. Далее, изобретение включает любые другие указанные промежуточные значения. Более того, изобретение также включает диапазоны, исключающие либо один из либо оба из верхнего и нижнего диапазонов, за исключением конкретно исключенных из указанного диапазона.

За исключением по иному определенных случаев, значение всех используемых здесь технических и научных терминов являются общепринятыми для обычного специалиста в области, к которой относится изобретение. Обычный специалист в данной области также поймет, что любые способы и вещества, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут также использоваться для применения или тестирования изобретения. Далее, все упомянутые здесь публикации включены в виде ссылки.

Следует отметить, что при использовании здесь и в прилагаемой формуле формы единственного числа включают формы множественного числа за исключением случаев, когда из контекста очевидно иное. Таким образом, например, ссылка на «субъект полипептид» включает множество подобных полипептидов, а ссылка на «агент» включает ссылку на один или более агентов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее.

Далее, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции, % чистоты, длины полпептида и полинуклеотида, и так далее, используемые в спецификации и формуле, модифицируются термином «около», за исключением по иному указанных случаев. Соответственно, числовые параметры, изложенные в спецификации и формуле, являются аппроксимациями, которые могут меняться в зависимости от желаемых свойств настоящего изобретения. В любом случае, не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов объемом формулы, каждый числовой параметр должен, по крайней мере, толковаться в свете числа отмеченных значимых цифр, применяя обычные методы округления. Тем не менее, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, приводятся как можно точнее. Любое числовое значение, однако, внутренне содержит некоторые погрешности из-за стандартного отклонения его экспериментального измерения.

Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение. Они только иллюстративные и раскрывают различные полезные свойства определенных примеров осуществления изобретения. Следующие примеры не должны толковаться как ограничивающие изобретение.

Примеры

Пример 1

Стимулирование примированного отклика анти-PƒCSP с помощью вакцины RTS,S

Для данного исследования было набрано двадцать четыре HLA-A* 0201-позитивных добровольца. Разнообразие главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) добровольцев было ограничено наиболее обычным подтипом HLA класса I в данной популяции для того, чтобы допустить межгрупповые сравнения генетически ограниченных откликов Т клеток. Ни один из этих добровольцев не подвергался ранее воздействию малярии. Из этих 24 индивидуумов 10 участвовали в описанном выше втором клиническом испытании вакцины PƒCSP. Во время этого испытания эти добровольцы получали в общем три дозы вакцины ДНК PƒCSP (VCL-2510, изготовленной компанией Викал, Инк. (Сан Дьего, Калифорния)), как было описано ранее (62), вводимых при 2500 мкг на дозу с 4-недельными интервалами (62). Таким образом, в данном испытании эти 10 добровольцев получали свою последнюю дозу вакцины ДНК за 12 до 14 месяцев до приема стимулирующей вакцины RTS,S. Остальные четырнадцать добровольцев ранее не принимали вакцину ДНК PƒCSP и, таким образом, использовались как непримированная контрольная группа. Все 24 добровольца имели отрицательную реакцию на антитела к PƒCSP, ВИЧ, срединный антиген вируса В человека, вирус тяжелых цепей, вакцинный вирус и двухцепочечную ДНК (дцДНК) до иммунизации как вакциной ДНК PƒCSP, так и вакциной RTS,S. Шесть из 10 примированных ДНК добровольцев и 8 из 14 непримированных членов контрольной группы имели положительную реакцию на антитела к HBsAg.

Все 24 добровольца получали две инъекции вакцины RTS,S через 0 и 8 недель с помощью внутримышечной инъекции в левую дельтавидную мышцу. Вакцина RTS,S содержала аминокислоты 207 по 395 белка CSP Plasmodium falciparum (NF54/3D7), слитого с поверхностным антигеном гепатита В (HBsAg). Вкратце, белок RTS,S является гибридным белком, включающим практически всю С-терминальную часть белка CS, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной зоны и HBsAg. Общее описание подготовки RTS,S приводится в WO 93/10152 и патенте США 5,928,902, которые включены здесь в виде ссылки.

Экспрессия получаемого рекомбинантного белка RTS,S осуществлялась в дрожжах (99), и он объединялся с иммуностимулирующим липидом А монофосфорила и QS21 в масловодяной эмульсии (Глаксо СмитКлайн Инк., Риксенсарт, Бельгия) для производства вакцины RTS,S. Конкретно, лиофилизированный (высушенный в вакууме) состав содержал гранулу RTS,S и адъювантный разбавитель. Гранула содержала RTS,S (50 мкг) и лактозу (3,15%) в качестве криозащиты. Адъювантный разбавитель содержал MPL (50 мкг), QS-21(50 мкг) и масловодяную эмульсию. Получаемые составы вакцины включали 50 мкг RTS,S в 1 мл объема эмульсии и готовились за 30 минут до введения. Три добровольца с несогласованным главным комплексом гистосовместимости человека (HLA) не получали ни вакцину ДНК PƒCSP, ни вакцину RTS,S. Примеры этих трех добровольцев использовались как отрицательные контрольные группы в анализах. Один из добровольцев в непримированной группе уклонился от испытания после первой иммунизации.

Был ряд эпитопов Т клеток, содержащихся в восходящей области последовательности PƒCSP полной длины, включенных в вакцину ДНК PƒCSP, которые не присутствовали в вакцине RTS,S. Но имело место достаточное перекрытие между двумя вакцинами, чтобы оправдать введение вакцины RTS,S в качестве потенциальной «стимулирующей» вакцины добровольцам, ранее иммунизированным вакциной ДНК PƒCSP. Конкретно, RTS,S включает часть PƒCSP, содержащую высоко консервативную область повторов 19 NANP и карбокси-терминал CSP, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAg), совместно выраженных в дрожжах с неслитым HBsAg (36). Белок циркумспорозоита (CS) полной длины вакцины PƒCSP содержит 9 эпитопов Т клетки, в то время как RTS,S содержит 5 эпитопов Т клетки (61). Четыре из эпитопов RTS,S присутствуют в вакцине PƒCSP.

Примеры 2-7 детально описывают анализы, которые впоследствии были произведены на образцах крови, взятых у каждого из добровольцев. Вкратце, отклики Т клеток исследовались через 12-14 месяцев после последней дозы вакцины ДНК PƒCSP для тех добровольцев, которые получали примирование вакциной ДНК PƒCSP и 1, 2 и 6 недель после первой и второй дозы вакцины RTS,S для всех добровольцев. Антитела тестировались перед иммунизацией и через 2, 4, 6 и 8 недель после каждой дозы вакцины RTS,S.

Пример 2

Отклики ЦТЛ (цитотоксического Т лимфоцита)

Как обсуждалось ранее, иммунизация только вакциной RTS,S индуцирует отклики антител и зависящие от гамма-интерферона (IFN-γ) отклики Т клеток CD₄ ⁺, но не отмечалось, что они вызывают специфические к антигену цитотоксические Т лимфоциты (ЦТЛ) в человеке. Для определения того, могут ли индуцированные ДНК ЦТЛ памяти быть вызваны стимулированием вакциной RTS,S и будет ли стимулированный отклик шире, чем первоначальный примированный ДНК отклик, оценивалась цитотоксическая активность антиген-специфических ЦТЛ у разных добровольцев. Периферийные мононуклеарные кровяные клетки (PBMCs) собирались из крови примированных ДНК или непримированных добровольцев за 1-2 недели перед иммунизацией RTS,S, и 1 или 2 недели спустя первой и/или второй доз RTS,S. Эти РВМС затем использовались в анализе выхода хрома, который детектирует лизис представляющих антиген клеток мишеней (105).

Анализ выхода хрома in vitro выполнялся, как было написано ранее (105). Конкретно, для генерации эффекторных клеток, 20% всех РВМС инфицировалось ALVAC, производящим экспрессию PƒCSP (vCP182) при 5 pfu/клетка в течение 90 минут при 37°С. После двойного промывания эти РВМС комбинировались с остальными РВМС и культивировались в течение 7-10 дней. Рекомбинантный IL-2 человека (Цетус, Эмеривиль, Калифорния) добавлялся после 48 часов (20 U/мл). Клетки мишени были аутогенными или несогласованными МНС выбросами РНА, которые были синтезированы за ночь со специфическими к PƒCSP эпитопами ЦТЛ или контрольным пептидом при 10 мкг/мл. Активность ЦТЛ оценивалась обычным 6-часовым анализом выхода хрома. Процент лизиса определялся как (экспериментальный выход - среднеконтролируемый выход)/(максимальный выход - среднеконтролируемый выход)×100. Процентно-специфический лизис определялся вычитанием процента лизиса мишеней, культивированных с отрицательно контролируемым ограниченным пептидом gag A-2 ВИЧ от процента лизиса мишеней, инкубированных с экспериментальным пептидом. Отклики ЦТЛ считались положительными, только если процентно-специфическая постиммунизация лизиса была ≥10% по крайней мере, для двух соотношений эффектор:мишень (Е:Т) в том же анализе, и если процентно-специфическая предиммунизация лизиса была <10%.

Синтетические пептиды при 80-95% чистоте использовались для сенсибилизации мишеней ЦТЛ и были получены от Хирон Технолоджиз (Клейтон, Виктория, Австралия). Было использовано восемь пептидов, произведенных из PƒCSP и включенных в последовательность RTS,S. Эти восемь пептидов включали 4 ограниченных эпитопа класса I ЦТЛ главного комплекса гистосовместимости, которые имели длину 9-10 аминокислот. 4 эпитопа ЦТЛ были ограничены HLA-A*0201 (пептид А2.319; остатки аминокислот 319-327, YLNKIQNSL; последовательность №1), -А*0101 (пептид А1.310; остатки аминокислот 310-319, EPSDKHIKEY; последовательность №2), -А*0301 (пептид А3/11.336; остатки аминокислот 336-345, VTCGNGIQVR; последовательность №3) и -В*3501 (пептид В35.353; остатки аминокислот 353-360, KPKDELDY; последовательность №4). Другие четыре пептида были DR-связующими пептидами DR.316 (остатки аминокислот 316-335, IKEYLNKIQNSLSTEWSPCS; последовательность №5), DR.318 (остатки аминокислот 318-332, EYLNKIQNSLSTEW; последовательность №6), DR.363 (остатки аминокислот 363-383, DIEKKICKMEKCSSVFNVVNS; последовательность №7) и DR.346 (остатки аминокислот 346-365, IKPGSANKPKDELDYANDIE; последовательность №8), которые имели длину 15-20 аминокислот, как было описано ранее (107). Пул из 13 полученных от РfСSР пептидов, и пул из 20 полученных от HBsAG пептидов, имеющий длину 15 аминокислот, был представлен Глаксо СмитКлайн Инк. (Риксенсарт, Бельгия). Последовательности аминокислот из 13 пептидов PƒCSP были следующими: NEEPSDKHIKEYLNK (последовательность №9), DKHIKEYLNKIQNSL (последовательность №10), EYLNKIQNSLSTEWS (последовательность №11), IQNSLSTEWSPCSVT (последовательность №12), STEWSPCSVTCGNGI (последовательность №13), PCSVTCGBGIQVRIK (последовательность №14), CGNGIQVRIKPGSAN (последовательность №15), QVRIKPGSANKPKDE (последовательность №16), PGSANKPKDELDYEN (последовательность №17), KPKDELDYENDIEKK (последовательность №18), LDYANDIEKKICKME (последовательность №19), DIEKKICKMEKCSSVF (последовательность №20) и ICKMEKCSSVFNVVN (последовательность №21). Пептиды, выведенные из белка матрицы гриппа (остаток 58-66, GILGFVFTL, HLA-A2.1; последовательность №22) эпитоп Р 30 клеток помощников Т универсального токсина столбняка (остаток 947-969, FNNFTVSFWLRVPKBSASHLET, DR- и DP-ограниченные; последовательность №23) использовались в качестве положительных контрольных групп (74). Пептиды из белка gag ВИЧ (остаток 77-85, SLYNTVATL, ограниченные HLA-A2.1; последовательность №24) или белок Р.falciparum, Exp-1 (остаток 82-96, последовательность AGLLGNVSTVLLGGV, DR-ограниченный; последовательность №25) использовались в качестве отрицательной контрольной группы.

Создание вторичного иммунного отклика индуцированных ДНК ЦТЛ памяти путем стимулирования RTS,S

Никаких ЦТЛ не детектировалось в примированных ДНК или непримированных добровольцах непосредственно перед приемом вакцины RTS,S. Никаких откликов ЦТЛ не было детектировано в любых из 14 непримированных добровольцах, которые получали только вакцину RTS,S. Антиген-специфические и генно-ограниченные отклики ЦТЛ были детектированы в 5/10 примированных ДНК добровольцах (фиг.1с). Один из 5 отвечающих организмов (респондеров) имел ЦТЛ (V6) через одну неделю после первой дозы, и другие имели ЦТЛ после второй дозы RTS,S. Частота откликов ЦТЛ (7/113 анализов, 6,2%) была значительно больше в примированных ДНК добровольцах (Р=0,0047) по сравнению с непримированными добровольцами (0/125 анализов, 0%). Частота откликов ЦТЛ была сопоставима с частотой, которая наблюдалась после иммунизации только ДНК среди 15 добровольцев, которые получили 3 дозы вакцины ДНК РfCSP за 12-14 месяцев (30/458 анализов, 6,6%) (107).

Величина ЦТЛ в добровольцах, которые были примированы ДНК и стимулированы RTS,S (диапазон процентно-специфического лизиса [среднегеометрическое значение]: 11,4-28,1 [15,4] был также в том же диапазоне, что и индуцированный только иммунизацией ДНК (10,5-90,0 [15,6]). Вакцина RTS,S не содержала эпитопы Т клетки CD8⁺, связанные с наивысшим преобладанием отклика в двух предшествующих исследованиях (105, 107).

Были детектированы отклики ЦТЛ на все 4 определенных PƒCSP-специфических ограниченных эпитопа МНС класса I. Из 5 положительных респондеров ЦТЛ 4 имели ЦТЛ на ограниченный HLA-A2 эпитоп А2.319, один откликался на ограниченный HLA-А1 эпитоп А1.310 (V2) и 2/4 респондеров А2.319 также откликались на ограниченные HLA-A3 и HLA-B7 эпитопы, А3.336 (V8) и В7.285 (V9) соответственно. Не было детектированных ЦТЛ, направленных против отмеченных эпитопов DR.318 ЦТЛ CD4⁺ (последовательность EYLNKIQNSLSTEWS: последовательность №26), которые содержат эпитоп А2.319 ЦТЛ CD8⁺ (подчеркнуто) (69). Также отсутствовала детектированная активность ЦТЛ у 14 добровольцев, которые не получали ДНК PƒCSP, но которые приняли две дозы вакцины RTS,S. Отсутствие активности ЦТЛ у этих добровольцев согласуется с предшествующими исследованиями, которые показали, что вакцина одна не может индуцировать активность Т клетки CD8⁺ (т.е. активности ЦТЛ).

Среди 5 примированных ДНК добровольцев, которые имели положительные отклики ЦТЛ после стимулирования вакциной RTS,S, 3 добровольца не имели предшествующее детектируемой активности ЦТЛ против тех же эпитопов, когда они тестировались через 2 и 6 недель после второй и третьей дозы иммунизации ДНК PƒCSP (107), приблизительно за год до стимулирования RTS,S. В отличие от этого два из пяти добровольцев, которые ранее имели детектированную активность ЦТЛ против пептидов, включенных в RTS,S после иммунизации одним ДНК. Эти два добровольца не откликались на стимулирование RTS,S.

Стимулированный RTS,S отклик ЦТЛ шире, чем примированный ДНК отклик ЦТЛ

Из 5 добровольцев, примированных ДНК, которые имели положительные отклики ЦТЛ после стимулирования вакциной RTS,S, три из них (V3, V6 и V8) откликались на эпитопы после стимулирования RTS,S, на которые не откликались после примирования ДНК. Конкретно, отклики ЦТЛ считались положительными только если процентно-специфический лизис после иммунизации был ≥10% на фоне как отрицательных контрольных групп (МНС + контроль и не МНС + пептид). В V3 и V6 не было отклика ЦТЛ на эпитоп А2.319 после примирования ДНК вакциной PƒCSP (фиг.1а и 1b). Однако после стимулирования RTS,S у обоих добровольцев появился отклик ЦТЛ на данный эпитоп (фиг.1с). У добровольца V8 не было отклика ЦТЛ на эпитопы А2.319 и A3.336 после примирования ДНК, тем не менее после стимуляции данного примированного добровольца вакциной RTS,S появились отклики на эти эпитопы (фиг.1a, 1b и 1с).

Как обсуждалось ранее, специалисты в данной области не рассматривали основанные на белках вакцины как эффективные для стимуляции откликов ЦТЛ. Подобным же образом, основанные на белке вакцины, ранее считались неэффективными для стимуляции отклика Т клетки CD8⁺. В отличие от того, что было известно, вышеприведенные данные четко демонстрируют, что после примирования ДНК RTS,S может стимулировать отклики ЦТЛ на новые эпитопы ЦТЛ.

Частота и величина пептидно-специфических откликов IFN-γ и ЦТЛ анализировалась с использованием теста Chi Squared, точного теста Фишера (двуххвостового) или Студенческого теста (двуххвостового). Тест t для парных образцов использовался для сравнения пропорции уровней экспрессии IFN-γ мРНК в субпопуляциях Т клеток. Уровень значения составлял значение р<0,05.

Пример 3

Отклики IFN-γ Т клеток на PƒCSP

Отклики IFN-γ оценивались стандартными анализами ELISPOT следующим образом. Количество PƒCSP - специфических производящих IFN-γ клеток определялось с помощью ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа) после 36 часов стимуляции in vitro в присутствии 10 мкг/мл пептидов, как это было описано ранее (107). Количество спот, соответствующих производящим цитокины клеткам в лунках (формирующих спот клеток; SFCs) определялось с помощью автоматизированной системы для счета спот (Сканалитикс, Ферфакс, Вирджиния). Отклики выражались как среднее число клеток, образующих ореол (SFCs)/10⁶ PBMC (мононуклеары периферической крови), и считались значимыми, если 1) среднее число клеток в лунках с экспериментальным пептидом было значительно больше (р<0,05, Студенческий Т тест), чем в лунках с контрольным пептидом; 2) чистые SFCs/лунку (среднее SFCs в лунке с экспериментальным пептидом минус среднее SFCs в лунках с контрольным пептидом) составляли ≥5 SFCs/лунку; и 3) показатель стимуляции (соотношение среднего числа клеток, образующих ореол (SFCs) в лунке с экспериментальным пептидом к среднему SFCs в лунках с контрольным пептидом), был больше, чем 2,0. Более того, если клетки, полученные до иммунизации, имели положительный отклик на PƒCSP - специфический пептид, как было определено выше, отклик на тот же пептид после иммунизации не считался положительным.

При использовании здесь, термин «частота положительных отвечающих организмов (респондеров)» в анализе ELISPOT на IFN-γ равна числу добровольцев, которые имеют положительный тест на определенный пептид, деленному на общее число добровольцев в тестовой группе. «Частота положительных анализов ELISPOT на IFN-γ» равна числу положительных реакций на пептид, деленному на число тестов, проведенных на этот пептид. Например, если 6 пептидов испытываются в каждом из 10 добровольцев, общее число тестов составляет 60. Если 36 из этих тестов являются положительными, тогда частота положительных анализов составляет 36 из 60. «Величина отклика IFN-γ» указывается числом клеток, образующих ореол (SFCs) на один миллион PBMC (мононуклеаров периферической крови).

РВМС (мононуклеары периферической крови), изолированные за 1-2 недели до, и 1, 2 и 6 недель после, первой и второй доз вакцины RTS,S использовались в анализе ELISPOT (иммуноферментном спот-анализе). В этих анализах РВМС инкубировались с 8 определенными пептидами PƒCSP, как обсуждалось в примере 2 (четыре пептида 9 аминокислот, содержащих ограниченные эпитопы класса I главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) и четыре пептида 15-20 аминокислот, каждый из которых включал ограниченные эпитопы класса II, и три из которых также включали ограниченный эпитоп класса I) и пулом из 13 пептидов PƒCSP, которые были включены в последовательность RTS,S. Эти пептиды также детально рассматриваются выше в Примере 2.

Примированные ДНК или непримированные добровольцы не имели детектированных PƒCSP-специфических откликов IFN-γ до иммунизации RTS,S. He было детектировано откликов IFN-γ в любое время после иммунизации в анализах с использованием только пептидов 9 аминокислот, имеющих только ограниченные эпитопы класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС). Это те же пептиды, рассмотренные в Примере 2. После первой дозы были детектированы положительные отклики IFN-γ на все четыре пептида PƒCSP аминокислоты 15-20 в 6 из 10 примированных ДНК добровольцах, по сравнению с одним подобным пептидом в 2 из 14 непримированных добровольцах (р=0,019) (Таблица 1). Положительные отвечающие организмы являются организмами, которые ответили на, по крайней мере, один из четырех пептидов. Более того, отвечающие организмы (респондеры) в примированной группе откликнулись на все четыре испытываемых пептида, в то время как отвечающие организмы в непримированной группе откликнулись только на один из четырех испытываемых пептида. Частота откликов была значительно больше в примированных ДНК добровольцах по сравнению с непримированными добровольцами (положительные анализы/общее число анализов: 20/116 [18,1%] по сравнению с 4/164 [2,4%], р=0,00001) независимо от статуса HBsAg Ab индивидуума (Таблица 1).

Таблица 1
Общая частота и величина откликов IFN-γ на PƒCSP-специфические пептиды Группа Число респондеров / число испытуемых Число положительных анализов / общее число анализов (%) Диапазон чистых SFCs/10⁶ РВМС (среднегеометрическое значение) Примированные ДНК добровольцы Непримированные доборовольцы Примированные ДНК добровольцы Непримированные добровольцы Значение Р между двумя группами Примированные ДНК добровольцы Непримированные добровольцы После первой иммунизации               HBsAg (+) 4/6 (66,7) 2/8 (25,0) 13/69 (18,8) 4/95 (4,2) 0,001 13,1-105,5 (38,5) 20,0-63,1 (39,6) HBsAg (-) 2/4 (50,0) 0/6 (0) 7/47 (14,9) 0/69 (0) 0,0009 13,8-82,5 (32,7) Отрицательный Итого 6/10 (60,0)* 2/14 (14,3)* 20/116 (18,1) 4/164 (2,4) <0,00001 13,1-105,5 (36,3) 20,0-63,1 (39,6) После второй иммунизации               HBsAg (+) 5/6 (83,0) 6/8 (75,0) 23/72 (31,9) 11/84 (13,1) 0,0078 11,9-82,5 (32,1) 14,4-96,9 (37,8) HBsAg (-) 3/4 (75,0) 6/6 (100,0) 18/48 (37,5) 29/72 (40,3) 0,76 11,7-122,5 (33,4) 17,5-125,6 (41,0) Итого 8/10 (80) 11/14 (84,6) 41/120 (34,2) 40/156 (25,6) 0,12 11,7-122,5 (32,6) 14,4-125,6 (39,6) Всего               HBsAg (+) 5/6 (83,0) 6/8 (75,0) 36/141 (25,5) 15/179 (8,4) 0,00003 11,9-105,0 (34,3) 14,4-96,9 (38,1) HBsAg (-) 3/4 (75,0) 6/6 (100,0) 25/95 (26,3) 19/141 (20,6) 0,3 11,7-122,5 (33,2) 17,5-125,6 (41,0) Итого 8/10 (80,0) 11/14 (84,6) 61/238 (25,6) 44/320 (13,8) 0,0004 11,7-122,5 (33,9) 14,4-125,6 (39,6) * после первой иммунизации число положительных респондеров у примированных ДНК добровольцев было значительно больше, чем у непримированных добровольцев (6/10 против 2/14, р=0,019).

После второй дозы вакцины RTS,S отклики IFN-γ детектировались в 8 из 10 примированных ДНК добровольцев и в 11 из 14 непримированных добровольцев (Таблица 1). Хотя и не было разницы между двумя группами с точки зрения числа респондеров после второй дозы вакцины RTS,S (см. число положительных анализов/общее число анализов (%)), имело место статистически значительно большее число общих положительных анализов среди добровольцев, примированных ДНК, по сравнению с непримированным добровольцами (положительные анализы/общее число анализов, 61/238 [25,6%] против 44/320 [13,8%], р=0,0004) (Таблица 1). Это различие в числе общих положительных анализов было напрямую связано со статусом антитела HBsAg добровольцев, о чем свидетельствует частота положительных анализов. Число положительных анализов было значительно больше в примированных ДНК добровольцах, чем среди непримированных добровольцев среди индивидуумов, имеющих положительную реакцию на антитело HBsAg (27/72 [31,9%] против 11/84 [13,1%], р=0,0078), не у индивидуумов, имеющих отрицательную реакцию на антитело HBsAg (37,5% против 40,3% положительных анализов) после второй иммунизации RTS,S.

На уровне эпитопа отклики IFN-γ на пептиды DR.316, DR 318 и DR.363 сравнивались между примированными ДНК и непримированными группами. DR.316 и DR.318 содержат перекрывающиеся эпитопы CD4⁺ и CD8⁺ Т клетки, в то время как DR.363 содержит только эпитоп CD4⁺ Т клетки (107).

Как видно из Таблицы 2, отклики IFN-γ на пептиды DR.316 были детектированы у 4 из 10 примированных ДНК добровольцев, в сравнении с 0 из 14 непримированных добровольцев после первой дозы вакцины RTS,S (р=0, 0095), и в 6 из 10 примированных ДНК добровольцев по сравнению с 5 из 13 в непримированных добровольцах после первой и второй доз вакцины RTS,S (p=0,35). Когда все анализы были рассмотрены в общем (после первой и второй доз вакцины RTS,S), примированная ДНК группа имела большую частоту положительных анализов (положительные анализы/всего анализов, 17/60 против 8/81, р=0,0046), но не было разницы в величине откликов IFN-γ (диапазон SFCs: 11,9-106,3 [33,0] против 17,5-58,1 [28,4], р=0,21).

Таблица 2
Частота откликов IFN-γ на PƒCSP на уровне эпитопа Группа Число респондеров / число испытуемых (%) Число положительных анализов / общее число анализов (%) DR.316 DR.318 DR.363 DR.316 DR.318 DR.363 После первой иммунизации             Примированные ДНК 4/10 (40) 3/10 (30,0) 3/10 (30,0) 6/30 (20,0) 4/30 (13,3) 4/30 (13,3) Непримированные 0/14 (0) 0/14 (0) 2/14 (14,3) 0/42 (0) 0/42 (0) 2/42 (4,8) Значение р 0,0095 0,028 0,35 0,0025 0,015 0,195 После второй иммунизации             Примированные ДНК 5/10 (50,0) 6/10 (60) 1/10 (20) 11/30 (36,7) 10/30 (33,3) 4/30 (13,3) Непримированные 5/13 (38,5) 1/13 (7,7) 7/13 (54) 8/39 (20,5) 1/39 (20,5) 16/39 (41,0) Значение р 0,58 0,0069 0,099 0,136 0,00054 0,012 Всего             Примированные ДНК 6/10 (60) 6/10 (60) 4/10 (40) 17/60 (28,3) 14/60 (23,3) 8/60 (13,3) Непримированные 5/13 (38,5) 1/13 (7,7) 9/14 (64) 8/81 (9,9) 1/81 (1,2) 18/81 (22,2) Значение р 0,35 0,0069 0,24 0,0046 <0,00003 0,178

Также, как показано в Таблице 2, отклики IFN-γ на пептид DR.318, который не содержит первые две аминокислоты пептида DR.316, были детектированы в 3 из 10 примированных ДНК добровольцах по сравнению с 0 из 14 непримированных добровольцев после первой дозы вакцины RTS,S (p=0,028), и в 6 из 10 примированных ДНК добровольцах по сравнению с 1 из 13 непримированных добровольца после первой и второй доз вакцины RTS,S (р=0,0069). Анализы ELISPOT, выполненные после первой и второй доз вакцины RTS,S, в целом продемонстрировали, что группа, примированная ДНК, имела большую частоту положительных анализов (положительные анализы/общее число анализов, 14/60 против 11/81, р<0,00003). При условии, что имел место только единственный отклик на данный пептид в группе, которая получала только вакцину RTS,S, было невозможно сравнить величину откликов.

Отклики IFN-γ на пептид DR.363, который не содержит известный эпитоп CD8⁺ Т клетки, детектировались в 3 из 10 примированных ДНК добровольцах по сравнению с 2 из 14 в непримированных добровольцах после первой дозы вакцины RTS,S (p=0,35) и в 4 из 10 из примированных ДНК добровольцев по сравнению с 9 из 14 непримированных добровольцев в целом после первой и второй дозы вакцины RTS,S (р=0,24) (Таблица 2). Анализы, сделанные после первой и второй доз вакцины RTS,S, не показали значительной разницы между примированной ДНК группой и группой только с RTS,S по частоте положительных анализов (положительные анализы/общее число анализов, 8/60 против 18/81, р=0,178). Но имела место значительно большая величина откликов IFN-γ в непримированных ДНК добровольцах по сравнению с примированными ДНК добровольцами после второй дозы вакцины RTS,S (диапазон SFCs: 13,1-58,8 [26,4 среднегеометрическое значение] на 10⁶ клеток против 14,0-140,6 [47,9 среднегеометрическое значение] на 10⁶ клеток, р=0,004).

Подобным же образом, после двух доз вакцины RTS,S, не было разницы в частоте положительно откликающихся индивидуумах между примированной ДНК группой и группой только с RTS,S (8/10 против 11/13). См. Таблицу 1. Индивидуумы в примированной ДНК группе откликались на значительно большее число испытываемых пептидов, чем добровольцы, которые получали только вакцину RTS,S. Из 8 респондеров в 10 примированных ДНК добровольцах, один имел отклики против всех четырех испытываемых пептидов 15-20 аминокислот, один откликался на три пептида, 5 на два пептида и только один откликался на один пептид. Из 11 респондеров в 13 непримированных добровольцах, один откликался на 3 пептида, два откликались на 2 пептида и восемь откликались только на один пептид (2/8 откликались на DR.316 и 6/8 откликались на DR.363). В целом 7 из 8 примированных ДНК добровольцев по сравнению с 3 из 11 непримированных добровольцев откликались на, по крайней мере, два испытываемых пептида (р=0,0094).

Пример 4

Отклики IFN-γ Т клетки на HBsAg

RTS,S является слитым белком части PƒCSP и поверхностного антигена гепатита В (HBsAg). Иммунизация RTS,S в адъюванте была значительно менее эффективна для индуцирования откликов Т клетки среди индивидуумов с антителами на HBsAg. Этот эффект был значительно более явным в примированных ДНК добровольцах. Из-за отмеченного влияния статуса антитела HBsAg на отклик на четыре пептида аминокислоты 15-20, мы расширили исследования. Отклики IFN-γ на PƒCSP и HBsAg сравнивались проведением анализа ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа) с пулом из 13 пептидов PƒCSP (pPƒCSP) и пулом из 19 пептидов HBsAg одновременно в мононуклеарах периферической крови (РВМС) во всех временных точках исследования после первой и второй иммунизации RTS,S. В не подвергнутых воздействию, непримированных ДНК индивидуумах, компонент HBsAg был иммунодоминантным для откликов Т клетки (сравни 0/6 респондеров для PƒCSP на 6/6 респондеров для HBsAg для HBsAg-отрицательных, непримированных добровольцев и 1/8 респондеров на PƒCSP до 7/8 респондеров на HBsAg для HBsAg-позитивных непримированных добровольцев), но примирование ДНК PƒCSP, кажется, балансирует эту иммунодоминантность, направляя отклики Т клетки по направлению к PƒCSP (Таблица 3; сравни 2/4 респондера для PƒCSP на 2/4 респондера для HBsAg для и HBsAg-отрицательных, примированных добровольцев, и 4/6 респондеров для PƒCSP до 6/6 респондеров для HBsAg для HBsAg-положительных примированных добровольцев).

Таблица 3
Частота и величина откликов IFN-γ между HBsAg серопозитивными и сероотрицательными добровольцами. Отклик на пептидный
пул Примированные ДНК добровольцы Непримированые добровольцы HBsAg (+) HBsAg (-) Значение р HBsAg (+) HBsAg (-) Значение р Частота [положительные респондеры/общее число добровольцев (%)] После первой иммунизации pPƒCSP 4/6 (66,7) 2/4 (50,0) 0,6 1/8 (12,5) 0/6 (0) 0,37 pHBsAg 6/6 (100,0) 2/4 (50,0) 0,05 7/8 (87,5) 6/6 (100,0) 0,37 Значение р 0,12 1,00   0,003 0,0005   После второй иммунизации pPƒCSP 5/6 (83,0) 3/4 (75,0) 0,75 3/7 (42,9) 5/6 (83,0) 0,14 pHBsAg 5/6 (83,0) 3/4 (75,0) 0,75 7/7 (100,0) 6/6 (100,0) -

Значение р 1,00 1,00   0,018 0,3   Частота [положительные анализы/общее число анализов (%)] После первой иммунизации pPƒCSP 4/15 (26,7) 2/11 (18,2) 0,61 2/23 (8,7) 0/15 (0) - pHBsAg 12/15 (80,0) 3/11 (27,3) 0,007 16/23 (69,6) 9/15 (60,0)* 0,54 Значение р 0,0034 0,61   0,00002 -   После второй иммунизации pPƒCSP 9/18 (50) 7/12 (58,3) 0,65 3/21 (14,3) 12/18 (66,7) 0,0008 pHBsAg 12/18 (66,7) 7/12 (58,3) 0,64 16/21 (76,2) 17/18 (94,4)* 0,12 Значение р 0,31 1,00   0,00006 0,035   Величина [чистые SFCs/10⁶ PBMCs (среднегеометрическое значение) После первой иммунизации pPƒCSP 19,5-52,2 (33,7) 53,1-82,5 (66,2) 0,23 35,6-54,4 (44,0) Отрицательный - pHBsAg 13,5-80,0 (37,7) 21,3-144,4 (46,0) 0,54 13,1-222,9 (60,1) 13,1-132,5 (33,9)* 0,013 Значение р 0,41 0,78   0,052 -   После второй иммунизации pPƒCSP 18,1-68,8 (33,8) 11,7-122,5 (37,9) 0.11 25,0-54,4 (37,6) 17,5-125,6 (46,1) 0,09 pHBsAg 18,8-131,3 (52,8) 17,9-215,0 (57,6) 0,34 20,0-278,8 (62,3) 12,5-317,5 (97,3)* 0,013 Значение р 0,024 0,29   0,0032 0,0001   * Как частота, так и величина откликов IFN-γ на HBsAg в HBsAG серонегативных добровольцах из непримированной группы была значительно увеличена после второй иммунизации по сравнению с после первой иммунизацией и р значениями = 0,035 и 0,00003, соответственно.

В непримированных добровольцах отклики IFN-γ на HBsAg были высокими во всех индивидуумах независимо от того, имели ли они антитела к HBsAg (Таблицы 3 и 4; см. непримированных добровольцев). Как показано в Таблице 3, после первой дозы вакцины RTS,S величина откликов на пептидный пул HBsAg была значительно больше в индивидуумах с предварительно существовавшими антителами на HBsAg, чем у тех, кто не имел таких антител (диапазон SFCs/10⁶ [среднегеометрическое значение]: 13,1-222,9 [60,1] против 13,1-132,5 [33,9], р=0,013). После второй иммунизации вакциной RTS,S, однако, не было разницы в величине IFN-γ между двумя группами (см. данные по величине). Отклики на HBsAg в индивидуумах, имеющих отрицательную реакцию на антитела HBsAg, были значительно увеличены после второй дозы вакцины RTS,S по сравнению с после первой дозы (Таблица 3). Конкретно, частота положительных анализов после двух доз вакцины RTS,S была 17/18 по сравнению с 9/15 после первой дозы (р=0,035) (см. ссылку к Таблице 3). Величина отклика IFN-γ была 12,5-317,5 [среднегеометрическое значение=97,3] по сравнению с 13,1-132,5 [среднегеометрическое значение=533,9] с только одной дозой (р=0,024) (см. ссылку к Таблице 3). После второй дозы число клеток, образующих ореол (SGCs), было значительно больше у индивидуумов, имеющих отрицательную реакцию на антитела HBsAg, чем у индивидуумов, имеющих положительную реакцию на антитела HBsAg (12,5-317,5 [97,3] по сравнению с 20,0-278,8 [62,3], р=0,013) (Таблица 3).

Как это видно из Таблицы 3, отклики IFN-γ на PƒCSP демонстрировали другую картину по сравнению с откликами на HBsAg. Тринадцать из четырнадцати непримированных добровольцев откликались на HBsAg после одной дозы вакцины RTS,S, как показано в 7 из 8 HBsAg-положительных добровольцах и во всех 6 HBsAg-отрицательных добровольцах. В отличие от этого, только один из 14 индивидуумов откликался на PƒCSP (p=0,0049), как показано 1 из 8 HBsAg-положительных добровольцах и 0 из 6 HBsAg-отрицательных добровольцах. В целом, индуцированные RTS,S отклики IFN-γ были значительно ниже на PƒCSP, чем на HBsAg во всех добровольцах, которые не были примированы ДНК, и даже ниже в индивидуумах с предварительно существовавшими анти-HBsAg антителами (Таблица 3), как это было измерено частотой положительных респондеров и положительных анализов после первой и второй доз RTS,S. См. значения р для непримированных добровольцев. Подобным же образом, величина откликов IFN-γ была ниже после каждой иммунизации как у индивидуумов, имеющих положительную реакцию на антитела HBsAg (p<0,05-0,0032), так и у индивидуумов, имеющих отрицательную реакцию на антитела (р=0,0001) (Таблица 3). См выделенные значения р в разделе величины Таблицы 3. Эти данные демонстрируют, что в непримированных индивидуумах RTS,S вызывала отклики Т клетки на РfCSP и на HBsAg, при этом отклик на HBsAg был значительно более сильным, чем отклик на PƒCSP (Таблица 4).

В примированных ДНК добровольцах, которые также имели положительную реакцию на HBsAg, число положительных анализов после первой дозы RTS,S было больше на HBsAg, чем на PƒCSP (12/15 против 4/15, р=0,0034) (Таблица 3). После введения второй дозы вакцины RTS,S, однако, частота положительных анализов на PƒCSP не отличалась от частоты для HBsAg у добровольцев, имеющих положительную реакцию на антитело HBsAg. См. данные по частоте для примированных ДНК добровольцев. В примированных ДНК, имеющих отрицательную реакцию на HBsAg добровольцах, эти частоты не отличались после первой или второй дозы вакцины RTS,S. Величина откликов на PƒCSP и HBsAg была одинаковая после первой дозы, независимо от статуса антитела HBsAg (Таблица 3). Но после второй дозы в примированных ДНК, HBsAg-положительных индивидуумах, величина откликов на HBsAg значительно увеличивалась по сравнению с величиной откликов на PƒCSP (диапазон SFCs/10⁶ PBMC [среднегеометрическое значение]: 18,1-68,8 [33,8] против 18,8-131,3 [52,8], р=0,024). Эти результаты указывают, что отклики на HBsAg могут постепенно преобладать над откликами на РfCSP, если вводятся многократные дозы вакцины RTS,S.

Пример 5

Вакцина ДНК индуцирует отклики как типа Тс1 (СD8 ⁺ ), так и отклики типа Тh1 (CD4 ⁺ ), в то время как RTS,S индуцирует только отклики Тh1 у человека

Как одна вакцина ДНК PƒCSP, так и одна вакцина RTS,S способны индуцировать отклики IFN-γ, так что после второй дозы вакцины RTS,S, отклики IFN-γ в обеих группах были эквивалентны с точки зрения положительных респондеров (8/10 по сравнению с 11/14) (Таблица 1). Тем не менее, как отмечалось ранее, отклики IFN-γ, индуцированные вакциной ДНК PƒCSP или только вакциной RTS,S, зависели от различных поднаборов Т клеток. Иммунизация ДНК индуцирует как отклики IFN-γ, зависящие от CD4⁺, так и зависящие от CD8⁺ отклики, a RTS,S индуцирует только зависящие от CD4⁺ отклики Т клетки (61).

Т клеточные профили откликов IFN-γ как в индукторной, так и в эффекторной фазах in vitro характеризовались иммуноферментным спот- анализом (ELISPOT) и полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) в реальном масштабе времени, соответственно, с РВМС (мононуклеары периферической крови) от добровольцев, иммунизированных только ДНК, только RTS,S или от примированных ДНК/стимулированных RTS,S добровольцев.

Анализы ELISPOT выполнялись с РВМС обедненных Т клеток CD4⁺ или CD8⁺ до культивирования с пептидами, используя покрытые анти-CD4⁺ или анти-CDS⁴⁺ Dynabeads М-450 (Динал Инк., Грейт Нек, Нью-Йорк). Уровни экспрессии IFN-γ мРНК измерялись в реальном масштабе времени полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) в селективно обогащенных популяциях Т клеток: CD4⁺/CD45RA⁺, CD4⁺/D45RA^-, CD8⁺/CD45RA⁺, и CD8⁺/CD45RA^- Т клеток. В этих анализах замороженные РВМС были восстановлены культивированием ночью в 24-х скважинной тарелке при 3×6¹⁰ клеток/скважина в 2 мл полной среде RPMI с 10% человеческого белка и затем стимулировались коротким пептидом (пептидная последовательность 9-10 аминокислот А2, GILGFVFTL; последовательность №27) в течение 2 часов или длинной последовательностью пептидов (15-20 аминокислот) в течение 4 часов при 10 мкг/мл. Затем мононуклеары периферической крови (РВМС) были собраны и обогащены для Т клеток CD4⁺ или CD8⁺ через микрогранулы CD45MRA (Милтеней Биотек, Оберн, Калифорния).

Для количественного определения IFN-γ мРНК в реальном времени полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) все РНК были изолированы от обогащенных поднаборов Т клеток, используя комплект RNeasy (Киаген, Валенсия, Калифорния). Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована из общего количества РНК, используя произвольные гекзаметры и набор обратной транскрипции TaqMan (РЕ прикладные биосистемы, Калифорния). Относительная квантификация IFN-γ мРНК в реальном времени полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) осуществлялась на детекторе последовательности ABI PRISM 7700 (Перкин-Элмер), используя набор обратной транскрипции TaqMan в соответствии с инструкциями изготовителя. Праймеры, пробы и стандарты для усиления IFN-γ и мРНК GAPDH были сконструированы и стандартизованы на месте. Относительная квантификация IFN-γ мРНК в реальном времени полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) выполнялась на детекторе последовательности ABI PRISM 7700 (Перкин-Элмер), используя набор обратной транскрипции TaqMan в соответствии с инструкциями изготовителя. Праймеры:

(hIFN-g-F, TTGGTGATGATTTGAACATTGGA, последовательность №28;

hIFN-g-R, CCCAGTTCCTGCAGAGTAGAAAA, последовательность №29;

hGAPDH,5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, последовательность №30;

hGAPDH-R,GAAGATGGTGATGGGATTTC последовательность №31);

пробы:

(проба hIFN-g:TGTCACTTGCAAACACACAGCTTGTCGAA, последовательность №32;

проба hGAPDH:CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC, последовательность №33) для усиления мРНК IFN-g и GAPDH были сконструированы и стандартизованы на месте в соответствии с протоколом изготовителя. Усиление GAPDH производилось для каждого экспериментального образца в качестве эндогенного контроля для учета разницы в количестве и качестве общего числа РНК, добавляемых к каждой реакции. Условия термического циклирования были 2 минуты при 50°С и 10 минут при 95°С, за которыми следовало 50 циклов 2 этапа PCR, состоящих из 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Все образцы были усилены в три раза. Пороговый цикл (Ct), который обратно коррелируется с намеченными уровнями мРНК, измерялся как номер цикла, при котором увеличивалась флуоресцентная эмиссия над пороговым уровнем. Экспрессия гена мишени была нормализована между различными образцами, основываясь на значениях экспрессии гена GAPGH.

Обедненные популяции Т клетки инкубировались с определенными пептидами PƒCSP до анализов ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ) для идентификации, какие наборы Т клеток участвовали в индукционной фазе откликов IFN-γ in vitro. Параллельно оценивались уровни экспрессии IFN-γ у мРНК с помощью полимеразно-цепьевой реакции (PCR) в реальном времени в обогащенных поднаборах популяций Т клеток после инкубации мононуклеаров периферической крови с теми же пептидами, используемыми для анализов ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ) для трансдифференцировки эффекторных Т клеток, которые фактически выделили IFN-γ. Отклики на пептид DR.363 (содержащий только ограниченный эпитоп Т клетки CD4⁺ класса II) и DR.316 (содержащий перекрывающиеся ограниченные эпитопы CD4⁺ и CD8⁺ класса I и класса II) оценивались для сравнения механизмов, лежащих в основе откликов IFN-γ на PƒCSP при различных системах доставки вакцины. Отклики на ограниченный HLA-A2, иммунодоминантный и сохраненный эпитоп Т клетки CD8⁺ из белка матрицы гриппа (Flu M A2) и на ограниченный HLA-DR эпитоп Т клетки CD4⁺ от токсина столбняка (TT-DR) были также оценены параллельно для обеспечения внутренней стандартизации между различными эпитопами, анализами и добровольцами.

Индуцирование in vitro откликов IFN-γ на пептид Flu V A2 было зависимым от Т клетки CD8⁺, а не CD4⁺ так как истощение Т клеток CD8⁺, а не CD4⁺ непосредственно перед культивированием мононуклеаров периферической крови (РВМС) полностью ликвидировало или значительно снижало отклики IFN-γ во всех 17 протестированных индивидуумах, независимо от того, какой тип антималярийной вакцины они получали (фиг.2а). В отличие от этого, отклики на пептид TT-DR были полностью зависимы от Т клетки CD4⁺, а не СD8⁺ у всех 3 протестированных положительных респондеров (фиг.2b).

Уровни экспрессии IFN-γ мРНК, измеренные полимеразно-цепьевой реакцией (PCR) в реальном времени в 4 обогащенных популяциях Т клеток (CD4⁺/CD45RA⁺, CD4⁺/CD45RA^-, CD8⁺/CD45RA⁺, и CD8⁺/CD45RA^-), совпадали с данными, полученными из анализов ELISPOT (иммуноферментного спот анализа). IFN-γ мРНК был преобладающе позитивно отрегулирован в Т клетках CD8⁺ после стимуляции пептидом Flu M A2 (Фиг.2е: стандарты). Уровни экспрессии IFN-γ мРНК возрастали в 6,8 раз (диапазон 3,4-12,9 раз) в Т клетках CD8⁺ по сравнению с 2,2 раза (диапазон 0,98-7,58 раз) в Т клетках CD4⁺ (р=0,03). Процент позитивной регуляции IFN-γ мРНК в CD8⁺ по сравнению с CD4⁺ составил в среднем 78% (диапазон 62-99%). В отличие от этого IFN-γ мРНК был преобладающе позитивно отрегулирован в Т клетках CD4⁺ после стимуляции TT-DR (фиг.2е: стандарты). Уровни IFN-γ мРНК возрастали в 7,6 раз (диапазон 2,4-18,3) в Т клетках CD4⁺ по сравнению с 2,2 разами (диапазон 1,1-4,6) в Т клетках CD8⁺ (р=0,02). Позитивная регуляция IFN-γ мРНК в Т клетках CD4⁺ по сравнению с Т клетками CD8⁺ составила 70% (диапазон 74-100%). Эти результаты указывали, что Т клетки CD8⁺ являются функциональными возбудителями откликов IFN-γ на пептид Flu M A2, в то время как Т клетки CD4⁺ являются возбудителями отклика на пептид TT-DR.

Проведя параллельные анализы с двумя стандартами, как описано выше, мы выяснили профили Т клетки для откликов IFN-γ, индуцированных вакциной ДНК/PƒCSP или вакциной RTS,S на два различных пептида PƒCSP (DR.363 и DR.316). В соответствии с тем фактом, что пептид DR.363 содержит эпитоп Т клетки CD4⁺, а не эпитоп Т клетки CD8⁺, результаты анализа ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа) с обедненными популяциями Т клеток показали, что отклики IFN-γ на пептид DR.363 полностью зависели от Т клеток CD4⁺ у добровольцев, которые получали только вакцину ДНК/PƒCSP (тестировано 2/2, V1 и V5) или только вакцину RTS,S (6/6 тестированных) (фиг.2с).

Уровни экспрессии IFN-γ мРНК в обогащенных популяциях Т клеток были скоррелированы с зависимостью Т клеток с помощью ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа). IFN-γ мРНК был позитивно отрегулирован преобладающим образом в Т клетках CD4⁺ как у добровольцев, иммунизированных вакциной PƒCSP ДНК, так и вакциной RTS,S (фиг.2е: DR.363). В пяти иммунизированных ДНК добровольцев, которые были протестированы, уровни IFN-γ мРНК возросли в 5,3 раз (диапазон 2,6-11,5) в Т клетках CD4⁺ по сравнению с увеличением 1,7 раза (диапазон 0,99-3,2) в Т клетках CD8⁺ (р=0,014). Позитивное регулирование в CD4⁺ превышало позитивное регулирование Т клеток CD8⁺ на 74% (диапазон 64-91%). Та же самая картина наблюдалась в четырех протестированных добровольцах, иммунизированных RTS,S (фиг.2е), где уровни IFN-γ мРНК возросли в 9,2 раза (диапазон 2,9-53,5) в CD4⁺ по сравнению с увеличением 0,9 раза (диапазон 0,6-1,1) в Т клетках CD8⁺. Позитивное регулирование в IFN-γ мРНК CD4⁺ превышало позитивное регулирование Т клеток CD8⁺ на 86% (диапазон 73-98%). Эти результаты представили первое свидетельство, что вакцина ДНК/PƒCSP индуцировала PƒCSP специфические и зависящие от Т клетки CD4⁺, в дополнение от зависящих от Т клеток CD8⁺ отклики IFN-γ у людей.

Отклики IFN-γ на DR.316 (перекрывающийся эпитоп Т клетки CD4⁺ и CD8⁺) зависели от различных поднаборов Т клеток в добровольцах, получающих либо только вакцину ДНК/PƒCSP, либо только вакцину RTS,S. Отклики зависели как от Т клеток CD4⁺, так и CD8⁺ в добровольцах, которые получали только ДНК (V1) (фиг.2d), как ранее отмечалось (107), по сравнению с зависящими только от Т клеток CD4⁺, но не CD8⁺, в добровольцах, которые получали только вакцину RTS,S (3/3 протестированных добровольца) (фиг.2d). Далее IFN-γ мРНК был позитивно отрегулирован преобладающе в Т клетках CD8⁺ в добровольцах, иммунизированных ДНК (фиг.2е: DR.316), хотя отклик зависел как от Т клетки CD4⁺, так и от Т клетки CD8⁺, при анализе ELISPOT (иммуноферментном спот-анализе).

Уровни экспрессии IFN-γ мРНК возросли в 64,7 раз в Т клетках CD8⁺ по сравнению с 0,36 раз в Т клетках CD4⁺ а позитивное регулирование IFN-γ мРНК в CD8⁺ над Т клетками CD4⁺ составило 99,6%. В отличие от этого транскрипция IFN-γ мРНК была позитивно регулирована преобладающе в Т клетках CD4⁺ в добровольцах, иммунизированных вакциной RTS,S (фиг.2е: DR.316). Уровни экспрессии IFN-γ мРНК возросли в 24,7 раз (диапазон 5,3-176,7 раз) в Т клетках CD4⁺ по сравнению с 2,5 раз (диапазон 1,1-5,6 раз) в Т клетках CD8⁺. Позитивное регулирование IFN-γ мРНК в CD4⁺ над Т клетками CD8⁺ составило 86% (диапазон 69-98%). Эти результаты указывали, что при иммунизации ДНК Т клетки CD4⁺ участвовали только в индукционной фазе in vitro отклика IFN-γ и что Т клетки CD8⁺ являются клетками, которые фактически осуществляют секрецию IFN-γ против DR.316. В отличие от этого в иммунизированных вакциной RTS,S индивидуумах эти результаты показывали, что Т клетки CD4⁺ являются Т клетками эффекторами, которые производят IFN-γ против того же пептида (DR.316).

Пример 6

Примирование ДНК/стимулирование RTS,S расширяет репертуар Т клеток, производящих IFN-γ

Репертуар Т клеток, производящих гамма-интерферон (IFN-γ), был изменен в направлении дифференцировки стимулированием вакциной RTS,S в примированных ДНК добровольцах. Отклик IFN-γ на пептид DR.363 (не содержит эпитоп Т клетки

CD8⁺)зависел только от Т клетки CD4⁺ в добровольцах, иммунизированных либо только вакциной PƒCSP ДНК, либо только вакциной RTS,S. Такой же тип отклика на DR.363 детектировался в 2/3 респондерах (V1 и V5) в примированной ДНК группе после стимулирования RTS,S. Удивительно, величина откликов, измеренная уровнями экспрессии IFN-γ мРНК в Т клетках CD4⁺ увеличивалась в 94,9 раз в добровольце V1 и в 46,7 раз в добровольце V5 после стимулирования RTS,S по сравнению с увеличением в 7,6 раз в V1 и в 12,5 в V5 после иммунизации 3 дозами только ДНК. См. полоски, относящиеся только к ДНК на фиг.3. Величина откликов после стимулирования RTS,S была в 12,5 раз выше в V1 и в 3,7 раза выше в V5, чем после иммунизации ДНК (фиг.3; сравни полоски «Только ДНК» с полосками «ДНК/RТ5,5»).

Отклики IFN-γ на пептид DR.316 зависели от различных поднаборов Т клеток в добровольцах, получавших либо вакцину PƒCSP ДНК, либо только вакцину RTS,S. Вызванные ДНК отклики зависели как от Т клетки CD4⁺, так и от Т клетки CD8⁺ на фазе индукции, но зависели только от Т клетки CD8⁺ на эффекторной фазе. Когда измерялась эффекторная фаза, популяции Т клеток обеднялись после стимуляции пептидами. В отличие от этого индуцированные RTS,S отклики зависели только от Т клетки CD4⁺ как в индукторной, так и в эффекторной фазе. Таким образом, не удивительно, что отклики на DR.316 в примированных ДНК добровольцах после стимулирования RTS,S представляли собой смесь двух картин, наблюдаемых в добровольцах, иммунизированных либо только ДНК, либо только RTS,S (фиг.2d).

В индукционной фазе in vitro детектировались как зависящие от Т клетки CD4⁺, так и от Т клетки CD8⁺ отклики IFN-γ на пептид DR.316 в 3/5 респондерах (4/6 анализов) после первой дозы RTS,S. Полностью зависимые от Т клетки CD4⁺, но только частично зависимые от Т клетки CD8⁺,отклики IFN-γ детектировались в 4/6 респондерах (7/12 анализов) после второй дозы RTS,S. Обеднение Т клеток CD8⁺ не прекращало производство IFN-γ (фиг.4а), указывая, что Т клетки CD4⁺ производят IFN-γ так же, как и Т клетки CD8⁺ после стимулирования RTS,S. Одновременно в эффекторной фазе уровни экспрессии IFN-γ мРНК были позитивно регулированы не только в Т клетках CD8⁺ но также в Т клетках CD4⁺ (4/8 респондеров после первой дозы, 6/8 респондеров после второй дозы RTS,S) по сравнению с позитивным регулированием только Т клеток CD8⁺ в добровольцах, иммунизированных только ДНК, или в только Т клетках CD4⁺ в добровольцах, иммунизированных только RTS,S (фиг.2е: DR.316 сравнить v1 с V22 (RTS.S)).

В целом, позитивное регулирование IFN-γ мРНК как в Т клетках CD8⁺, так и CD4⁺, детектировалось в 6 из 8 респондеров, и позитивное регулирование IFN-γ мРНК в Т клетках CD4⁺ составило диапазон от 3,0 до 28,3 раз (среднегеометрическое значение, 6,6 раз) по сравнению с позитивным регулированием в Т клетках CD8⁺, которое составило диапазон от 4,0 до 281,03 (среднегеометрическое значение, 19,7 раз) после стимулирований RTS,S. Процент позитивного регулирования IFN-γ мРНК в CD4⁺ над Т клетками CD8⁺ составил 23,5% (диапазон 6,5-45,1%). Данные результаты продемонстрировали, что специфичные к DR.316 Т клетки CD4⁺ в примированных ДНК добровольцах после стимулирования RTS,S функционировали не только как Т клетка помощник для производства Т клеткой CD8⁺ IFN-γ (признак индуцированного ДНК отклика IFN-γ), но также в качестве эффекторов, производящих IFN-γ (признак индуцированного RTS,S отклика IFN-γ) (Таблица 5).

Приведенные выше данные демонстрируют зависящие от Т клетки CD8⁺ отклики IFN-γ в примированных ДНК-стимулированных RTS,S добровольцах, но не показывали его в непримированных добровольцах. Эти данные также демонстрируют как зависимые от CD4⁺, так и от CD8⁺ отклики IFN-γ на одинаковый эпитоп. Пептид DR.316 идентифицировался как эпитоп, перекрывающий CD4 и CD8, основываясь на зависимости откликов IFN-γ на различные поднаборы Т клеток.

Таблица 4
Сравнение откликов IFN-γ в примированных ДНК и непримированных группах после иммунизации RTS,S Отклики IFN-γ на Специфический антиген PƒCSP Основной антиген HBsAg Серология HBsAg у базовой линии HBsAg (+) HBsAg (-) HBsAg (+) HBsAg (-) Примированная ДНК группа         После первой дозы ++ ++ ++ ++ После второй дозы ++ ++ ++ ++ Непримированная группа         После первой дозы +/- - +++ +++ После второй дозы + ++ ++++ ++++

Критерии подсчета отклика основаны на статистически значимом увеличении (р<0,05) с точки зрения (1) частоты положительных респондеров, (2) частоты положительных анализов, и (3) величины положительных откликов по сравнению с базовой линией, а также (4) значительного увеличения откликов IFN-γ после второй иммунизации по сравнению с после первой иммунизации, - означает, что нет откликов; +\- означает увеличение, но не статистически значимое; +, ++, +++ и ++++ представляют собой значительное увеличение в одном, 2, 3 или 4 из 4 критериев соответственно.

Пример 7

Отклики антитела в примированных ДНК/стимулированных RTS,S добровольцах

Отклики антитела на высушенные на воздухе спорозоиты Р.falciparum оценивались перед иммунизацией RTS,S и через 2, 4, 6 и 8 недель после первой и 1, 2, 4 и 6 недель после второй дозы RTS,S. Титры антител определялись непрямым флуоресцентным тестом антител (IFAT), как это было описано ранее (33). Как и ожидалось, титры антител были превосходные, хотя имела место некоторая переменчивость в откликах антител среди групп (фиг.5). Титры имели пик через 44 недели после второй дозы вакцины RTS,S при геометрическом среднем титров в диапазоне от 5120 до 20480. Однако не было статистически значимой разницы в титрах антител против всех спорозоитов в любой момент времени с одним исключением. Через 2 недели после первой дозы геометрический средний титр антител, определенный IFAT, 3225, в группе добровольцев, которые никогда не принимали PƒCSP и имели антитела на HBsAg (ДНК-/НВ+) был больше, чем геометрический средний титр, 718, 4, в добровольцах, которые принимали PƒCSP и имели антитела на HBsAg (ДНК+/НВ+) (Р=0,02). Это было в первую очередь вызвано более высоким титром, 10240, отдельного добровольца в группе ДНК-/НВ+, который отстранился от исследования после 6 недель, как раз перед планировавшейся второй иммунизацией RTS,S. После второй дозы RTS,S не присутствовала статистически важная разница между группами.

Заключение

Процесс разработки эффективной, устойчивой вакцины против такой инфекции как Р.falciparum, Mycobacterium tuberculosis и ВИЧ, оказался более медленным, более трудным и сложным, чем ожидалось. Вышеупомянутый анализ изобретения демонстрирует, что примирование PƒCSP ДНК и стимулирование RTS,S приводит к индуцированию откликов как клеточными, так и гуморальными группами иммунной системы. Далее, среди индивидуумов с антителами на HBsAg, те индивидуумы, которые примировались вакциной PƒCSP ДНК, производили значительно лучшие отклики Т клеток после приема адъювантной вакцины RTS,S, чем те добровольцы, которые никогда не получали PƒCSP ДНК. Так как большинство реципиентов вакцин от малярии, или других вакцин, будут иметь антитела на HBsAg, либо в связи с иммунизацией, либо с инфекцией, это может обеспечить важное преимущество данной стратегии иммунизации, состоящей из примирования и стимулирования.

Этот анализ показывает, что примированные ДНК специфические к PƒCSP отклики цитотоксического Т лимфоцита (ЦТЛ) имели вторичный иммунный отклик в 50% добровольцах путем стимуляции RTS,S через 12-14 месяцев после последней вакцинации ДНК, указывая, что вакцина ДНК была высокоэффективна в индуцировании долгоживущего вторичного иммунного ответа Т клеток. Два из 5 добровольцев с вторичным иммунным откликом цитотоксического Т лимфоцита (ЦТЛ) после инъекции RTS,S не имели детектируемых цитотоксических Т лимфоцитов (ЦТЛ) после иммунизации только ДНК, давая основания полагать, что вакцина ДНК была более важна для индуцирования вторичного иммунного ответа Т клеток в тех индивидуумах, но могла быть не оптимальной для индуцирования откликов эффекторных Т клеток (38,92). Так как не было детектировано откликов цитотоксического Т лимфоцита (ЦТЛ) в непримированных добровольцах, которые получали только RTS,S, RTS,S не была способна примировать специфические для PƒCSP ЦТЛ, но имела возможность стимулировать отклики ЦТЛ, инициированные вакциной ДНК. Примированные ДНК специфические к PƒCSP отклики IFN-γ также стимулировались RTS,S, особенно после первой дозы. Шесть из 10 примированных ДНК добровольцев имели отклики IFN-γ против всех 4 тестированных пептидов по сравнению с 2 из 14 непримированных добровольцев, которые имели отклики против только одного из 4 пептидов. После двух доз RTS,S, хотя и не было заметной разницы с точки зрения частоты и величины откликов, ширина откликов IFN-γ на уровне эпитопа была значительно больше в примированных ДНК добровольцах по сравнению с непримированными добровольцами. Семь из 8 примированных ДНК добровольцев против 3/11 непримированных добровольцев откликались на, по крайней мере, 2 тестируемых пептида (р=0,0094).

Результаты также дают основания полагать, что примирование ДНК/стимулирование RTS,S расширяет репертуар производящих IFN-γ Т клеток. Примирование ДНК инициировало два профиля производящих IFN-γ Т клеток: (1) зависимые от Т клеток CD4⁺ отклики CD8⁺ типа 1 против наложения эпитопов Т клетки CD4⁺/CD8⁺ (DR.316 и DR.318) и (2) отклики IFN-γ CD4⁺ типа 1 на ограниченные DR эпитопы Т клетки CD4⁺(DR.363). С другой стороны, только RTS,S индуцировала только отклики IFN-γ CD4⁺ типа 1 (фиг.2). Что касается DR.316, наложение эпитопа Т клетки CD4⁺/CD8⁺, только ДНК индуцировало зависимые от

CD4⁺ отклики CD8⁺ типа 1, а только RTS,S индуцировала отклики CD4⁺ типа 1. Однако примирование ДНК и стимулирование RTS,S индуцировало обе схемы откликов IFN-γ на DR.316 одновременно (фиг.4, таблица 4). В дополнение, RTS,S стимулировала отклики ЦТЛ на новые эпитопы ЦТЛ, не детектируемые после примирования ДНК.

Т клетки CD4⁺ могут функционировать в качестве фоновой (отвечающей на данный антиген) клетки помощника для производства IFN-γ Т клетками CD8⁺. Вышеупомянутые результаты подтверждают эту гипотезу параллельным проведением анализов ELISPOT (иммуноферментного спот-анализа) и PCR (полимеразно-цепьевой реакции) параллельно, в обедненных или обогащенных популяциях Т клетки перед или после стимуляции мононуклеаров периферической крови (РВМС) пептидом in vitro, соответственно. Сравнение числа производящих IFN-γ клеток и уровней экспрессии IFN-γ мРНК (матричной [информационной] РНК) перед или после стимуляции пептидом, выделили функциональные профили Т клеток, охваченных откликами IFN-γ, индуцированными либо вакциной ДНК, либо только вакциной RTS,S.

Представленные здесь результаты дают основания полагать, что примирование может направлять послестимуляционные отклики на примированный антиген. Что касается иммунизации RTS,S, это кажется особенно важным. RTS,S была сконструирована с HBsAg в качестве носителя, который бы усиливал отклики Т клеток на антиген малярии PƒCSP. Индивидуумы с антителами против антител HBsAg на базовой линии были ранее иммунизированы вакциной гепатита В. Ожидалось, что благодаря антималярийной вакцине, которая поставлялась в страны Африки, расположенные к югу от Сахары, исходное население имело значительную подверженность воздействию или прежнюю вакцинацию от HBsAg.

Сравнение откликов IFN-γ на PƒCSP между примированными ДНК и непримированными добровольцами показало значительные различия между теми индивидуумами, которые имели существующие антитела анти-HBsAg (таблица 1, 3 и 5). Параллельное сравнение откликов IFN-γ на HBsAg и PƒCSP индивидуально обнаружили, что индуцированные RTS,S отклики IFN-γ были значительно ниже на PƒCSP, чем на HBsAg во всех добровольцах, которые не были примированы ДНК и были даже еще ниже в индивидуумах с предварительно существовавшим анти-HBsAg. Хотя 13/14 контрольных добровольцев откликнулись на HBsAg после одной дозы RTS,S, отклики IFN-γ на PƒCSP детектировались только в одном из 14 индивидуумов. С другой стороны, отклики на основной антиген в примированных ДНК добровольцах имели мало или вообще не имели воздействия на индуцирование откликов IFN-γ на PƒCSP, как частота, так и величина откликов IFN-γ на PƒCSP была эквивалентна у HBsAg серо-позитивных и серо-отрицательных индивидуумов после стимулирования RTS,S (таблица 5). Результаты продемонстрировали, что ДНК инициирует и направляет отклик Т клетки на специфический антиген, и балансирует желаемый иммунитет вместе с фоновыми откликами. Примированные ДНК добровольцы имели сопоставимые отклики IFN-γ как на PƒCSP, так и на HBsAg, независимо от серо-позитивности анти-HBsAg; непримированные добровольцы имели значительно более сильные отклики IFN-γ на HBsAg по сравнению с PƒCSP (Таблица 4).

Теперь значительные усилия направлены на создание рекомбинантных слитых белков и рекомбинантных вирусов и бактерий, которые осуществляют экспрессию намеченных белков. Во многих случаях для HBsAg, вакцинальной болезни, полиовируса и Salmonella typhi, иммунизированные индивидуумы имели ранее существовавшие антитела против этих основных компонентов вакцины. Тот факт, что в индивидуумах с антителами на основной компонент вакцины (например, HBsAg,), примирование ДНК, кодирующее намеченные белки, значительно усиливало иммунные отклики Т клетки на эти белки по сравнению с примированием только рекомбинантным белком, может быть преимуществом данной стратегии иммунизации примирования и стимулирования.

Таблица 5
Репертуар Т клетки антиген специфических откликов IFN-γ Пептид Только ДНК Только RTS,S Примирование ДНК/ /Стимулирование RTS,S Flu M A2 (эпитоп CD8 ⁺ Т) Индукционная фаза CD8⁺ CD8⁺ CD8⁺ Эффекторная фаза CD8⁺ CD8⁺ CD8⁺ TT-DR (эпитоп CD4 ⁺ Т) Индукционная фаза CD4⁺ CD4⁺ CD4⁺ Эффекторная фаза CD4⁺ CD4⁺ CD4⁺ PƒCSP DR.363 (эпитоп CD4 ⁺ Т) Индукционная фаза CD4⁺ CD4⁺ CD4⁺ Эффекторная фаза CD4⁺ CD4⁺ CD4⁺ PƒCSP DR.316 (перекрывающийся эпитоп CD4 ⁺ Т и CD8 ⁺ Т) Индукционная фаза CD4⁺ и CD8⁺ CD4⁺ CD4⁺ и CD8⁺ Эффекторная фаза CD8⁺ CD4⁺ CD8⁺ и CD4⁺

Примирование иммунных откликов с использованием ДНК в качестве вакцины позволяет фокусировать первоначальные отклики Т клетки на рекомбинантном иммуногене просто потому, что это единственный посторонний белок, экспрессия которого была осуществлена в вакцине ДНК. Хотя рекомбинантный RTS,S или вирусы оспы могут быть внутренне более иммуногенными, чем векторы ДНК в качестве средства переноса вакцины, инфицированные вирусом клетки производят большое количество полученных от вирусов эпитопов, которые конкурируют с рекомбинантным иммуногеном за доминирование антигенной специфичности на поверхности Т клетки. Многие индивидуумы, принимающие вакцину, наиболее вероятно подвергались воздействию антигенам носителям, или получали другие вакцинации, содержащие антиген в рекомбинантном вирусе или белке, так что эффекторный отклик на антигены носители будет препятствовать индуцированию откликов на специфические антигены.

В данном исследовании антиген-специфичная клетка помощник CD4⁺, зависимые от Т клетки CD8⁺ отклики ЦТЛ и IFN-γ одновременно достигались в добровольцах при использовании стратегии примирования ДНК/стимулирования рекомбинантным белком. Эта стратегия, способная индуцировать оба вида иммунного отклика, предлагает уникальные преимущества для профилактических и терапевтических вакцин.

Следующие публикации, а также упомянутые в любом другом месте данной заявки, конкретно включаются в данный материал в виде ссылки.

1. Агуяр Дж.С, Хедстром Р.С., Роджерс В.О., Чароенвит Й., Саци Дж.Б. младший, Ланар Д.Е., Маджам В.Ф., Стоут P.P. и Хоффман С.Л. Усиление иммунного отклика в кроликах на вакцину ДНК малярии путем иммунизации безыгловым устройством. Вакцина 20: 275-80 (2001).

2. Айду М., Лалвани А., Олсопп С.Е, Плебански М., Мейснер С.Дж., Крауса П., Броунинг М., Морис Джонс С., Готч Д.А., Фидок Д.А. и др., Идентификация консервированного антигенного компонента для цитотоксической индуцирующей Т лимфоциты вакцины от малярии. Лансет 345: 1003 (1995).

3. Яман Ф., Гентон Б., Андерс Р., Фальк М., Триглия Т., Льюис Д. и др. Отношение между гуморальным откликом на мерозоитный поверхностный антиген Plasmodium falciparum и заболеваниями малярии в высокоэндемичной области Папуа Новой Гвинеи. Американский журнал тропической медицины, 51: 593 (1994).

4. Эл Яман Ф., Гентон Б., Андерс Р., Тарайка Дж., Гинни М., Меллор С. и др. Оценка роли гуморального отклика на Plasmodium falciparum MSP2 по сравнению с RESA и SPf66 в защите детей района Папуа Новой Гвинеи от клинической малярии. Парсит Иммунол 17: 493 (1995).

5. Андерс Р.Ф. Грюзер П.Е., Эдвардс С., Маргеттс М., Мэтью М.Л., Полок Б., Пай Д. Иммунизация рекомбинантным АМА-1 защищает мышей от инфекции Plasmodium Chabaudi. Вакцина 16 (2-3): 240-7 (1998).

6. Бароуч Д.Х., и др. Контроль виремии (наличия вируса в крови) и профилактика клинического ВИЧ в макаках-резус цитокиновой, усиленной ДНК, вакцинацией. Наука. 290, 486-92 (2000).

7. Блекман М.Дж., Хейдерик Х.Г., Доначи С., МакБрайд Дж.С. и Холдер А.А. Отдельный фрагмент поверхностного белка мерозоита малярии остается на паразите во время захвата красной кровяной клетки и является целью антител, ингибирующих захват. Журнал экспериментальной медицины. 172Ж379 (1990).

8. Боджанг К.А., Миллиган П.Дж., Пиндер М., Вигнерон Л., Аллоуче А., Кестер К.Е., Баллоу В.Р., Конвей Д.Дж., Риис В.Х., Готар П., Яаммуах Л., Делчасмбер М., Восс Г., Гринвуд В.М., Хилл А., Мак Адам К.Р., Торниепорт Н., Кохен Дж.Д., Дохерти Т. Команда испытания вакцины RTS,S против малярии. Эффективность RTS,S/AS03 вакцины против малярии против инфекции Plasmodium falciparum в полуиммунных взрослых мужчинах в Гамбии: рандомизированное испытание. Ланцет 358: 1927-34 (2001).

9. Бразолот Милан КЛ., Виратна Р., Крег А.М., Сигрист С.А., Дейвис Х.Л. ДНК CpG может индуцировать сильные гуморальные и клеточные иммунные отклики Th1 против поверхностного антигена гепатита В в молодых мышах. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15553-8 (1998).

10. Бернс Дж.М., Делай Т.М., Вайдия А.В. и Лонг СА. 3'порция гена поверхностного антигена мерозоита Plasmodium yoelii кодирует эпитоп, распознаваемый защитным моноклинальным антителом. Proc Natl Acad Sci USA 5:602 (1988).

11. Каларота С. и др. Клеточный цитотоксический отклик, индуцируемый вакцинацией ДНК в зараженных ВИЧ-1 пациентах. Ланцет 351:1320-25 (1998).

12. Чанг С.П., Кейс С.Е., Госнелл В.Л., Хашимото А., Крамер К.Дж., Тем Л.К., Хаширо К.К., Никайдо С.М., Гибсон Х.Л., Ли НГ С.Т, Барр П.Дж., Йокота В.Т., и Хат Г.С. Рекомбинантный бациловирус в 42-килодалтон С-терминального фрагмента поверхностного белка 1 мерозоита Plasmodium falciparum защищает обезьян Aotus против малярии. Infect. Immun. 64:253 (1996).

13. Чароенвит Й., Лиф М.Л., Яан Л.Ф., Седегах М. и Бодуа Р.Л. Характеристика моноклинальных антител Plasmodium yoelii, направленная против специфичных к стадии антигена спорозоитов. Infect. Immun. 55: 604 (1987).

14. Чароенвит Й., Коллинз В.Е., Джонс Т.Р., Миллет П., Яан Л., Кемпбелл Г.Х, Бодуа РЛ., Бродерсон Дж.Р. и Хоффман. Неспособность малярийной вакцины индуцировать антитела на защитный эпитоп в рамках его последовательности. Наука. 251: 668 (1991).

15. Чароенвит Й., Меллоук С., Коул С., Бечара Р. и др. Plasmodium yoelii: 17-kD белок гепатитной и эритроцитовой стадии является мишенью ингибирующего моноклинального антитела. Exp Parasitol. 80: 419-429 (1995).

16. Чароенвит Й., Фалларм Маджам В., Коррадин Г.П. и др. Зависимая от Т клетки CD4⁺ и гамма-интерферона защита против малярии у мышей путем иммунизации линейным синтетическим пептидом из Plasmodium yoelii 17 килодалдон гепатоцитного эритроцитного белка. Infect. Immune. 67: 5604-5614 (1999).

17. Кларк Дж. Т., Доначи С., Ананд Р. и др. Гликопротеин 46063 kD от поверхностных мерозоитов Plasmodium falciparum. Молекулярная биохимия 32: 15-24 (1988).

18. Коллинз В.Е., Галланд Г.Г., Салливан Дж.С. и Моррис С.Л. Выбор различных штаммов Plasmodium falciparum для тестирования вакцин кровяной стадии в обезьянах Aotus Nancymai. Американский журнал тропической медицины 51: 224-232 (1994).

19. Коллинз В.Е., Пай Д, Крютер П.Е., Ванденберг К.Л. Галланд Г.Г., Шулзер А.Дж., Кемп Д.Дж., Эдвардз С.Дж, Коппель Р.Л., Салливан Дж.С., Моррис С.Л. и Андерс Р.Ф. Защитный иммунитет, индуцированный у обезьян с рекомбинантным обезьяньим мембранным антигеном 1 Plasmodium fragile. Американский журнал тропической медицины 51: 711-719 (1994).

20. Дали Т.М. и Лонг С.А. Рекомбинантный 15 килодалтон карбоксильно-терминальный фрагмент поверхностного белка 1 мерозоита Plasmodium yoelii 17 XL индуцирует защитный иммунный отклик у мышей. Infect. Immune. 61: 2462-2467 (1993).

21. Дейм Дж.Б., Вильямс Дж.Л., МакКатчер Т.Ф., Вебер Дж.Л., Виртц Р.А., Хокмейер В.Т., Маллой В.Л., Эейнс Дж.Д., Шнайдер И., Робертс Д. Структура гена, кодирующего иммунодоминантный поверхностный антиген на спорозоите паразита малярии человека Plasmodium falciparum. Наука. 225 (4662): 593-9 (1984).

22. Дауберсис П., Томас А.В., Миллет П, Брахими К., Лангерманс Дж.А., Олломо Б., БенМохамед Л., Слиерендрегт Б., Эллинг В., Ван Белкам А., Дубрейл Дж.Ф., Мейз Дж.Ф., Герин-Мэрчанд С., Кайфас С., Кохен Дж., Грас-Массе X., Друилхе П. и Мохаммед Л.Б. Защита от малярии Plasmodium falciparum в шимпанзе путем иммунизации консервированным предэритроцитным антигеном 3 печеночной стадии. Nat Med. 6: 1258-63 (2000).

23. Дейвис Х.Л., Веератна Р., Вальдшмит Т.Дж., Тигретт Л., Шорр Дж., Крейг AM., Вееранта Р. ДНК CpG является сильным усилителем специфического иммунитета в мышах, иммунизированных рекомбинантным поверхностным антигеном гепатита В. Журнал иммунологии. 160: 870-6 (1998).

24. Динз Дж.А. Защитные антигены кровяной фазы паразитов Plasmodium knowlesi. Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol. 307: 159-169 (1984).

25. Динз Дж.А., Найт А.М., Джин B.C., Вотерз А.П., Кохен С. и Митчелл Г.Х. Испытание вакцинации в резус-макаках с помощью малого, инвариантного, антигена мерозоита Plasmodium knowlesi 66 kD. Parasite Immunol. 10: 535-552 (1988).

26. Делплейс П., Бхатия А., Кагнарт М. и др. Белок р126: антиген паразитофорной вакуоли, связанный с выходом мерозоитов Plasmodium falciparum. Биология клетки 64: 215 (1987).

27. Дулан Д.Л., Седеган М., Хедстром Р.С., Хобарт Р., Чароенвит Й. и Хоффман С.Л. Вводящие в заблуждение генетические ограничения защиты против малярии с помощью иммунизации мильтигенной ДНК: иммунитет, зависимый от Т клетка CD8⁺, гамма-интерферона и оксида азота. Журнал экспериментальной медицины. 183: 1739-1746 (1996).

28. Дулан Д.Л., Хедстром Р.С., Роджерз В.О., Чароенвит Й., Роджерз М., де ла Вега П. и Хоффман С.Л. Идентификация и характеристика защитного гепатоцитоэритроцита гена белка 17 kD Plasmodium yoelii гомолога экспортированного белка 1 Plasmodium falciparum. Журнал биохимии. 271617861-17868 (1996).

29. Дулан Д.Л., Хоффман С.Л., Саузвуд С., Вентворз П.А., Сидней Дж., Чеснат Р.В., Кеогх Е., Апелла Е., Натман Т.Б., Лал А.А., Гордон Д.М., Олоо А. и Сете. Дегенеративные цитотоксические эпитопы Т клетки от Р.falciparum, ограниченные супертипами аллелей HLA-A и HLA-B. Иммунитет 7: 97-112 (1997).

30. Дулан Д.Л., Хедстром Р.С., Гарднер М.Дж., Седегах М., Ванг X., Грамзински Р.А., Маргалит М., Хобарт П. и Хофманн С.Л. Вакцинация ДНК как подход к контролю малярии: текущее состояние и стратегии. Curr Topic Microbiol Immunol 226: 37-56 (1998).

31. Дулан Д.Л., Хоффман С.Л. Клетки Il-12 и NK требуются антиген- специфического адаптивного иммунитета против малярии, инициированного Т клетками CD8⁺ в модели Plasmodium yoelii. Журнал иммунологии 164(2): 884-92 (1999).

32. Эган Дж.Е., Вебер Дж.Л., Баллой В.Р., Холлингдейл М.Р., Маджариан В.Р., Гордон Д.М., Маллой В.Л., Хоффман С.Л., Вирц Р.А., Шнейдер И., Вуллетт Г.Р., Янг Дж.Ф. и Хокмейер В.Т. Эффективность спорозоитных вакцин от мышиной малярии: подтекст для разработки вакцин для человека. Наука. 236: 453-456 (1987).

33. Эпштейн Дж., Горак Е., Чароенвит Й., Ванг Р., Фрейдберг Н., Осиново О., Ричи Т.Л., Штольц Е., Треспаласиос Ф., Нергес Дж., Нг Дж., Фалларме-Маджам В., Абот Э., Гох Л., Паркер С., Кумар С., Хедстром Р., Норманн Дж., Стаут Р., Хоффман С.Л. Безопасность, переносимость и отсутствие откликов антител после приема противомалярийной вакцины PƒCSP ДНК с помощью игловой и безыгловой инъекции, и сравнение внутримышечного и комбинированного внутримышечного/внутрикожного путей ввода. Генная терапия человека 13: 1551-60 (2002).

34. Этлингер Х.М., Касперс П., Матиль X., Шонкльд Х.Дж., Стубер Д. и Такас Б. Способность рекомбинантных или природных белков защищать обезьян от гетерологового вызова с помощью Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 59: 3498-3503 (1991).

35. Фриман P.P. и Холдер А.А. Характеристика защитного отклика мышей BALB/c, иммунизированных очищенным антигеном Plasmodium yoelii schizont. Clin. Exp. Immunol.

54: 609-616 (1983).

36. Гордон Д.М., МакГоверн Т.В., Кржич У., Кохен Дж.С., Шнайдер И., ЛаШанс Р., Хеппнер Д.Г., Йан Г., Холлингдейл М., Слаою М. и др. Безопасность, иммуногенетичность и эффективность рекомбинантно произведенной вакцины циркумспорозоита Plasmodium falciparum поверхностного антигена гепатита В. Журнал инфекционных заболеваний 171: 1576-85 (1995).

37. Грамзински Р.А., Марис Д.С., Дулан Д., Чароенвит Й., Обалдия Н., Россан Р., Седегах М. Ванг Р. Хобарт П., Маргалит М. и Хоффман С. Малярийные вакцины ДНК в обезьянах Aotus. Vaccine. 15: 913-915 (1997).

38. Гурунатан С., Bу С.И., Фрейдаг Б.Л. & Седер Р.А. Вакцины ДНК: ключ к индуцированию долговременного целлюлярного иммунитета. Curr Opin Immunol. 12, 442-7 (2000).

39. Харниутанакорн П., МакБрайд Дж.С., Доначи С., Хейдрич Х.Г., Ридли Р.Г. Ингибиторные моноклональные антитела распознают эпитопы, примыкающие к протеолитовым местам дробления клеток на белке RAP-1 Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 55: 177-86 (1992).

40. Хедстром Р., Дулан Д., Ванг Р. и др. Экспрессия in vitro и in vivo иммуногенетичности вакцин ДНК предэритроцитной стадии Plasmodium falciparum. Int J Molec med. 2: 29-38 (1998).

41. Херрингтон Д., Дейвис Дж., Нардин Е., Бейер М., Кортез Дж. Едди X., Лосонски Г., Холлингдейл М., Штейн М., Левин М., Нуссензвейг Р.С., Клайд Д. и Эделман Р. Успешная иммунизация людей облученными спорозоитами: гуморальные и клеточные отклики защищенных индивидуумов. Американский журнал гигиены тропической медицины. 45: 539-547 (1991).

42. Хилгерз Л.А., Сниппе X., Джансзе М., Виллерз Дж.М. Синергетический эффект синтетических адъювантов на гуморальный иммунный отклик. Int Arch Allergy Appl Immunol. 79: 392-6 (1986).

43. Хилгерз Л.А., Сниппе X., Джансзе М., Виллерз Дж.М. Синтетические сульфолипополисахариды: новые адъюванты для гуморальных иммунооткликов. Иммунология. 60: 141-6 (1987).

44. Хилл А.В.С., Элвин Дж., Виллис А.С. и др. Молекулярный анализ ассоциации HLA-В53 и сопротивляемости тяжелой малярии. Природа 360: 434 (1992).

45. Хоффман С.Л. и Дулан Д.Л. Малярийные вакцины - нацеленность на инфицированные гепатоциты. Nature med. 6: 1218-19 (2000).

46. Холдер А.А. и Фриман P.P. Иммунизация против родентной малярии кровяной стадии с использованием очищенных антигенов паразитов. Природа 294: 361-364 (1981).

47. Хорн Н.А., Мик Дж.А., Будахазие Г., Маркет М. Генная терапия рака с использованием плазмида ДНК для клинических испытаний на человеке. Генная терапия человека 6(5): 565-73 (1995).

48. Инселбург Дж., Бзик Д.Дж., Ли В.Г., Грин К.М., Кансопон Дж., Хахм В.К., Батурст И.С., Барр П.Дж. и Россан Р.Н. Защитный иммунитет, индуцированный в обезьянах Aotus рекомбинантными белками SERA Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 59: 1247-150 (1991).

49. Инселбург Дж., Батурст И.С., Кансопон Дж., Барчфельд П.Дж. и Россан Р.Н. Защитный иммунитет, индуцированный в обезьянах Aotus рекомбинантным белком SERA Plasmodium falciparum: адъювантные эффекты на индуцирование защитного иммунитета. Infect. Immun. 61: 2041-2047 (1993).

50. Кедизрски Л., Блек С.Г. и Коппель Р.Л. Иммунизация рекомбинантным поверхностным протеином мерозоита Plasmodium yoelii 4/5 защищает мышей от опасности летального исхода. Infect. Immun. 68: 6034-7.

51. Кензил С.Р., Пател У. Ленник М., Марциани Д. Выделение и характеризация сапонинов с помощью адъювантной активности от кортекса Quillajasaponaria Molina. Журнал иммунологии. 146: 431-7 (1991).

52. Кензил С.Р. Сапонины как адъюванты вакцин. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst., 12: 1-55 (1996).

53. Кестер К.Е., МакКини Д.А., Торнипорт Н., Окенхауз С.Ф., Хеппнер Д.Г., Холл Т., Крзич У., Делчамбр М., Восс Г., Доулер М.Г., Паленски Дж., Виттес Дж., Кохен Дж., Баллоу В.Р. Группа оценки малярийной вакцины RTS,S. Эффективность режимов вакцины рекомбинантного белка циркумспорозоита от экспериментальной малярии Plasmodium falciparum.J Infect Dis 183 (4): 640-7 (2001).

54. Кестер К.Е. и др. Эффективность режимов вакцины рекомбинантного белка циркумспорозоита против экспериментальной малярии Plasmodium falciparum. J Infect Dis 183 (4): 640-47 (2001).

55. Хусмит С., Чароенвит Й., Кумар С., Седегах М., Бодуа Р.Л. и Хоффман С.Л. Защита от малярии путем вакцинации поверхностным белком 2 спорозоита плюс белком CS. Science 252: 715-718 (1991).

56. Хусмит С., Седегах М. и Хоффман С.Л. Полная защита от Plasmodium yoelii путем адоптивного трансфера клона цитотоксической Т клетки CD8⁺ распознающего поверхностный белок 2 спорозоита. Infect. Immun. 62: 2979-2983 91994).

57. Крайг А.М., Йи А.К., Матсон С., Валдшмит Т.Дж., Бишоп Г.А., Тисдейл Р., Корецки Г.А., Клинман Д.М. Мотивы CpG в бактериальной ДНК запускают прямую активацию В-клетки. Природа. 374-546-9 (1995).

58. Кумар С., Яадава А., Кейстер Д.В., Тиан Дж.Х., Охл М., Пердю Гринфилд К.А., Миллер Л.Х. и Каслов Д.С. Иммуногенетичность и эффективность in vivo рекомбинантного поверхностного белка-1 мерозоита Plasmodium falciparum в обезьянах Aotus. Mol. Med. 1: 325-332 (1995).

59. Кумар С., Коллинз В., Эган А., Яадава А., Гаррауд О., Блекман М.Дж., Патино Дж.А., Диггз С., Каслов Д.С. Иммуногенетичность и эффективность в обезьянах Aotus четырех рекомбинантных вакцин Plasmodium falciparum в многоадъювантных составах, основанных на 19-килодалтон С терминале поверхностного белка 1 мерозоита. Infect. Immun. 68-2215-2223 (2000).

60. Локейл-Дюбуа М. и Вагнер X. Обзор биологической и фармакологической активности сапонинов. Фитомедицина 2:363-386 (1996).

61. Лалвани А., Морис П., Восс Г., Патан А. и др. Потентная индукция фокусированных клеточных и гуморальных откликов типа Тh1 с помощью RTS,S/SBAS2, рекомбинантной малярийной вакцины Plasmodium falciparum. Журнал инфекционных заболеваний 180: 1656-64 (1999).

62. Ле Т., Кунан К., Хедстром Р. и др. Безопасность, переносимость и гуморальные иммунные отклики после внутримышечного введения малярийной вакцины ДНК здоровым взрослым добровольцам. Вакцина 18: 1893-1901 (2000).

63. Ли А.И. и др. Количественное определение числа цитотоксических Т клеток, специфических для иммунодоминантного специфического к HCV эпитопа ЦТЛ, примированного иммунизацией ДНК. Вакцина 18: 1962-68 (2000).

64. Люк С Дж., Карнер К., Лианг X., Барбур А.Г. Основанная на ospA вакцина ДНК защищает мышей от инфекции Borrelia burgdorferi. J Inf Dis 175: 191-7 (1997).

65. Маджарян В.Р., Дали Т.М. и др. Пассивная иммунизация против малярии у мышей с помощью моноклонального антитела IgG3. J Immunol 132: 3131 (1984).

66. Малик А., Эган Дж.Е., Хоугтен Р.А., Садофф Дж.С. и Хоффман С.Л. Цитотоксические Т лимфоциты человека против белка циркумспорозоита Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3300-3304 (1991).

67. Мартин Т., Паркер С.Е., Хедстром Р. и др. Малярийная вакцина плазмида ДНК: потенциал для геномной интеграции после внутримышечной инъекции. Human Gen Ther 10: 759-68 (1999).

68. МакКлукси М.Дж., Дейвис Х.Л. CPG ДНК является потентным усилителем системных и слизистых иммунных откликов на поверхностный антиген гепатита В при внутриносовом введении мышам. Журнал иммунологии. 161: 4463-6 (1998).

69. Морено А., Клавиджо П., Эделман Р., Дейвис Дж., Сзтейн М., Херрингтон Д. и Нардин. Цитотоксические Т клетки CD4⁺ от иммунизированного спорозоитами добровольца распознают белок CS Plasmodium falciparum. Int. Immunol. 3: 997-1003 (1991).

70. Мосманн Т.Р. и Коффман Р.Л. Клетки ТН1 и ТН2: различные картины секреции лимфокина приводят к различным функциональным свойствам. Годовой обзор иммунологии. 7: 145-173 (1989).

71. Мусти А.М., Зехнер 3., Бостиан К.А., Патресон Б.М. и Крамер Р.А. Транскрипционное картирование двух генов дрожжей, кодирующих глицералдегид 3-фосфат дигидрогеназу, изолированную гомологической последовательностью с геном цыпленка. Ген 25: 133-143 (1983).

72. Уврей С., Боухарун Таюн X., Грас Массе X. и др. Поверхностный белок 3-мерозоита: белок малярии, индуцирующий антитела, которые способствуют убиванию Plasmodium falciparum путем кооперации с моноцитами крови. Кровь 84: 1594 (1994).

73. Уврей С., Боухарун Таюн X., Грас Массе X. и др. Новый поверхностный антиген мерозоита Plasmodium falciparum, идентифицированный антигенностью кооперативного механизма клеточного антитела и биологической активностью антител. Mem Inst Oswaldo Cruz. Дополнение 2: 77 (1994).

74. Панина-Бордигнон П., Тан А., Термиджтелен А., Демоц С., Коррадин Г., Ланзавечия А. Универсально иммуногенетичные эпитопы Т клетки: смешанное связывание с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса II и смешанное распознавание Т клетками. Eur J Immunol 12: 2237-42 (1989).

75. Паркер С.Е., Бореллини Ф., Венк М.Л., и др. Плазмид малярийной вакцины ДНК: распределение тканей и исследование безопасности на мышах и кроликах. Human Gen Ther 10 (5): 741-58 (1999).

76. Перин Л.Х., Дайал Р. и Райдер X. Характеристика антигенов от эритроцитных стадий Plasmodium falciparum, вступающих в реакцию с иммунными сыворотками человека. Trans. R.Soc. Trop. Med. Hyg. 75: 163-165 (1981).

77. Перин Л.Х., Рамирез Е., Ламберт П.Х. и Миесчер П.А. Ингибирование роста Plasmodium falciparum в эритроцитах человека с помощью моноклональных антител. Природа. 289: 301-303 (1981).

78. Поточнияк П., Йошида Н., Нуссензвейг Р.С. и Нуссензвейг В. Моновалентные фрагменты (Fab) моноклональных антител на поверхностный антиген спорозоита (Рb44) защищают мышей от малярийной инфекции. Журнал экспериментальной медицины 151: 1504-1513 (1980).

79. Белки - структура и молекулярные свойства, 2-ое издание, Т.Е.Крейгтон, В.X. Фриман и компания, Нью-Йорк, 1993.

80. Рамазами Р. Исследования гликопротеинов в паразите малярии человека Plasmodium falciparum - свойства связывания лектина и возможные карбогидратно-протеиновые связи. Immunol Cell Biol 65: 147 (1987).

81. Рамазами Р.Дж., Джонз Г., Лорд Р. Характеристика эпитопа, определенного ингибиторным моноклональным антителом на антиген кандидат на малярийную вакцину. Immunol Lett 23: 305 (1990).

82. Раттан и др. Синтез белков: пост-трансляционные модификации и старение. Ann NY Acad Sci 663: 48-62 (1992).

83. Фармацевтические науки Ремингтона, 18 издание (А.Геннаро, редактор; Мак Паб, Истон, Пенсильвания, 1990).

84. Ридли Р.Г., Такас Б., Етлинегр X., Скайф Дж.Г. Рофтри антиген Plasmodium falciparum имеет защитную реакцию в беличьих обезьянах (саймири). Паразитология 101: 187-92 (1990).

85. Родригес М.М., Кордей А.-С., Арреаза Г., Коррадин Г., Ромеро П., Мариянски Дж.Л., Нуссензвейг Р.С. и Завала Ф. Цитолитические клоны Т клетки CD8⁺,полученные от белка циркумспорозоита Plasmodium yoelii, защищают против малярии. Int. Immunol 3: 579-585 (1991).

86. Роджерз В.О. и др. Многоэтапная мультиантигенная гетерогенная примирующая и стимулирующая вакцина от малярии Plasmodium knowlesi обеспечивает частичную защиту в макаках-резус. Infect Immun 69: 5565-72 (2001).

87. Ромеро П., Мариянски Дж. Л., Коррадин Г., Нуссензвейг В. и Завала Ф. Клонированные цитотоксические Т клетки распознают эпитоп в белке циркумспорозоита и защищают против малярии. Природа 341: 323-325 (1989).

88. Саул А., Лорд Р., Джоунз Г.Л. и др. Защитная иммунизация инвариантными пептидами антигена MSA2 Plasmodium falciparum. J Immunol 148: 208 (1992).

89. Шофилд Л., Бушелл Г.Р., Купер Дж.А. и др. Рофтри антиген Plasmodium falciparum содержит сохраненные и разнообразные эпитопы, распознаваемые ингибиторными моноклинальными антителами. Mol Biochem Parasitol. 18: 183-95 (1986).

90. Шофилд Л., Виллакиран Дж., Ферейра А. и др. Гамма-интерферон, Т клетки

CD8⁺ и антитела, необходимые для иммунитета к спорозоитам малярии. Природа 330: 664-666 (1987).

91. Седегах М. и др. Улучшение защитного иммунитета, индуцированного иммунизацией с основой на ДНК: примирование антигеном и кодирующим GM-CSF плазмидом ДНК и стимулирование производящим экспрессию антигена рекомбинантным вирусом оспы. J Immunol 164: 5905-12 (2000).

92. Седер Р.А. и Хилл А.В. Вакцины против внутриклеточных инфекций, требующие клеточного иммунитета. Природа 406, 793-8 (2000).

93. Сегуин М.С., Клотз Ф.В., Шнайдер И., Вейр Дж.П., Гудбари М., Слейтер М. и др. Индуцирование синтазы окиси азота защищает от малярии мышей, подвергнутых воздействию облученных инфицированных Plasmodium berghei комаров: участие гамма-интерферона и Т клеток CD8⁺. J Exp Med 180: 353-358 (1994).

94. Сейфтер и др. Анализ модификаций белка и небелковых кофакторов. Meth Enzymol 182: 626-646 (1990).

95. Ши Й.П., Сайд У., Квари С.Х., Робертс Дж.М., Удхаякумар В., Олоо А.Дж., Хаулей В.А., Каслов Д.С., Нахлен Б.Л. и Лал А.А. Природный иммунный отклик на С-терминальную 19-килодалтоновую область поверхностного белка 1 мерозоита Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 64: 2716-2723 (1996).

96. Сиддикви В.А., Там Л.К., Крамер К.Дж., Хуи Г.С., Кейс С.Е., Ямага К.М., Чанг С.П., Чан Е.Б. и Канн С.К. Поверхностный пленочный белок предшественник мерозоита полностью защищает обезьян Aotus от малярии Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3014-3018 (1987).

97. Сим БКЛ., Орланди П.А., Хейнз Дж.Д. и др. Первичная структура антигена, связывающего эритроцит 175К Plasmodium falciparum и идентификация пептида, который выявляет антитела, которые ингибируют инвазию мерозоитов малярии. J Cell Biol III: 1877 (1990).

98. Сим БКЛ., Читнис С.Е., Дил С.Д. и др. Plasmodium falciparum: дальнейшая характеристика функционально активной зоны лиганда мерозоита. ЕВА-175 78: 259 (1994).

99. Стаут Дж.А., Слауи Д.Г., Хеппнер Д.Г. и др. Предварительная оценка рекомбинантной вакцины белка циркумспорозоита против малярии Plasmodium falciparum. N Eng J Med 336: 86-91 (1997).

100. Стаут Дж.А., Кестер К.Е., Крзич У. и др. Долговременная эффективность и иммунные отклики после иммунизации малярийной вакциной RTS,S. J Infect Dis 178: 1139-44 (1998).

101. Томас А.В., Трейп Дж.Ф., Роджер С., Гонкалвес А., Росарио В.Е., Нарум Д.Л. Высокое преобладание природных антител против мембранного обезьяньего антигена 83 килодальтон Plasmodium falciparum, (РF83/АМА-1)детектированного захватным, связанным с ферментами, иммуносорбентным анализом с использованием полный рекомбинантный бациловирус PF83/AMA-1. Am J Trap Med Hyg 51: 730-40 (1994).

102. Томас А.В., Нарум Д., Вотерз А.П., Трейп Дж.Ф., Роджер С., Гонкалвес А., Розарио В., Друилхи П., Митчелл Г.Х. Денис Д. Аспекты иммунитета для семейства АМА-1 молекул у человека и приматов, заряженных малярией. Mem Inst Oswaldo Crus 89 дополнение 2: 67-70 (1994).

103. Валензуэла П., Грей П., Куирога М. и др. Нуклеотидные последовательности кодирования генов для мажорного белка поверхностного антигена вируса гепатита В. Природа. 280: 815-819 (1979).

104. Ванг Р., Чароенвит Й., Коррадин Г., де ла Вега П., Франке Е.Д. и Хоффман С.Л. Защита от малярии индуцированием Т клетки CD4⁺ линейным пептидом 2 поверхностного белка спорозоита Plasmodium yoelii и зависимым от IFN-гамма удалением инфицированных гепатоцитов. Журнал иммунологии. 157: 4061-4067 (1996).

105. Ванг Р., Дулан Д.Л., Ле Т.П., Хедстром Р.С., Кунан К.М., Чароенвит Й., Джонс Т.Р., Хобарт П., Маргалит М., Нг Дж., Вейсс В.Р., Седегах М., де Трайсне С., Норманн Дж.А. и Хоффман С.Л. Индуцирование антиген-специфичных цитотоксических Т лимфоцитов в человеке с помощью малярийной вакцины ДНК. Наука. 282: 476-480 (1998).

106. Ванг Р., Дулан Д.Л., Чароенвит Й., Хедстром Р.С., Гарднер М Дж., Хобарт П., Тайн Дж., Седегах М., Фалларм В., Саци Дж.В. младший. Каур М., Клинман Д.М., Хоффман С.Л., Вейсс В.Р. Одновременное индуцирование множественных антиген-специфичных цитотоксических лимфоцитов у приматов путем иммунизации смесью четырех плазмидов ДНК Plasmodium falciparum 66: 4193-202 (1998).

107. Ванг Р., Эпштейн Дж., Барацерос Ф.М., Горак Е.Дж., Чароенвит Й., Каруччи Д.Дж., Хедстром Р.С., Рахарджо Н., Гей Т., Хобарт П., Стаут Р., Джонс Т.Р., Ричи Т.Л., Паркер С.Е., Дулан Д.Л., Норманн Дж., Хоффман С.Л. Индуцирование зависимых от Т клетки CD4⁺ откликов CD8⁺ типа 1 у человека с помощью малярийной вакцины ДНК. PNAS-USA 98(19): 10817-22 (2001).

108. Вейсс В.Р., Седегах М., Бодуан Р.Л., Миллер Л.Х., Гуд М.Ф. Т клетки CD8⁺ (цитотоксические/супрессоры) необходимы для защиты мышей, иммунизированных спорозоитами малярии. PNAS-USA 85(2): 573-6 (1988).

109. Вейсс В.Р., Берзофски Дж.А., Хаугтен Р.А., Седегах М., Холлиндейл М., Хоффман С.Л. Клон Т клетки, направленный на белок циркумспорозоита, который защищает мышей как от Plasmodium yoelii, так и Plasmodium berghei. J Immunol 15; 149(6): 2103-9 (1992).

110. Отчет ВОЗ. Состояние мировых вакцин и иммунизации. Женева: Всемирная организация здравоохранения (1996).

111. Визел Б., Роджерз В.О., Хайгтен Р.А., Ланар Д.Е., Тайн Дж.А. и Хоффман С.Л. Индуцирование мышиных цитотоксических Т лимфоцитов против поверхностного белка 2 спорозоита Plasmodium falciparum. Европейский журнал иммунологии. 2461487-1495 (1994).

112. Визел Б., Хаугхтен Р., Черч П., Тайн Дж.А., Ланар Д.Е., Гордон Д.М., Баллоу В.Р., Сетт А. и Хоффман С.Л. Ограниченные HLA-A2 цитотоксические отклики Т лимфоцита на множественные эпитопы поверхностного белка 2 спорозоита Plasmodium falciparum в иммунизированных спорозоитами добровольцах. Журнал Иммунологии. 155: 766-775 (1995).

113. Волд Ф. Пост-трансляционные модификации белка: перспективы и прогнозы, 1-12, в пост-трансляционных ковалентных модификациях белков. Б.С. Джонсон; издание Академик Пресс, Нью-Йорк. 1983.

114. Янг С., Коллинз В.Е., Салливан Дж.С. и др. Частичная защита от инфекции Plasmodium vivax на кровяной стадии в обезьянах саймири путем иммунизации рекомбинантным С-терминальным фрагментом поверхностного белка 1 мерозоита в блок кополимерном адъюванте. Infect Imm 67: 342 (1999).

115. Микробиология Зинссер 1180-83 (Волфганг К. Джоклик, Хилда П., Виллетт Д., Бернард Амос и Катрин М. Вилферт, 20 издание, Эплтон и Ландж 1992).

Другие примеры осуществления изобретения будут очевидны специалистам в данной области из рассмотрения спецификации и практики использования раскрытого в ней изобретения. Предполагается, что спецификация и примеры будут рассматриваться только в качестве примеров, при том, что подлинный объем и дух изобретения указывается в следующей формуле.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Способ по изобретению включает примирование антималярийного иммунного отклика с помощью вакцины, основанной на ДНК, и стимулирование этого отклика с помощью вакцины на белковой основе. Описана вакцина, включающая, в качестве отдельных компонентов, примирующий состав, включающий, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один первый малярийный антиген, и стимулирующий состав, состоящий из, по крайней мере, одного полипептида, дополнительно включающего, по крайней мере, один второй малярийный антиген. Раскрыт набор для иммунизации человека против вызывающего малярию патогена. Изобретение позволяет расширить получаемый иммунный отклик с помощью повторной иммунизации (стимулирования) вакциной на белковой основе. 4 н. и 40 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл.

1. Способ иммунизации человека против вызывающего малярию патогена, включающий:
а) примирование иммунного отклика в человеке путем введения примирующей вакцины, включающей, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один первый малярийный антиген с помощью примирующей дозы, эффективной для установления отклика; и
б) стимулирование примированного иммунного отклика в человеке путем последующего введения стимулирующей вакцины, включающей, по крайней мере, один полипептид, который включает, по крайней мере, один второй антиген малярии, имеющий, по крайней мере, один общий эпитоп, по крайней мере, с одним первым антигеном малярии с помощью стимулирующей дозы, эффективной для стимулирования примированного иммунного отклика,
отличающийся тем, что введение примирующей вакцины примирует Т клетки CD8⁺, а введение стимулирующей вакцины вызывает вторичный отклик Т клеток CD8⁺, расширяет отклик примированной Т клетки CD8⁺ и приводит к генерации антималярийных Т клеток CD8⁺, антималярийных Т клеток CD4⁺ и антималярийных антител.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что второй малярийный антиген включает весь или часть первого малярийного антигена.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что примирующая доза составляет между 0,01 мкг и 50 мг.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что примирующая доза составляет 2500 мкг.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что примирующая доза вводится между одним и 5 разами перед введением второй вакцины.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет между 1 мкг и 100 мкг.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет 50 мкг.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет 25 мкг.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что примирующая вакцина вводится способом, выбранным из внутримышечного введения, внутривенного, внутрикожного, подкожного, слизистого, с помощью рекомбинантной бактерии, рекомбинантного вируса или генной пушки, или их комбинации.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина вводится способом, выбранным из внутримышечного введения, внутривенного, внутрикожного, подкожного, слизистого, с помощью рекомбинантной бактерии, рекомбинантного вируса или генной пушки, или их комбинации.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что Т клетки CD8⁺ включают цитотоксические Т лимфоциты.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что первый малярийный антиген включает, по крайней мере, фрагмент полипептида циркумспорозоита.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что второй малярийный антиген включает, по крайней мере, фрагмент полипептида циркумспорозоита.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает PƒCSP.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает RTS,S.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что первый малярийный антиген включает практически весь белок циркумспорозоита, и второй малярийный антиген включает RTS,S.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что вызывающим малярию патогеном является P.falciparum.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий практически весь белок CS или его фрагмент в примирующей дозе, эффективной для установления иммунного отклика; и стимулирующая вакцина включает, по крайней мере, один полипептид, включающий практически весь белок CS или его фрагмент в стимулирующей дозе, эффективной для стимулирования примированного иммунного отклика.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает PƒCSP.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает гибридный белок, включающий практически всю С-терминальную часть белка CS, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной зоны и поверхностный антиген от вируса гепатита В (HBsAg).

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает RTS,S и индуцирующий Th1 адъювант.

22. Способ по п.18, отличающийся тем, примирующая доза составляет между 0,01 мкг и 50 мг.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что примирующая доза составляет 2500 мкг.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что примирующая доза вводится между одним и 5 разами перед введением второй вакцины.

25. Способ по п.18, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет между 1 мкг и 100 мкг.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет 50 мкг.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что стимулирующая доза составляет 25 мкг.

28. Способ по п.18, отличающийся тем, что примирующая вакцина вводится способом, выбранным из внутримышечного введения, внутривенного, внутрикожного, подкожного, слизистого, с помощью рекомбинантной бактерии, рекомбинантного вируса или генной пушки, или их комбинации.

29. Способ по п.18, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина вводится способом, выбранным из внутримышечного введения, внутривенного, внутрикожного, подкожного, слизистого, с помощью рекомбинантной бактерии, рекомбинантного вируса или генной пушки, или их комбинации.

30. Вакцина для использования в способе по п.1 для иммунизации человека против вызывающего малярию патогена, включающая, в качестве отдельных компонентов, примирующий состав, включающий, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий, по крайней мере, один первый малярийный антиген, и стимулирующий состав, состоящий из, по крайней мере, одного полипептида, дополнительно включающего, по крайней мере, один второй малярийный антиген, отличающаяся тем, что введение примирующего состава примирует Т клетки CD8⁺, и последующее введение стимулирующего состава вызывает вторичный отклик примированных Т клеток CD8⁺, расширяет отклик примированных Т клеток CD8⁺ и приводит к генерации антималярийных Т клеток CD8⁺, антималярийных Т клеток CD4⁺ и антималярийных антител.

31. Вакцина по п.30, отличающаяся тем, что полинуклеотид кодирует практически весь белок циркумспорозоита.

32. Вакцина по п.30, отличающаяся тем, что примирующий состав включает PƒCSP и стимулирующий состав включает RTS,S.

33. Вакцина по п.30, отличающаяся тем, что состав, включающий RTS,S, дополнительно включает адъювант.

34. Набор для иммунизации человека против вызывающего малярию патогена, включающий:
а) примирующую вакцину, включающую, по крайней мере, один полинуклеоитд, кодирующий, по крайней мере, один первый малярийный антиген; и
б) стимулирующую вакцину, состоящую из, по крайней мере, одного полипептида, дополнительно включающего, по крайней мере, один второй малярийный антиген, имеющий, по крайней мере, один общий эпитоп с, по крайней мере, одним первым малярийным антигеном,
отличающийся тем, что введение примирующей вакцины примирует Т клетки CD8⁺, а введение стимулирующей вакцины вызывает вторичный отклик примированных Т клеток CD8⁺, расширяет примированный отклик Т клетки CD8⁺ и приводит к генерации антималярийных Т клеток CD8⁺, антималярийных Т клеток CD4⁺ и антималярийных антител.

35. Набор по п.34, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает PƒCSP.

36. Набор по п.34, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает вакцину RTS,S.

37. Набор по п.34, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий практически весь белок CS или его фрагмент; а стимулирующая вакцина включает, по крайней мере, один полипептид, включающий практически весь белок CS или его фрагмент.

38. Набор по п.37, отличающийся тем, что примирующая вакцина включает PƒCSP.

39. Набор по п.37, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает гибридный белок, включающий практически всю С-терминальную часть белка CS, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной зоны и поверхностный антиген от вируса гепатита В (HBsAg).

40. Набор по п.39, отличающийся тем, что стимулирующая вакцина включает RTS,S и индуцирующий Th1 адъювант.

41. Вакцина для иммунизации человека против вызывающего малярию патогена, включающая в качестве отдельных компонентов примирующий состав, включающий, по крайней мере, один полинуклеотид, кодирующий практически весь белок CS или его фрагмент, и стимулирующий состав, включающий, по крайней мере, один полипептид, включающий практически весь белок CS или его фрагмент, отличающаяся тем, что введение примирующего состава примирует Т клетки CD8⁺, и последующее введение стимулирующего состава вызывает вторичный отклик примированных Т клеток CD8⁺, расширяет отклик примированных Т клеток CD8⁺ и приводит к генерации антималярийных Т клеток CD8⁺, антималярийных Т клеток CD4⁺ и антималярийных антител.

42. Вакцина по п.41, отличающаяся тем, что примирующий состав включает PƒCSP.

43. Вакцина по п.41, отличающаяся тем, что стимулирующий состав включает гибридный белок, включающий практически всю С-терминальную часть белка CS, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной зоны и поверхностный антиген от вируса гепатита В (HBsAg).

44. Вакцина по п.43, отличающаяся тем, что стимулирующий состав включает RTS,S и индуцирующий Th1 адъювант.